Name: 마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 배우세요 마우스 난소 특정 세포군에서 후성유전체와 전사체를 동시에 분석하는 TRAP 및 INTACT 최적화 방법. 세포 분류 없이 노화 관련 세포 특이적 변화를 효율적으로 규명할 수 있습니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), 브라이트포커스 재단(M2020207) 및 장로교 보건 재단의 보조금으로 지원되었다. 이 작업은 또한 미국(미국)의 MERIT 상 I01BX003906 및 공유 장비 평가 프로그램(ShEEP) 상 ISIBX004797에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재향 군인회, 생물 의학 실험실 연구 및 개발 서비스. 저자는 또한 도움과 기기 사용에 대해 임상 유전체학 센터(OMRF)와 이미징 핵심 시설(OMRF)에 감사를 표합니다.

모든 동물 시술은 오클라호마 의학 연구 재단(OMRF)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 부모 마우스는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하여 OMRF에서 14시간/10시간 명암주기(오전 6:00에 켜짐)로 HEPA 장벽 환경에서 SPF 조건에서 사육 및 사육했습니다.
참고: 이 데모에서는 Cyp17iCre+/-(균주 # 028547, 잭슨 연구소) 수컷과 NuTRAP 암컷(균주 # 029899, 잭슨 연구소)을 짝을 이룹니다. 원하는 Cyp17-NuTRAP 자손(Cyp17iCre+/-; NuTRAPflox/WT)는 난소 기질 세포에서 Cyp17a1 프로모터의 제어 하에 NuTRAP 대립유전자를 발현합니다. 본 원고 작성을 위해 생후 4개월된 암컷 Cyp17-NuTRAP 마우스(n=4)를 사용하였다. 유전자형 분석을 위해 마우스 귀 펀치 샘플에서 DNA를 추출하여 Cyp17iCre 및 NuTRAP 이식유전자의 유전을 확인하고 1) 일반 Cre, 2) Cyp17iCre 및 3) NuTRAP 플록싱의 PCR 검출을 위해앞서 설명한 바와 같이 재료 표에 나열된 프라이머를 사용하여 7,8.
1. 마우스 난소 박리
<ol><li>동물 관리 지침 및 기관의 승인에 따라 마우스 안락사를 수행 한 후 난소 채취를 수행합니다.</li>
	<li>완충액이 있는 튜브에 난소를 배치하기 전에 난소를 해부하여 지방 조직 또는 난소 조직에 부착될 수 있는 난관의 일부를 제거합니다. 즉시 TRAP 또는 INTACT 기술로 진행하십시오. 참고: 이 프로토콜은 냉동 조직과 함께 사용하도록 최적화되지 않았습니다. 각 기술에 대해 동일한 마우스에서 하나의 난소를 사용하는 것이 향후 통계 분석을 위해 권장됩니다.</li>
</ol>2. 특정 난소 세포 유형에서 핵 분리
<ol><li>버퍼 준비<ol><li>핵 정제 완충액(NPB): NPB 100mL를 준비하기 위해 1M HEPES 2mL(최종 농도: 20mM HEPES), 5M NaCl(40mM NaCl) 0.8mL, 2M KCl(90mM KCl) 4.5mL, 0.5M EDTA(2mM EDTA) 0.4mL, 0.5M EGTA(0.5mM EGTA) 0.1mL, 및 92.2mL의 뉴클레아제가 없는 물. 핵 분리 당일 1x 프로테아제 억제제를 보충하십시오. 참고: NPB는 프로테아제 억제제 없이 미리 제조할 수 있으며 4°C에서 최대 3주 동안 지속됩니다.</li>
		<li>핵 용해 완충액(완전): 핵 분리 당일 1x 프로테아제 억제제로 핵 용해 완충액을 보충합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>핵 현탁액의 생성 알림: samples는 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 위에 보관해야 합니다.<ol><li>Cyp17-NuTRAP 마우스(또는 기타 관련 Cre-NuTRAP)에서 500μL의 핵 용해 완충액(완전)에서 난소 1개를 수집합니다. 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다.</li>
		<li>광구경 피펫 팁을 사용하여 다진 난소와 500μL의 용해 완충액을 얼음 위의 유리 Dounce 균질화기에 옮깁니다. 느슨한 유봉 A로 난소를 10x-20x 균질화하고 Dounce 균질화기에 용해 완충액 400μL를 추가하고 유봉 A를 세척합니다.</li>
		<li>단단한 유봉 B 10x-20x로 난소를 균질화하십시오. 1,000 μL의 용해 완충액을 첨가하고, 유봉 B를 세척하고, 균질액(1.9 mL)을 2 mL 둥근 바닥 튜브에 옮긴다.</li>
		<li>4°C에서 1.5분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 해리되지 않은 조직과 혈관을 제거한다14. 상청액에는 핵이 포함되어 있습니다. 해리되지 않은 조직의 펠릿을 버리십시오.</li>
		<li>100 μL의 용해 완충액으로 30 μm 세포 여과기를 미리 적신 후, 세포 여과기를 통해 상층액을 15 mL 코니컬 튜브로 여과하였다. 그런 다음 핵 함유 혼합물을 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>샘플을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리하고 상층액을 버립니다. 펠릿에는 핵이 포함되어 있습니다.</li>
		<li>250μL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 핵 펠릿을 중등도에서 고속으로 잠시 소용돌이치며 재현탁합니다. 용해 완충액 1.5mL를 추가하여 부피를 최대 1.75mL로 만듭니다. 부드럽게 섞고 핵 현탁액을 얼음 위에 5분 동안 둡니다.</li>
		<li>4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 핵을 펠렛화한다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 버리십시오. 200 μL의 얼음 냉장 저장 완충액에 펠릿을 재현탁하고 핵 펠릿을 완전히 재현탁하기 위해 잠시 소용돌이칩니다.</li>
