Fluorescein-Isothiocyanate-labeled dextran을 사용한 생쥐의 장 장벽 무결성 평가

이 방법은 상태가 장 장벽 무결성을 변경하는지 여부에 대한 질문 또는 잠재적인 치료가 장 장벽 무결성을 유지할 수 있는지에 대한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 장 투과성을 평가하고 정량화할 수 있는 비침습적이고 부담이 적은 기술을 제공한다는 것입니다. 시작하기 위해, 마우스를 4시간 동안 금식시킨 다음, 38 밀리미터 22 게이지 멸균된 곡선형 위관영양관 바늘을 사용하여 각 마우스에 경구 위관영양법을 통해 200 마이크로리터의 FITC-덱스트란 현탁액을 투여한다.

첫 번째 위관 영양 기능 후 타이머를 시작하고 생체 내 측정이 가능하도록 각 위 관법 사이에 5-10 분을 기다렸다가 위관 영양 후 1 시간을 유지합니다. 표준 곡선에 대한 나머지 FITC-dextran 현탁액을 유지합니다. 시작 버튼을 클릭한 상태에서 기계와 소프트웨어를 시작하고 시스템이 예열될 때까지 기다립니다.

Device status(디바이스 상태)를 클릭하고 계속하기 전에 구성된 모든 디바이스에 OK(확인)가 표시되는지 확인합니다. 그런 다음 새 연구를 클릭하고 원하는 이름으로 파일을 저장합니다. 그런 다음 연구 옵션을 클릭하십시오.

표본 ID를 입력하고 올바른 레이저를 선택하고 실험하십시오. 그런 다음 전기 면도기를 사용하여 복부에서 털을 제거하고 건조를 방지하기 위해 수의학 연고를 눈에 넉넉히 바릅니다. 이미징 챔버를 열고 동물을 주사판에 등쪽으로 놓습니다.

그런 다음 팔다리와 꼬리를 테이프로 고정하십시오. 그런 다음 그리기 도구를 사용하여 스캔할 영역을 선택합니다. 간 바로 위에서 직장까지 복부의 전체 너비를 포함해야 합니다.

그런 다음 수정 도구를 클릭하여 그린 영역을 조정합니다. 스캔 해상도를 2.0mm로 설정하고 시작을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 그런 다음 선택한 파일 이름으로 이미지 파일을 찾아 열고 동기화된 설정으로 모든 파일을 동시에 엽니다.

이미지 설정 도구 모음에서 이미지 동기화 및 배율 동기화 버튼을 사용하여 정확한 비교를 위해 이미지 설정을 동기화합니다. 그런 다음 조정된 배율로 이미지를 저장합니다. 이미징 시스템과 관련된 소프트웨어를 사용하여 균일하게 스케일링된 이미지에서 각 동물과 대조군 마우스의 복부 형광을 비교합니다.

위관 관찰 후 4시간 후에 멸균 튜브에 각 마우스의 분변 펠릿을 수집합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 어둠 속에 두십시오. 다음에, 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 9, 390 x g에서 원심분리한다.

그런 다음 혈장을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 어둠 속에서 얼음 위에 보관하십시오. 50 밀리그램의 분변 샘플을 200 마이크로 리터의 PBS로 희석하고 PBS로 혈장을 1 대 2 비율로 희석합니다. 플레이트 100 마이크로리터 샘플과 표준물질을 불투명한 검은색 96웰 플레이트에 담습니다.

형광 플레이트 리더에서 485 나노미터의 여기와 530 나노미터의 흡수로 형광을 판독합니다. 마지막으로, 형광을 표준 곡선의 알려진 농도와 비교하여 시료당 FITC-dextran의 농도를 결정합니다. 생체 내 형광 분석 결과, 대조군 식이만 섭취한 쥐는 이눌린 보충 식이를 섭취한 쥐에 비해 FITC-덱스트란의 간 섭취량이 더 높고 복강 내 잔류 형광 수치가 더 높은 것으로 나타났습니다.

이눌린 보충 식이를 받은 쥐는 대조군 식이만 받은 쥐에 비해 혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 현저히 낮았습니다. 이와 일치하게, 이눌린 식이만 섭취한 쥐는 대조군 식이만 섭취한 쥐보다 대변에서 FITC-덱스트란 수치가 유의하게 더 높았습니다. 통제된 쥐의 대변에서 FITC-덱스트란의 낮은 수치는 적절하게 배설되지 않고 장 장벽을 통해 순환계로 침투했음을 나타냅니다.

혈장 내 FITC-덱스트란 수치가 높아 이 발견이 더욱 강화되었습니다. 이 절차를 시도할 때는 타이밍이 중요합니다. 형광 판독 및 샘플 수집은 각 개별 마우스에 대해 위관 후 1시간 및 4시간 동안 가능한 한 가깝게 이루어져야 합니다.