Name: Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 학습하세요 외상성 뇌손상 후 신경 세포 반응을 생체 내에서 시각화하는 방법을. 2광자 현미경과 두개골 창을 이용해 마우스 뇌에서 EGFP 발현 신경원을 장기간 추적하고, 급성기와 만성기 단백질 변화를 관찰할 수 있습니다.

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AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP 바이러스를 기증해 주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Miguel Sena-Esteves 박사님과 생쥐 두개골 스케치를 그려주신 University of Massachusetts Chan Medical School의 Debra Cameron 박사님께 감사드립니다. 또한 Bosco, Schafer 및 Henninger 연구소의 현재 및 이전 구성원의 제안과 지원에 감사드립니다. 이 작업은 국방부(W81XWH202071/PRARP)에서 DAB, DS 및 NH에 자금을 지원했습니다.

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않습니다.

이 연구에서는 AAV 주입, TBI 투여 및 두개골 창 이식이 있는 헤드포스트를 결합하여 쥐 뇌 피질(레이어 IV 및 V) 내 EGFP 표지 뉴런의 종단 이미징 분석을 통해 TBI가 피질 뉴런에 미치는 영향을 관찰했습니다. 이 연구는 여기에서 선택한 TBI 부위가 해마 위에 두개골 창 이식을 위한 비교적 평평하고 넓은 표면을 제공한다는 점에 주목합니다. 반대로, 두개골은 이 부위의 앞쪽이 상대적으로 좁기 때문에 헤드포스트가 두개골 표면에 효과적으로 접촉하도록 하기 어렵습니다. 이 연구에서는 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스 모델만 사용되었지만, ALS 및 FTD19에 초점을 맞춘 실험실의 연구를 고려할 때 이 프로토콜은 대부분의 다른 마우스 균주에 적용할 수 있어야 합니다. 여기에 설명된 대로 뉴런을 라벨링하는 것 외에도 다양한 전략을 사용하여 생체 내 이미징을 위해 다른 세포 유형을 라벨링할 수 있습니다. 한 가지 접근법은 유전자 변형 마우스에서 Cre-Lo...

