Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

당사의 프로토콜은 살아있는 쥐의 기계적 스트레스에 대한 신경 반응을 시각화하는 방법을 제공하며, 이는 외상성 뇌 손상이 뇌에 미치는 영향에 대한 직접적인 증거를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 외상성 뇌 손상 후 급성 및 만성 단계 모두에 대해 동일한 동물의 동일한 뇌 위치에서 표적 단백질을 모니터링할 수 있습니다. 관심 유전자와 바이러스 프로모터는 뇌의 특정 세포 유형에 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 그에 따라 변경될 수 있습니다.

시작하려면 마취된 쥐의 눈에 안과 연고를 바르십시오. 일반 가위로 다듬어 머리 꼭대기의 머리카락을 제거하십시오. 12-15mm 길이의 정중선을 절개한 후 구부러진 팁 스프링 가위를 사용하여 두개골의 좌우 반구의 피부를 절제합니다.

두개골이 노출되면 멸균 면 팁 어플리케이터로 부드럽게 문질러 골막을 제거하고 멸균 식염수로 씻어냅니다. 두개골 부위가 건조되면 외상성 뇌 손상(TBI) 충격 부위를 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 시상 봉합사에서 측면 2mm 좌표에 표시합니다. 입체 프레임 프레임에서 마우스를 빠르게 제거하고 TBI 장치 아래의 완충 쿠션에 헤드를 놓습니다.

임팩터 팁을 표시된 충격 부위에 맞춥니다. 묶인 나일론 끈을 마우스 머리 위로 15cm 당겨 금속 기둥을 들어 올린 다음 풀어 TBI 부위의 두개골 상단과 접촉하는 변환기 막대에 무게가 자유롭게 떨어지도록 합니다. 마취된 쥐의 머리를 수술용 현미경 아래에 보관된 입체 프레임에 놓습니다.

FG4 카바이드 비트를 사용하여 낮은 로터 속도로 두개골 표면을 부드럽고 천천히 뚫어 남아 있는 골막을 제거하고 치과용 시멘트가 두개골과 단단히 결합되도록 거친 두개골 표면을 만듭니다. 식염수를 사용하여 두개골 표면에서 뼛가루를 씻어내고 제거합니다. 두개골에서 외측 근육을 분리하려면 두정과 측두골을 연결하는 봉합사가 있는 눈 뒤쪽 약 5mm에서 미세한 닫힌 팁을 부드럽게 삽입하고 닫힌 팁을 양털 봉합사가 될 때까지 뒤쪽 방향으로 부드럽게 움직입니다.

두개창 이식이 이루어지는 쪽의 측면 근육을 분리합니다. 식염수를 사용하여 수술 부위의 이물질을 씻어내고 거즈로 해당 부위를 말립니다. 헤드 포스트를 이식하려면 마커 펜과 수술용 캘리퍼스를 사용하여 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 반구의 시상 봉합사에서 1.5mm 떨어진 곳에 중심점을 표시합니다.

그런 다음 깨끗하고 건조한 두개골의 개두술 둘레를 추적합니다. 이어 바를 풀고 머리를 돌려 개두면이 완벽하게 수평이 되도록 한 다음 이어 바를 다시 조입니다. 면봉 어플리케이터의 나무 막대기를 사용하여 헤드 포스트의 앞면과 뒷면 가장자리에 초강력 접착제 두 방울을 떨어뜨립니다.

티타늄 헤드 포스트를 개두술의 중앙 위에 놓고 두개골 창이 이식될 동일한 평면 내에 놓이도록 빠르게 조정합니다. 초강력 접착제가 마를 때까지 가벼운 압력을 가하면 일반적으로 약 30초가 걸립니다. 예냉식 세라믹 접시에 시멘트 분말 300mg, QuickBase 액체 6방울, 촉매 1방울을 완전히 혼합하여 치과용 시멘트를 준비합니다.

넉넉한 양의 치과용 시멘트 혼합물을 추적된 둘레의 바깥쪽 둘레에 빠르게 바르고 노출된 뼈 표면을 덮습니다. 그러나 개두술 부위를 덮지 마십시오. 이어 바를 풀고 헤드 포스트를 금속 프레임에 고정하여 헤드가 표시된 개두술 둘레를 따라 정밀한 드릴링을 위해 안정적인지 확인합니다.