		<li>재현탁 펠릿(20μL)의 10%를 다운스트림 분석을 위한 입력 핵 샘플로 예약합니다.</li>
		<li>재현 탁 된 핵 펠릿을 취하여 얼음처럼 차가운 NPB로 부피를 2.0mL로 구성합니다. INTACT 친화성 기반 정제 방법을 사용하여 표지된 핵을 분리합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>특정 세포 유형에서 태그가 지정된 핵의 분리(INTACT)<ol><li>바이알에 있는 스트렙타비딘 비드를 중간 속도로 30초 동안 소용돌이쳐 완전히 재현탁되도록 합니다. 각 샘플에 대해 30μL의 재현탁 비드를 2mL 둥근 바닥 튜브에 추가하고(최대 10개의 샘플에 대한 비드는 단일 튜브에서 세척 가능) NPB 1mL를 추가하고 피펫팅으로 잘 재현탁합니다.</li>
		<li>튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다. 세척된 마그네틱 비드를 NPB 1mL에 재현탁합니다.</li>
		<li>총 세 번의 세척 단계를 반복합니다. 최종 세척 후, NPB의 초기 부피(샘플당 30 μL)로 비드를 재현탁한다.</li>
		<li>세척된 비드 30μL를 단계 2.2.10의 2mL 핵 현탁액에 추가합니다. 튜브를 피펫팅하고 부드럽게 뒤집어 비드-핵 혼합물을 잘 재현탁합니다.</li>
		<li>튜브를 냉장실이나 냉장고의 회전 믹서에 저속으로 30분 동안 놓습니다. 동일한 조건에서 비드 없이 입력 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>핵 현탁액과 비드가 있는 튜브를 자석에 놓고 스트렙타비딘 비드에 결합된 비오티닐화 핵(양성 분획)을 핵의 음성 분획에서 분리합니다. 비드가 자석에서 3분 동안 분리되도록 합니다.</li>
		<li>상층액을 제거하고 음성 분획을 신선한 2.0mL 튜브에 통과시킨 다음 얼음 위에 보관합니다. 각 양성 분획 튜브에 대해 자석에서 튜브를 제거하고 내용물을 1mL의 NPB에 재현탁합니다.</li>
		<li>튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 자석으로부터 튜브를 제거하고, 세척된 비드-핵 혼합물을 1 mL의 NPB에 재현탁시킨다.</li>
		<li>총 3회 세척 위해 2.3.8단계를 반복합니다. 3회 세척 완료 후, 양성 분획 비드-핵 혼합물을 NPB 30 μL에 재현탁한다.</li>
		<li>각각의 음성 분획 튜브에 대해, 단계 2.3.7로부터의 핵 현탁액을 4°C에서 7분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다. NPB 30μL에 음성 분획 핵 펠릿을 재현탁합니다.</li>
		<li>핵 DNA 또는 RNA 분리가 준비될 때까지 입력(단계 2.2.9), 음성 분획(단계 2.3.10) 및 양성 분획(단계 2.3.9)의 핵을 -80°C 냉동고에 보관합니다. 참고: 입력으로 온전한 핵을 요구하는 프로토콜(즉, 전이효소 접근 가능한 염색질, 염색질 면역침전에 대한 분석)을 위해 핵을 동결해서는 안 됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 특정 난소 세포 유형에서 mRNA 분리
<ol><li>버퍼 준비<ol><li>TRAP 완충액 염기: 78.8mL의 RNase가 없는 물, 5mL의 1M Tris-HCl(최종 농도: 50mM Tris[pH 7.5]), 5mL의 2M KCl(100mM KCl), 1.2mL의 1M MgCl2(12mMMgCl2) 및 10mL의 10% NP-40(1% NP-40). 4 °C에서 최대 1개월 동안 보관하세요.</li>
		<li>고염 완충액 염기: RNase가 없는 물 68.8mL, 1M Tris-HCl 5mL(최종 농도: 50mM Tris[pH 7.5]), 2M KCl(300mM KCl) 15mL, 1M MgCl2(12mMMgCl2) 1.2mL, 10% NP-40(1% NP-40) 10mL를 혼합하여 고염 완충액 염기 100mL를 준비합니다. 4 °C에서 최대 1개월 동안 보관하세요.</li>
		<li>TRAP 균질화 완충액(완료): 조직 채취 당일 시료당 1.5mL를 준비합니다. 10mL의 TRAP 완충액 염기(3.1.1단계부터)와 10μL의 100mg/mL 시클로헥시미드(최종 농도: 100μg/mL 시클로헥시미드), 10mg의 나트륨 헤파린(1mg/mL 나트륨 헤파린), 20μL의 0.5M DTT(1mM DTT), 50μL의 40U/μL RNase 억제제(200U/mL RNase 억제제), 0.1M 스페르미딘(2mM 스페르미딘) 200μL 및 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 정제 1개(1x).</li>
		<li>저염 세척 완충액(완전): 조직 채취 당일 검체당 1.5mL를 만듭니다. 10mL의 저염 세척 완충액을 만들려면 10mL의 TRAP 완충액 염기(3.1.1단계에서)와 100mg/mL 시클로헥시미드(100μg/mL 시클로헥시미드) 10μL 및 0.5M DTT(1mM DTT) 20μL를 결합합니다.</li>
		<li>고염 세척 완충액(완료): TRAP 분리 둘째 날에 샘플당 1.5mL를 만듭니다. 10mL의 고염 세척 완충액을 만들려면 10mL의 고염 완충액 염기(3.1.2단계)와 100mg/mL 시클로헥시미드 10μL 및 0.5M DTT 20μL를 결합합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 수행<ol><li>Cyp17-NuTRAP 마우스(또는 기타 관련 Cre-NuTRAP)에서 다른 난소를 채취하여 100μL의 얼음처럼 차가운 TRAP 균질화 완충액이 들어 있는 1.5mL RNase가 없는 튜브에 넣습니다(3.1.3단계부터). 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다.</li>
		<li>광경 팁을 사용하여 난소와 100μL의 균질화 완충액을 유리 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 느슨한 유봉 A로 10x-20x 균질화하고 400μL의 TRAP 균질화 완충액을 추가하고 유봉 A를 세척합니다.</li>