스포츠 부상, 차량 충돌 및 군사 전투로 인해 발생할 수 있는 외상성 뇌 손상(TBI)은 전 세계적으로 건강 문제입니다. TBI는 생리적, 인지적, 행동적 결핍과 평생 장애 또는 사망률로 이어질 수 있다 1,2. TBI 중증도는 경증, 중등도 및 중증으로 분류할 수 있으며, 대다수는 경증 TBI(75%-90%)3입니다. TBI, 특히 TBI의 반복적인 발생은 신경 퇴화를 촉진하고 알츠하이머병(AD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 전두측두엽 치매(FTD) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 위험 요인으로 작용할 수 있다는 사실이 점점 더 많이 인식되고 있습니다.4,5,6. 그러나 TBI 유발 신경 퇴행의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 불분명하므로 활발한 연구 분야입니다. 뉴런이 TBI에 반응하고 TBI로부터 회복하는 방법에 대한 통찰력을 얻기 위해, TBI 후 마우스에서 종방향 생체 내 이미징에 의해 특히 뉴런 내에서 관심 있는 형광 태그 단백질을 모니터링하는 방법이 본원에 설명되어 있습니다.
이를 위해 본 연구는 이전에 보고된 것과 유사한 폐쇄형 두개골 TBI 투여를 위한 외과적 절차(7,8)와 Goldey 등(9)이 기술한 바와 같이 다운스트림 생체 내 이미징을 위한 두개골 창 이식을 위한 외과적 절차를 결합하는 방법을 보여줍니다. 특히, TBI를 유도하는 체중 감소의 영향으로 창호가 손상되고 마우스에 돌이킬 수 없는 손상을 입힐 가능성이 높기 때문에 두개골 창을 먼저 이식한 후 동일한 부위에 TBI를 수행하는 것은 불가능합니다. 따라서 이 프로토콜은 TBI를 투여한 다음 동일한 수술 세션 내에서 충격 부위 바로 위에 두개골 창을 이식하도록 설계되었습니다. 한 번의 수술 세션에서 TBI와 두개골 창 이식을 결합하는 것의 장점은 마우스가 수술을 받는 횟수를 줄일 수 있다는 것입니다. 또한 TBI에 대한 즉각적인 반응(즉, 시간 척도)을 모니터링할 수 있으며, 이후 수술 세션(즉, TBI 후 며칠 동안 초기 이미징을 시작하는 것)에서 창을 이식하는 것과는 대조적입니다. 두개골 창 및 생체 내 이미징 플랫폼은 또한 고정 조직의 면역 염색과 같은 기존 방법으로 신경 단백질을 모니터링하는 것보다 이점을 제공합니다. 예를 들어, 개별 시점에 필요한 별도의 마우스 코호트와 달리 동일한 마우스를 여러 시점에서 연구할 수 있기 때문에 생체 내 이미징에 더 적은 수의 마우스가 필요합니다. 또한 시간이 지남에 따라 동일한 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 동일한 세포 내에서 특정 생물학적 또는 병리학적 사건을 추적할 수 있습니다.
개념 증명으로서, 시냅신 프로모터 하에서 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 뉴런 특이적 발현이 여기10에 입증되어 있다. 이 접근법은 1) 희소돌기아교세포에 대한 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성상교세포에 대한 신경교세포의 섬유산성 단백질(GFAP) 프로모터와 같은 다른 세포 유형 특이적 프로모터를 활용하여 다른 뇌세포 유형으로 확장할 수 있으며, 2) 유전자를 EGFP 유전자와 융합하여 관심 있는 다른 표적 단백질을 활용하고, 3) 서로 다른 형광단에 융합된 여러 단백질을 동시 발현할 수 있습니다. 여기서 EGFP는 두개내 주사를 통한 아데노 관련 바이러스(AAV) 전달을 통해 패키징되고 발현됩니다. 폐쇄형 두개골 TBI는 체중 감량 장치를 사용하여 투여된 후 두개골 창을 이식합니다. 신경 세포 EGFP의 시각화는 두개골 창을 통해 이루어지며, 생체 내에서 EGFP 형광을 검출하기 위해 이광자 현미경을 사용합니다. 2광자 레이저를 사용하면 광손상을 최소화하면서 피질 조직 깊숙이 침투할 수 있어 며칠 및 최대 12,13,14,15개월 동안 개별 마우스 내에서 동일한 피질 영역의 반복적인 세로 이미징이 가능합니다. 요컨대, TBI 수술과 생체 내 영상을 결합하는 이러한 접근법은 TBI 유발 질환 병리학에 기여하는 분자 사건에 대한 이해를 증진시키는 것을 목표로 한다16,17.

