생체 내 유방 관내 주입을 통한 마우스 유방 상피 세포로의 유전자 전달

이 방법은 유전 물질을 특별하고 일시적이며 정량적으로 제어 가능한 방식으로 유선 상피 세포로 전달합니다. 유방 상피 세포로의 유전 물질 전달은 특별하고 일시적이며 정량적으로 제어되기 때문에 이 방법으로 생성된 유방 모델은 자연 종양 발생을 더 잘 모방합니다. 33 게이지 금속 허브 바늘을 약 1cm 길이로 자르고 알코올에 보관하여 주사기 준비를 시작합니다.

알코올에서 주사기와 바늘을 제거하고 주사기와 바늘에서 남은 알코올을 밀어냅니다. 그런 다음 공기 건조를 위해 주사기를 분해하십시오. 건조 후 주사기를 조립하십시오.

섭씨 영하 80도의 냉동고에서 바이러스 스톡 튜브를 꺼내 얼음에 해동합니다. 브로모페놀 블루를 첨가하려면 피펫 팁을 브로모페놀 블루 분말에 1cm 깊이까지 담그십시오. 그런 다음 부착 된 미량의 브로 모 페놀 블루를 바이러스 현탁액에 가져옵니다.

바이러스를 얼음 위에 놓기 전에 브로모페놀 블루를 위아래로 10회 피펫팅하여 바이러스 용액과 혼합합니다. 마취 된 암컷 마우스의 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물이 마취중인 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오.

마우스를 따뜻한 패드에 앙와위 자세로 놓고 접착 테이프를 사용하여 네 팔다리를 모두 벤치에 부착합니다. 주입하는 젖꼭지를 확인하고 가위로 주위의 머리카락을 다듬어 노출시킵니다. 70% 알코올과 이오타 4개의 면봉을 젖꼭지 부위에 3번 번갈아 가며 바르면 젖꼭지가 깨끗해지고 노출됩니다.

돋보기 램프 아래에 작은 중앙 덕트 개구부가 보일 때까지 멸균된 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 젖꼭지의 말단 끝을 절개합니다. 그런 다음 10 마이크로 리터의 바이러스 브로 모 페놀 블루 혼합물을 주사기에 넣고 돋보기 램프를 사용하여 바늘을 젖꼭지 구멍에 조심스럽게 삽입하십시오. 전체 10 마이크로 리터의 바이러스를 덕트 트리에 주입하고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 섭씨 45도에 설정된 슬라이드 워머에 마우스를 놓습니다.

바이러스 주사 후 3-5 일 후에 흉강을 엽니 다. 가위를 사용하여 복부 중간 선과 상지와하지를 따라 피부를 자릅니다. 피부를 들어 올리고 유방 땀샘을 노출시킵니다.

집게와 가위를 사용하여 대조군으로 피부와 주입되지 않은 유선을 피부에서 제거합니다. 완료되면 유선을 유리 슬라이드에 놓고 형광 실체 현미경으로 관찰하고 이미징하기 전에 유선을 원래 모양으로 펼칩니다. 관내 주입의 성공은 유선을 노출시키고 푸른 관 나무를 관찰함으로써 확인되었습니다.

렌티-EGFPFUCGW 바이러스 주사 2 내지 5일 후, 전체 마운트 제제를 형광 실체 현미경 하에서 관찰함으로써 유방 상피 세포 감염을 평가하였다. 바이러스에 의해 생성된 형광 단백질 또는 세포 표면 마커의 유세포 분석을 위해, 감염되지 않은 땀샘 및 감염된 땀샘을 수집하여 단일 세포 현탁액으로 처리하여 바이러스 감염률을 추정했습니다. 활성화된 ERBBB2는 몇 주 안에 전암성 병변을 일으키고 몇 달 안에 종양을 유발했습니다.

젖꼭지의 크기는 개별 마우스의 질량, 나이, 체중 및 강도의 차이로 인해 크게 달라질 수 있습니다. 유두의 끝을 적절하게 다듬어 유관의 개구부와 바늘을 맞추는 것은 바이러스를 성공적으로 주입하기 위한 중요한 단계입니다.