		<li>균질액을 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 추가 1 mL의 TRAP 균질화 완충액으로 Dounce 균질화기를 세척하고, 세척된 부피를 2 mL 둥근-바닥 튜브로 옮긴다.</li>
		<li>균질액을 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다. 깨끗해진 상층액을 새로운 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오.</li>
		<li>제거된 균질액 100μL를 신선한 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고 얼음에 입력으로 비축합니다.</li>
		<li>투명하게 처리된 균질액의 나머지(단계 3.2.4)를 항-GFP 항체(5μg/mL)와 함께 4°C에서 1시간 동안 끝 위로 회전하면서 배양합니다. 동일한 조건에서 입력 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>인큐베이션의 마지막 15분 동안, 단백질 G 자성 비드를 저염 세척 완충액에서 다음 단계(3.2.8-3.2.11)를 사용하여 세척한다.</li>
		<li>단백질 G 마그네틱 비드의 바이알을 30초 동안 소용돌이쳐 완전히 재현탁합니다. 각 샘플에 대해 50μL의 단백질 G 마그네틱 비드(하나의 튜브에서 최대 10개의 샘플을 세척할 수 있음)를 2mL 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>500 μL의 저염 세척 완충액을 비드에 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 넣어 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 저염 세척 버퍼 1mL를 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞이도록 피펫으로 만듭니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 넣어 튜브 측면에 비드를 모읍니다. 상청액을 제거하고 폐기하십시오.</li>
		<li>3.2.10 단계를 반복하여 총 3 번의 세척을하십시오. 최종 세척 후, 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고, 초기 부피의 저염 세척 완충액(샘플당 50 μL)에 비드를 재현탁한다.</li>
		<li>재현탁된 세척된 비드(50 μL)를 항원 샘플/항체 혼합물로 옮기고, 종단-끝(end-over-end) 혼합기에서 회전시키면서 밤새 4°C에서 인큐베이션한다. 동일한 조건을 유지하기 위해 4°C에서 하룻밤 동안 끝에서 끝까지 회전하는 입력 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>하룻밤 배양 후 회전자에서 튜브를 제거하고 마그네틱 스탠드를 사용하여 2.5-3분 동안 상층액(음성 분획)에서 표적 리보솜/RNA(양성 분획)로 자성 비드를 분리합니다. 음성 분획을 흡인하고 신선한 2mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 양성 분획을 처리하는 동안 얼음 위에 따로 보관합니다.</li>
		<li>500 μL의 고염분 세척 완충액(3.1.5 단계부터)을 양성 분획이 있는 튜브에 넣고 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 1분 동안 유지한 마그네틱 스탠드에 올려 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.</li>
		<li>3.2.14 단계를 반복하여 총 3 회 세척합니다. 최종 세척 후, 3.5μL의 2-메르캅토에탄올(BME)로 보충된 350μL의 RNA 용해 완충액에 비드를 재현탁합니다. 디지털 셰이커에서 900rpm으로 10분 동안 혼합하면서 실온에서 튜브를 배양합니다.</li>
		<li>표적 리보솜/RNA가 포함된 용액에서 비드를 실온에서 1분 동안 자기 스탠드로 분리합니다. 용출된 양성 분획(상청액)을 신선한 1.5mL 튜브에 수집하고 100% 에탄올 350μL를 추가합니다. 혼합하기 위해 반전합니다. RNA 분리를 진행합니다.</li>
		<li>선택 사항: 입력 샘플(단계 3.2.5) 및 음성 분획(단계 3.2.13)에서 RNA를 분리하려면 입력 및 음성 분획 100μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 3.5μL의 BME가 보충된 350μL의 RNA 용해 완충액을 각 샘플에 추가합니다. 혼합하기 위해 반전합니다. 각 튜브에 100% 에탄올 250μL를 넣고 뒤집어 혼합합니다. RNA 분리를 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA 분리<ol><li>700 μL의 양성 분획 및 선택적으로 입력 및/또는 음성 분획을 RNA 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 스핀 컬럼에서 RNA를 분리합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+aging%3A+Mechanisms+and+clinical+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences.</a> Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+Theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Morris, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+cycling+murine+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the cycling murine ovary.</a> eLife. 11, 77239(2022).</li>