<table><tbody><tr><td>조정 가능한 정밀 애플리케이터 브러시</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>NDC/HRI#08290-3284-38</td><td>5/16" x 31G</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>포함 7.5% 포비돈 요오드</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>PAR 제약</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>HIKMA 제약</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>세라믹 혼합 접시</td><td>Parkell</td><td>SKU : S387</td><td>치과 용 시멘트 준비</td></tr><tr><td>용 코튼 팁 애플리케이터</td><td>ZORO</td><td>catlog # : G9531702</td><td></td></tr><tr><td>Catalyst</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>성명 : "C"범용 TBB 촉매</td></tr><tr><td>치과 시멘트 분말</td><td>Parkell</td><td>S396</td><td>방사선 불투과성 L- 파우더 C & B Metabond</td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>Foredom</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>치과 드릴 컨트롤러</td><td>Foredom</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>EF4 카바이드 비트</td><td>Microcopy</td><td>Lot# C150113</td><td>헤드 Dia/Lgth/mm 1.0/4.2</td></tr><tr><td>Ethonal</td><td>Fisher Scientific</td><td>04355223EA</td><td>75%</td></tr><tr><td>FG1/4 카바이드 비트</td><td>Microcopy</td><td>Lot# C150413</td><td>헤드 Dia/Lgth/mm 0.5/0.4</td></tr><tr><td>FG4 카바이드 비트</td><td>Microcopy</td><td>Lot# C150309</td><td>헤드 Dia/Lgth/mm 1.4/1.1</td></tr><tr><td>헤드포스트</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>난방 장치</td><td>CWE</td><td>TC-1000 입</td><td>체 기구가 장착되어 수술 중 사용</td></tr><tr><td>난방 담요</td><td>CVS 약국</td><td>E12107</td><td>추가 가열 장치 및 수술 후 사용</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 유도 챔버</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>짧은</td></tr><tr><td>Isoflurane 휘발기</td> 용 유도 챔버 <td>Vetequip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 휘발기 홀더</td><td>Vetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>라이카 수술 현미경</td><td>라이카</td><td>LEICA 10450243</td><td></td></tr><tr><td>윤활제 안과 연고</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>마커 펜</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>미세 주입 펌프 및 컨트롤러</td><td>World Precision Instruments</td><td>micro4 및 UMP3</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 리터 주사기</td><td>해밀턴</td><td>해밀턴 80014</td><td>1701 RN, 10 &mu; 주사기용 L 게이지 및 바늘용 32 게이지, 2인치, 포인트 스타일 3</td></tr><tr><td>모기 집게</td><td>CAROLINA</td><td>항목 #:625314</td><td>스테인리스 스틸, 곡선, 5인치</td></tr><tr><td>탈모제</td><td>McKesson Corporation</td><td>N/A</td><td>Nair Hair Aloe & 라놀린 제모 로션</td></tr><tr><td>현미경 1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>두개골 창 준비용 Nikon 현미경</td></tr><tr><td>현미경 2</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td><td>이광자 현미경</td></tr><tr><td>다광자 레이저</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Ultra II, 모델: MRU X1, VERDI 18W</td><td>이광자 현미경 검사용</td></tr><tr><td>레이저 비흡수성 외과 봉합</td>사 <td>Harvard Apparatus</td><td>catlog# 59-6860</td><td>6-0, 둥근 바늘 Norland</td></tr><tr><td>광학 접착제 81</td><td>Norland 제품</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>No-Snag 바늘 홀더</td><td>CAROLINA</td><td>항목 #: 567912</td><td></td></tr><tr><td>퀵 베이스 액체</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>"B" 퀵 베이스 C& B 메타본드</td></tr><tr><td>레귤러 시저 1</td><td>Eurostat</td><td>eurostat es5-300</td><td></td></tr><tr><td>레귤러 시저 2</td><td>월드 프리시저</td><td>Instruments No. 501759-G</td><td></td></tr><tr><td>라운드 커버 유리 1</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>CS-5R Cat# 64-0700</td><td>직경 5mm용</td></tr><tr><td>라운드 커버 유리 2</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>CS-3R Cat# 64-0720</td><td>직경 3mm용</td></tr><tr><td>고무 링</td><td>Orings-Online</td><td>Item # OO-014-70-50</td><td>O-Rings</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Bioworld</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissor 1</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 91500-09</td><td>팁 스트레이트</td></tr><tr><td>스프링 가위 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 91501-09</td><td>tip</td></tr><tr><td>curved Stereotaxic platform</td><td>KOPF</td><td>Model 900LS</td><td></td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Item #: 1647358</td><td></td></tr><tr><td>surgical Caliper</td><td>World Precision Instruments</td><td>No. 501200</td><td></td></tr><tr><td>수술용 집게 1</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>Catlog# 0508-5/45-PO</td><td>스타일 5/45, 곡선형</td></tr><tr><td>수술용 집게 2</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>catlog# 0103-5-PO</td><td>스타일 5, 직선</td></tr><tr><td>수술용 집게 3</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>catlog# 72912</td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자 4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>Catlog# 0508-5/45-PO</td><td>스타일 5/45, 곡선</td></tr><tr><td>형 수술용 거즈</td><td>ZORO</td><td>catlog #: G0593801</td><td></td></tr><tr><td>수술용 램프</td><td>Leica</td><td>Leica KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>UV 상자</td><td>Spectrolinker</td><td>XL-1000</td><td>또는 UV crosslinker</td></tr><tr><td>Vaporguard</td><td>Vetequip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 조직 접착제</td><td>3M 동물 관리</td><td>부품 번호 : 014006</td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of fluorescent protein expression in mice with a closed-skull traumatic brain injury and cranial window using a two-photon microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