개두술을 수행하려면 수술용 캘리퍼스를 사용하여 앞에서 설명한 대로 표시된 원의 직경을 확인하고 필요에 따라 조정하여 두개골 창이 개두술 내부에 꼭 맞도록 합니다. 전기 치과 드릴을 사용하여 FG4 카바이드 비트를 사용하여 표시된 원의 바깥쪽을 따라 두개골을 에칭하고 얇게 하여 두개골을 얇게 할 트랙을 만듭니다. 뼛가루를 씻어내기 위해 식염수로 해당 부위를 관개하십시오.

두개골이 종이처럼 얇고 투명해질 때까지 FG 1/4 카바이드 비트를 사용하여 두개골을 계속 얇게 만듭니다. 주기적으로 드릴링을 중지하고 전체 부위를 멸균 식염수로 다시 관개하여 드릴의 열을 줄이고 뼛가루를 씻어냅니다. EF4 카바이드 비트를 사용하여 두개골 얇게 만들기를 완료하고 트랙을 따라 나머지 두개골을 계속 얇게 하고 드릴링합니다.

갈라진 부분에 0.5mm의 끝이 가는 집게를 삽입하고 밑에 있는 뇌를 움푹 들어가지 않고 뼈 피판을 부드럽게 위로 들어 올립니다. 뼈 피판을 제거한 후 개두술 부위를 식염수로 세척합니다. 끝이 구부러진 수술용 집게를 사용하여 눈에 보이는 지주막 물질을 부드럽게 제거합니다.

끝이 직선인 수술용 집게를 사용하여 3mm 유리 커버 슬립이 아래를 향하도록 하여 멸균 유리창을 집습니다. 개두술 부위 위에 유리창을 놓고 조정하여 창이 개두술 가장자리에 꼭 맞도록 합니다. 5mm 유리 커버 슬립이 상단에 있습니다.

앞서 설명한 대로 치과용 시멘트를 준비하고 시멘트가 반죽처럼 두꺼워질 때까지 약 6분 정도 기다립니다. 시멘트가 반죽되고 두꺼워질 때까지 기다리는 동안 입체 조작기를 통해 창에 적절한 양의 압력을 가하여 두개골이 유리창에 안전하고 단단히 접촉할 수 있는지 확인합니다. 조정 가능한 정밀 어플리케이터 브러시를 사용하여 창 가장자리를 따라 소량의 시멘트를 추가하여 유리창을 두개골로 밀봉합니다.

시멘트가 완전히 마를 때까지 약 10분 정도 기다렸다가 창 위의 매니퓰레이터를 부드럽게 풀어 제거합니다. 과도한 시멘트가 창을 덮고 있는 경우 FG4 카바이드 비트가 있는 치과용 드릴을 사용하여 치과용 시멘트를 다듬어 완료합니다. 수술 후 약 4시간 후, 2광자 이미징을 수행했는데, 표면 수준의 혈관 조직에서는 검게 보였고, 약 400마이크로미터의 깊은 수준에서는 EGFP 단백질 발현이 세포체 전체에 확산적으로 분포되었습니다.

TBI 후 1주일 4개월에 0일 시점에서 관찰된 혈관 구조 패턴을 동일한 이미징 영역을 찾기 위한 참조로 사용했습니다. 혈관 패턴은 0일차와 유사합니다. 유사하게, EGFP 발현은 세포체 전체에서 검출되었습니다.

0일째와 4개월째의 형광 강도는 표재성 수준과 심층 수준 모두에서 비슷했습니다. 그러나 1주일의 형광 강도는 0일째 및 4개월의 형광 강도보다 낮았는데, 이는 다른 TBI 모델에서 보고된 병진 억제 때문일 수 있습니다. 개두술을 시행할 때 뇌 조직이 손상되지 않도록 최대한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.

드릴 팁을 뇌에 삽입하지 마십시오. 이 기술을 사용하여 연구자들은 TBI 이후 여러 단계에 걸쳐 동일한 세포에서 서로 다른 관심 단백질을 종단으로 시각화하여 외상 후 포유류 뇌에서 해당 단백질의 국소화, 발현 및 용해도에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.