<li>Kendrick, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+mammary+epithelial+subpopulations+identifies+novel+determinants+of+lineage+commitment+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate.</a> BMC Genomics. 9, 591(2008).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Ocanas, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> eNeuro. 9 (2), (2022).</li>
<li>Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BSIT%26%2334%3B+with+Emx1-NuTRAP+mice%3A+Simultaneous+INTACT+and+TRAP+for+paired+transcriptomic+and+epigenetic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">34;SIT&#34; with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing.</a> Current Protocols. 2 (10), 570(2022).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatomic+response+of+retinal+Muller+glia+to+acute+and+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress.</a> Neurobiology Disease. 175, 105931(2022).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
<li>Briley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+age-associated+fibrosis+in+the+stroma+of+the+mammalian+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary.</a> Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+reproductive+life+span+is+extended+by+targeted+removal+of+fibrotic+collagen+from+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary.</a> Science Advances. 8 (24), (2022).</li>
<li>Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+analysis+in+the+vertebrate+brain+using+immunolabeled+fresh+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei.</a> Bio-Protocol. 3 (22), 973(2013).</li>
<li>Saccon, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+follicle+reserve%2C+DNA+damage+and+macrophage+infiltration+in+the+ovaries+of+the+long-living+Ames+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice.</a> Experimental Gerontology. 132, 110851(2020).</li>
<li>Kinnear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+stroma+as+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The ovarian stroma as a new frontier.</a> Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).</li>
<li>Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+the+estrous+cycle+and+induction+of+estrus+in+experimental+rodents%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update.</a> Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+droplet-based+ultra-high-throughput+single-cell+RNA-Seq+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems.</a> Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+by+shrinking%3A+Empowering+single-cell+%27omics%27+with+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoBATCH+for+high-throughput+single-cell+epigenomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-cell+DNA+methylome+profiling+with+snmC-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2.</a> Nature Communications. 9, 3824(2018).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).</li>
<li>Yamawaki, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+high-throughput+single-cell+RNA-seq+methods+for+immune+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling.</a> BMC Genomics. 22 (1), 66(2021).</li>