이 프로토콜의 목표는 외인성 자극에 노출되었을 때 동물 뇌의 특정 세포 유형 내에서 관심 단백질의 발현 및 국소화를 종단적으로 시각화하는 방법을 보여주는 것입니다. 여기에서, 폐쇄된 두개골 외상성 뇌 손상(TBI)의 투여와 마우스의 후속 종방향 생체 내 이미징을 위한 두개골 창의 동시 이식을 보여줍니다. 마우스는 신경 세포 특이적 프로모터 하에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 두개내로 주입합니다. 2 내지 4주 후, 마우스는 AAV 주입 위치 위에 체중 감소 장치를 사용하여 반복적인 TBI를 실시한다. 동일한 수술 세션 내에서 마우스에 금속 헤드포스트를 이식한 다음 TBI 충격 부위 위에 유리 두개골 창을 이식합니다. EGFP의 발현 및 세포 국소화는 수개월 동안 외상에 노출된 동일한 뇌 영역에서 이광자 현미경을 사용하여 검사됩니다.

이 프로토콜에 대한 개념 증명으로, AAV-Syn1-EGFP를 발현하는 바이러스 입자를 생후 3개월에 수컷 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스(C57BL/6J 배경)19의 뇌 피질에 주입했습니다. 야생형 C57BL/6J 동물도 사용할 수 있지만, 이 연구는 실험실이 신경퇴행성 질환 연구에 중점을 두고 있기 때문에 TDP-43 Q331K/Q331K 마우스에서 수행되었습니다. TBI 수술은 AAV 주사 후 4주 후에 시행되었습니다. 동일한 수술 환경에서 헤드포스트와 두개골 창이 이식되었습니다. 마우스는 TBI 수술 후 0일, 1주일, 4개월에 이광자 현미경을 사용하여 연속적으로 이미지화되었습니다(그림 1). 일반적으로 주사 수술은 ~ 30 분이 걸렸고 TBI 수술은 마우스 당 ~ 1 시간이 걸렸습니다. TBI 수술 동안, 쥐는 일반적으로 초기 충격에 비해 후속 충격 후 앙와위 자세에서 엎드린 ...

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

The goal of this protocol is to demonstrate how to longitudinally visualize the expression and localization of a protein of interest within specific cell ...

당사의 프로토콜은 살아있는 쥐의 기계적 스트레스에 대한 신경 반응을 시각화하는 방법을 제공하며, 이는 외상성 뇌 손상이 뇌에 미치는 영향에 대한 직접적인 증거를 제공할 수 있습니다. 이 기술은 외상성 뇌 손상 후 급성 및 만성 단계 모두에 대해 동일한 동물의 동일한 뇌 위치에서 표적 단백질을 모니터링할 수 있습니다. 관심 유전자와 바이러스 프로모터는 뇌의 특정 세포 유형에 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 그에 따라 변경될 수 있습니다.시작하려면 마취된 쥐의 눈에 안과 연고를 바르십시오. 일반 가위로 다듬어 머리 꼭대기의 머리카락을 제거하십시오. 12-15mm 길이의 정중선을 절개한 후 구부러진 팁 스프링 가위를 사용하여 두개골의 좌우 반구의 피부를 절제합니다.두개골이 노출되면 멸균 면 팁 어플리케이터로 부드럽게 문질러 골막을 제거하고 멸균 식염수로 씻어냅니다. 두개골 부위가 건조되면 외상성 뇌 손상(TBI) 충격 부위를 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 시상 봉합사에서 측면 2mm 좌표에 표시합니다. 입체 프레임 프레임에서 마우스를 빠르게 제거하고 TBI 장치 아래의 완충 쿠션에 헤드를 놓습니다.임팩터 팁을 표시된 충격 부위에 맞춥니다. 묶인 나일론 끈을 마우스 머리 위로 15cm 당겨 금속 기둥을 들어 올린 다음 풀어 TBI 부위의 두개골 상단과 접촉하는 변환기 막대에 무게가 자유롭게 떨어지도록 합니다. 마취된 쥐의 머리를 수술용 현미경 아래에 보관된 입체 프레임에 놓습니다.FG4 카바이드 비트를 사용하여 낮은 로터 속도로 두개골 표면을 부드럽고 천천히 뚫어 남아 있는 골막을 제거하고 치과용 시멘트가 두개골과 단단히 결합되도록 거친 두개골 표면을 만듭니다. 식염수를 사용하여 두개골 표면에서 뼛가루를 씻어내고 제거합니다. 두개골에서 외측 근육을 분리하려면 두정과 측두골을 연결하는 봉합사가 있는 눈 뒤쪽 약 5mm에서 미세한 닫힌 팁을 부드럽게 삽입하고 닫힌 팁을 양털 봉합사가 될 때까지 뒤쪽 방향으로 부드럽게 움직입니다.두개창 이식이 이루어지는 쪽의 측면 근육을 분리합니다. 식염수를 사용하여 수술 부위의 이물질을 씻어내고 거즈로 해당 부위를 말립니다. 헤드 포스트를 이식하려면 마커 펜과 수술용 캘리퍼스를 사용하여 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 오른쪽 반구의 시상 봉합사에서 1.5mm 떨어진 곳에 중심점을 표시합니다.그런 다음 깨끗하고 건조한 두개골의 개두술 둘레를 추적합니다. 이어 바를 풀고 머리를 돌려 개두면이 완벽하게 수평이 되도록 한 다음 이어 바를 다시 조입니다. 면봉 어플리케이터의 나무 막대기를 사용하여 헤드 포스트의 앞면과 뒷면 가장자리에 초강력 접착제 두 방울을 떨어뜨립니다.티타늄 헤드 포스트를 개두술의 중앙 위에 놓고 두개골 창이 이식될 동일한 평면 내에 놓이도록 빠르게 조정합니다. 초강력 접착제가 마를 때까지 가벼운 압력을 가하면 일반적으로 약 30초가 걸립니다. 예냉식 세라믹 접시에 시멘트 분말 300mg, QuickBase 액체 6방울, 촉매 1방울을 완전히 혼합하여 치과용 시멘트를 준비합니다.넉넉한 양의 치과용 시멘트 혼합물을 추적된 둘레의 바깥쪽 둘레에 빠르게 바르고 노출된 뼈 표면을 덮습니다. 그러나 개두술 부위를 덮지 마십시오. 이어 바를 풀고 헤드 포스트를 금속 프레임에 고정하여 헤드가 표시된 개두술 둘레를 따라 정밀한 드릴링을 위해 안정적인지 확인합니다.개두술을 수행하려면 수술용 캘리퍼스를 사용하여 앞에서 설명한 대로 표시된 원의 직경을 확인하고 필요에 따라 조정하여 두개골 창이 개두술 내부에 꼭 맞도록 합니다. 전기 치과 드릴을 사용하여 FG4 카바이드 비트를 사용하여 표시된 원의 바깥쪽을 따라 두개골을 에칭하고 얇게 하여 두개골을 얇게 할 트랙을 만듭니다. 뼛가루를 씻어내기 위해 식염수로 해당 부위를 관개하십시오.두개골이 종이처럼 얇고 투명해질 때까지 FG 1/4 카바이드 비트를 사용하여 두개골을 계속 얇게 만듭니다. 