<li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77(2016).</li>
<li>Natarajan, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+tagged+reverse+transcription+%28STRT-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq).</a> Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics comes of age.</a> Nature Communications. 11, 4307(2020).</li>
<li>Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Powerful+new+methods+for+understanding+gene+regulation+and+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity.</a> Genome Biology. 17, 72(2016).</li>
<li>Christensson, E., Lewan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermidine+for+the+isolation+of+nuclei+from+mouse+liver.+Studies+of+purity+and+yield+during+different+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fu%CC%88r+Naturforschung.+Section+C%2C+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions.</a> Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).</li>
<li>Levine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menopause+accelerates+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Menopause accelerates biological aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).</li>
<li>Ossewaarde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+menopause%2C+cause-specific+mortality+and+total+life+expectancy%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy.</a> Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).</li>
<li>Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+menopause+predicts+future+coronary+heart+disease+and+stroke%3A+the+Multi-Ethnic+Study+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Menopause%22%5BJournal%5D)">Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis.</a> Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).</li>
<li>Camaioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+ovarian+aging%3A+It+is+not+just+about+oocytes+and+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).</li>
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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

NuTRAP 마우스 모델6은 사용 가능한 Cre 드라이버를 사용하여 모든 세포 유형에 적용할 수 있는 특정 세포 유형에서 전사체와 후성유전체를 쌍으로 조사하기 위한 강력한 형질전환 라벨링 접근 방식입니다. 여기에서 우리는 난소 테카 및 기질 세포를 표적으로 하는 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성을 입증합니다. Cyp17-NuTRAP 모델은 난소 노화, 암 및 질병과 관련된 테카 및 기질 세포 특이적 후성유전학적 메커니즘을 추가로 설명하는 데 사용할 수 있습니다.
Cre 드라이버를 선택할 때 몇 가지 직교 접근법을 사용하여 Cre 매개 NuTRAP 발현의 세포 특이성을 검증하는 것이 좋습니다. Cyp17a1-Cre는 구성적으로 발현됩니다. NuTRAP 모델은 또한 개발 중 비표적 세포에서 유전자의 일시적인 발현을 피하기 위해 유도성 Cre 라인과 교차할 수 있습니다. 대부분의 난소 세포는 호르몬 변동에 매우 민감하기 때문에 발정...

난소는 체세포 노화의 주요 원인이다1, 특정 세포 집단에서 뚜렷한 기여를 한다. 난소의 세포 이질성은 대량의 전체 난소 분석의 분자 결과를 해석하기 어렵게 만듭니다. 난소 노화에서 특정 세포 집단의 역할을 이해하는 것은 노인 여성의 생식 능력과 건강 감소를 담당하는 분자 동인을 식별하는 데 중요합니다. 전통적으로, 특정 난소 세포 유형에 대한 다중 오믹스 평가는 레이저 미세해부(laser microdissection)2, 단세포 접근법(single-cell approach)3 또는 세포 분류(cell sorting)4와 같은 기법으로 이루어졌다. 그러나 미세 해부는 비용이 많이 들고 수행하기 어려울 수 있으며 세포 분류는 세포 표현형 프로파일을 변경할 수 있습니다5.