주기적으로 드릴링을 중지하고 전체 부위를 멸균 식염수로 다시 관개하여 드릴의 열을 줄이고 뼛가루를 씻어냅니다. EF4 카바이드 비트를 사용하여 두개골 얇게 만들기를 완료하고 트랙을 따라 나머지 두개골을 계속 얇게 하고 드릴링합니다.갈라진 부분에 0.5mm의 끝이 가는 집게를 삽입하고 밑에 있는 뇌를 움푹 들어가지 않고 뼈 피판을 부드럽게 위로 들어 올립니다. 뼈 피판을 제거한 후 개두술 부위를 식염수로 세척합니다. 끝이 구부러진 수술용 집게를 사용하여 눈에 보이는 지주막 물질을 부드럽게 제거합니다.끝이 직선인 수술용 집게를 사용하여 3mm 유리 커버 슬립이 아래를 향하도록 하여 멸균 유리창을 집습니다. 개두술 부위 위에 유리창을 놓고 조정하여 창이 개두술 가장자리에 꼭 맞도록 합니다. 5mm 유리 커버 슬립이 상단에 있습니다.앞서 설명한 대로 치과용 시멘트를 준비하고 시멘트가 반죽처럼 두꺼워질 때까지 약 6분 정도 기다립니다. 시멘트가 반죽되고 두꺼워질 때까지 기다리는 동안 입체 조작기를 통해 창에 적절한 양의 압력을 가하여 두개골이 유리창에 안전하고 단단히 접촉할 수 있는지 확인합니다. 조정 가능한 정밀 어플리케이터 브러시를 사용하여 창 가장자리를 따라 소량의 시멘트를 추가하여 유리창을 두개골로 밀봉합니다.시멘트가 완전히 마를 때까지 약 10분 정도 기다렸다가 창 위의 매니퓰레이터를 부드럽게 풀어 제거합니다. 과도한 시멘트가 창을 덮고 있는 경우 FG4 카바이드 비트가 있는 치과용 드릴을 사용하여 치과용 시멘트를 다듬어 완료합니다. 수술 후 약 4시간 후, 2광자 이미징을 수행했는데, 표면 수준의 혈관 조직에서는 검게 보였고, 약 400마이크로미터의 깊은 수준에서는 EGFP 단백질 발현이 세포체 전체에 확산적으로 분포되었습니다.TBI 후 1주일 4개월에 0일 시점에서 관찰된 혈관 구조 패턴을 동일한 이미징 영역을 찾기 위한 참조로 사용했습니다. 혈관 패턴은 0일차와 유사합니다. 유사하게, EGFP 발현은 세포체 전체에서 검출되었습니다.0일째와 4개월째의 형광 강도는 표재성 수준과 심층 수준 모두에서 비슷했습니다. 그러나 1주일의 형광 강도는 0일째 및 4개월의 형광 강도보다 낮았는데, 이는 다른 TBI 모델에서 보고된 병진 억제 때문일 수 있습니다. 개두술을 시행할 때 뇌 조직이 손상되지 않도록 최대한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.드릴 팁을 뇌에 삽입하지 마십시오. 이 기술을 사용하여 연구자들은 TBI 이후 여러 단계에 걸쳐 동일한 세포에서 서로 다른 관심 단백질을 종단으로 시각화하여 외상 후 포유류 뇌에서 해당 단백질의 국소화, 발현 및 용해도에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스의 외상성 뇌 손상(TBI)을 보여줍니다. 두개골을 노출시킨 후 TBI 부위를 표시합니다. 그런 다음 마우스가 TBI 장치 아래에 위치합니다. 충격은 금속 막대를 들어 올려 두개골과 접촉하는 임팩터에 자유롭게 떨어뜨릴 수 있도록 함으로써 전달됩니다.

마우스 뇌에 외상성 뇌 손상 전달

출처: Bisht, K., et al. 생쥐의 신경 면역 역학에 대한 반복적인 생체 내 이미징을 수행하기 위한 정밀한 뇌 매핑. J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 두개골 임플란트가 있는 형질전환 마우스의 신경 면역 역학의 형광 이미징을 보여줍니다. 혈관 및 신경 안정성은 신경 활동에 대한 면역 반응을 반영하는 동적 미세아교세포 변화와 함께 이미지화됩니다.

두개골 임플란트를 사용한 신경 면역 역학의 형광 이미징

Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

학습하세요 외상성 뇌손상 후 신경 세포 반응을 생체 내에서 시각화하는 방법을. 2광자 현미경과 두개골 창을 이용해 마우스 뇌에서 EGFP 발현 신경원을 장기간 추적하고, 급성기와 만성기 단백질 변화를 관찰할 수 있습니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징) (동영상) | JoVE Journal

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