난소 세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 프로파일을 평가하는 새로운 접근 방식은 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 마우스 모델을 사용합니다. NuTRAP 모델은 친화성 정제 방법인 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 및 특정 세포 유형에서 태그가 부착된 핵의 분리(INTACT)6를 사용하여 세포 분류할 필요 없이 세포 유형별 핵산을 분리할 수 있습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. NuTRAP 마우스를 세포 유형별 Cre 라인과 교차시킴으로써, STOP 카세트의 제거는 리보솜 복합체의 eGFP-태깅과 Cre-의존적 방식으로 핵의 비오틴/mCherry-태깅을 유발한다6. 그런 다음 TRAP 및 INTACT 기술을 사용하여 관심 세포 유형에서 mRNA와 핵 DNA를 분리하고 전사체 및 후성유전체 분석을 진행할 수 있습니다.
NuTRAP 모델은 지방 조직6, 뇌 조직7, 8, 9 및 망막10과 같은 다양한 조직에서 사용되어 전체 조직 균질액에서 검출되지 않을 수 있는 세포 유형별 후성유전체 및 전사체 변화를 밝혀냈습니다. 기존 세포 분류 기법에 비해 NuTRAP 접근법의 이점에는 1) 생체 외 활성화 아티팩트방지8, 2) 특수 장비(예: 세포 분류기)의 필요성 최소화, 3) 세포 유형별 분석의 처리량 증가 및 비용 절감이 포함됩니다. 또한 단일 마우스에서 세포 유형별 DNA와 RNA를 분리할 수 있는 기능을 통해 통계적 검정력을 높이는 쌍 분석이 가능합니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형 11,12,13을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 NuTRAP 발현 시스템을 기질 및 테카 세포로 표적화했습니다. 여기에서 우리는 NuTRAP 구조의 유도가 난소 기질 및 테카 세포에 특이적이며 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA와 RNA가 단일 난소에서 얻어진다는 것을 보여줍니다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 모든 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
세포 유형 특이적 난소 NuTRAP 마우스 라인의 생성을 위해 핵 태깅 및 번역 리보솜 친화성 정제(NuTRAP) 대립유전자는 BirA, 비오틴 리가제 인식 펩타이드(BLRP) 태그가 지정된 mCherry/mRANGAP1 및 eGFP/L10a의 발현을 조절하는 플록싱된 STOP 코돈을 가지고 있습니다. 세포 유형별 Cre 라인과 교차할 때 NuTRAP 카세트의 발현은 핵 단백질 mRANGAP1을 비오틴/mCherry로, 리보솜 단백질 L10a를 eGFP로 Cre 의존적으로 라벨링합니다. 이를 통해 세포 분류 없이 특정 세포 유형에서 핵과 mRNA를 분리할 수 있습니다. NuTRAPflox/flox 는 난소 세포 유형과 관련된 세포 유형별 Cre와 쌍을 이루어 이를 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 M 스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>05292-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>100 mg/mL 시클로헥시미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>30 &마이크로; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>모든 준비 DNA/RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>안티 GFP 항체</td><td></td><td>Abcam Ab290</td><td>TRAP 및 IHC(토끼 다클론에서 GFP)</td></tr><tr><td>버퍼 RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA 용해 버퍼</td></tr><tr><td>프로토콜 cOmplete, mini, EDTA 무료 프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>TRAP 균질화를 위해 버퍼</td></tr><tr><td>Cyp17iCre 마우스 모델</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28547</td><td>B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J</td></tr><tr><td>DynaMag-2 자석</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>유전형 분석 프라이머</td><td>IDT</td><td>맞춤형</td><td>일반 Cre - Jackson Laboratory 프로토콜 22392, 프라이머: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Cyp17iCre - Jackson Laboratory 프로토콜 30847, 프라이머: 21218, 31704, 31705, 35663</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>NuTRAP - Jackson Laboratory 프로토콜 21509, 프라이머: 21306, 24493, 32625, 32626</td></tr><tr><td>Halt Protease 억제제 칵테일 (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861278</td><td>NPB 버퍼</td></tr><tr><td>M-280 Streptavidin Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>2.8 &마이크로; m 비드 직경</td></tr><tr><td>MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nuc101</td><td>에는 핵 용해 완충액과 핵 저장 완충액</td></tr><tr><td>1 m HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>5 m</td><td>NaCl Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>NuTRAP 마우스 모델</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>29899</td><td>B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J</td></tr><tr><td>Pierce DTT 중량 없음 형식</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>10004D</td><td>TRAP</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>초순수 1M Tris-HCl, pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>VWR 튜브 로테이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9854190</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

세포 유형별 후성유전체학 및 전사체 변화를 평가하는 것은 난소 노화를 이해하는 데 중요합니다. 이를 위해, 새로운 형질전환 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체 및 후성유전체의 후속 쌍 조사에 대해 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법 및 특정 세포 유형에서 태그된 핵 분리(INTACT) 방법의 최적화를 수행했습니다. NuTRAP 대립유전자의 발현은 플록싱된 STOP 카세트의 제어 하에 있으며 프로모터 특이적 Cre 라인을 사용하여 특정 난소 세포 유형을 표적화할 수 있습니다. 최근 연구에서 난소 기질 세포가 조기 노화 표현형을 유도하는 것과 관련이 있기 때문에 NuTRAP 발현 시스템은 Cyp17a1-Cre 드라이버를 사용하여 기질 세포를 표적으로 삼았습니다. NuTRAP 구조체의 유도는 난소 기질 섬유아세포에 특이적이었고, 시퀀싱 연구를 위한 충분한 DNA 및 RNA가 단일 난소로부터 얻어졌다. 여기에 제시된 NuTRAP 모델 및 방법은 사용 가능한 Cre 라인이 있는 모든 난소 세포 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

TRAP 및 INTACT 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 여기에서 난소 기질/테카 세포에 대한 Cyp17-NuTRAP 마우스 모델의 특이성은 면역형광 이미징 및 TRAP 분리 RNA의 RNA-Seq에 의해 입증됩니다. 먼저, 난소에서 eGFP 신호의 면역형광 이미징과 theca 및 stromal 세포에 대한 eGFP 신호의 국소화를 수행했습니다. 간략하게, 5 μm 절편을 크실렌 및 에탄올 구배로 탈파라핀화하였다. 더 나은 eGFP 신호 전달을 위해 염소 항-GFP 1차 항체와 Alexa 488 당나귀 항염소 2차 항체를 사용하여 eGFP 단백질을 염색하고 핵을 DAPI15로 염색했습니다. 이미지는 형광 현미경 상에서 20x 배율로 촬영하였다(도 2A). 다음으로, 4개월령 Cyp17-NuTRAP 마우스의 난소에서 TRAP을 수행하여 테카/기질 세포에서 리보솜 결합 ...

이 프로토콜에서 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법과 특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리(INTACT) 방법은 Cyp17a1-Cre 마우스 라인과 교차하는 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체와 후성유전체의 쌍을 이루는 조사에 최적화되었습니다.

Assessing cell-type-specific epigenomic and transcriptomic changes are key to understanding ovarian aging. To this end, the optimization of the ...

이 방법은 세포 분류를 할 필요 없이 동일한 마우스로부터 특정 난소 세포 집단으로부터 핵산을 분리하는 기술을 제공한다. 이 기술은 다양한 조건에서 특정 세포 집단이 어떻게 변화하는지 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 노화.이 기술의 주요 장점은 세포 분류 없이 특정 난소 세포 유형에서 쌍을 이루는 후성유전체학 및 전사체 분석을 허용한다는 것입니다. 이는 처리량을 크게 증가시키고 비용을 줄이며 난소 조직에서 세포 유형별 분석을 수행할 때 특수 장비가 필요하지 않습니다. 여기에서 우리의 목표는 여성 불임 치료에 영향을 미치는 생식 노화 이전에 난소 노화와 함께 발생하는 세포 유형별 변화를 확인하는 것입니다.이 방법은 세포 유형별 Cre 드라이버를 사용할 수 있는 신체 시스템 전반에 걸쳐 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 이 기술에서 가장 어려운 부분은 관심 있는 세포 유형에 적합한 Cre 라인을 선택하는 것입니다. 세포 특이성의 광범위한 검증이 권장됩니다.시작하려면 안락사 된 마우스에서 500 마이크로 리터의 핵 용해 완충액에서 난소 하나를 수집하고 자체 개방 마이크로 가위를 사용하여 완충액 내에서 난소를 8 부분으로 자릅니다. 다진 난소와 용해 완충액을 얼음에 유리 균질화기로 옮기고 느슨한 유봉 A.Add 용질 완충액으로 난소를 10-20회 균질화합니다. 균질액을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 1.5 분 동안 200g에서 원심 분리하여 해리되지 않은 조직과 혈관을 제거한다.100 마이크로리터의 용해 완충액으로 30 마이크로미터 셀 스트레이너를 사전 습윤시킨 후, 스트레이너를 통해 상청액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과한다. 혼합물을 함유하는 핵을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮긴다. 섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다.250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 핵 펠릿을 중등도에서 고속으로 잠시 볼텍싱하여 재현탁합니다. 1.5 밀리리터의 용해 완충액을 추가하여 부피를 최대 1.75 밀리리터까지 가져옵니다. 부드럽게 섞고 핵 현탁액을 5 분 동안 얼음 위에 놓습니다.섭씨 4도에서 5분 동안 500g에서 원심분리하여 핵을 펠릿화합니다. 그리고 핵 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버립니다. 펠릿을 200마이크로리터의 얼음 냉장 보관 완충액에 재현탁하고 잠시 소용돌이하여 핵 펠릿을 완전히 재현탁합니다.재현탁 펠릿의 10%를 다운스트림 분석을 위한 입력 핵 샘플로 예약합니다. 재현 탁 된 핵 팔레트를 가져 와서 얼음처럼 차가운 핵 정화 완충액 (NPB)으로 부피를 2 밀리리터로 구성하십시오. 각 샘플에 대해 30마이크로리터의 재현탁 비드를 2밀리리터 원형 바닥 튜브에 추가합니다.그런 다음 1 밀리리터의 NPB를 추가하고 피펫 팅으로 잘 재현 탁하십시오. 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 놓고 비드를 분리합니다. 상층액을 버리고 자석에서 튜브를 제거합니다.세척된 마그네틱 비드를 1밀리리터의 NPB에 재현탁합니다. 총 세 번의 세척 단계를 반복합니다. 그리고 최종 세척 후, NPB의 초기 부피에서 비드를 다시 현탁하십시오.세척된 비드 30마이크로리터를 2밀리리터의 핵 현탁액에 첨가하고 튜브를 피펫팅하고 부드럽게 뒤집어 비드 핵 혼합물을 잘 재현탁합니다. 튜브를 냉장실이나 냉장고의 회전 믹서에 저속으로 30분 동안 놓고 동일한 조건에서 비드 없이 입력 샘플을 배양합니다. 핵 현탁액과 비드가 있는 튜브를 자석에 3분 동안 놓아 스트렙타비딘 비드에 결합된 비오티닐화 핵을 핵의 음성 분획에서 분리합니다.상청액을 제거합니다. 음수 분수를 신선한 2 밀리리터 튜브에 통과시키고 얼음 위에 보관하십시오. 각 양성 분획 튜브에 대해 자석에서 튜브를 제거하고 1 밀리리터의 NPB에 내용물을 다시 현탁합니다.튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상층액을 버립니다. 양성 분획 비드 핵 혼합물을 30 마이크로리터의 NPB에 재현탁시킨다. 난소와 100 마이크로 리터의 균질화 완충액을 유리 dounce 균질 화기로 옮기고 느슨한 유봉 A.Add 400 마이크로 리터의 TRAP 균질화 완충액을 세척 유봉 A에 넣고 균질 액을 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.추가의 1 밀리리터의 TRAP 균질화 완충액으로 균질기를 세척하고, 세척된 부피를 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮긴다. 균질액을 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000g에서 원심분리한다. 그리고 깨끗해진 상청액을 새로운 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.펠릿을 버린 후, 100 마이크로 리터의 제거 된 균질 액을 새로운 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고 얼음에 입력으로 남겨 둡니다. 투명해진 균질액의 나머지 부분을 밀리리터당 5마이크로그램의 항-GFP 항체와 함께 섭씨 4도에서 1시간 동안 종단 믹서에서 회전시키면서 배양합니다. 동일한 조건에서 입력 샘플을 배양합니다.각 샘플에 대해 50 마이크로리터의 단백질 G 마그네틱 비드를 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 저염 세척 버퍼를 비드에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 1분 동안 놓아 튜브 측면에 비드를 모읍니다.상층액을 버린 후 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 1밀리리터의 저염 세척 버퍼를 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞이도록 피펫으로 만듭니다. 다시 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 총 3회 세척 단계를 반복합니다.최종 세척 후, 저염 세척 완충액의 초기 부피에 비드를 재현탁합니다. 재현탁된 세척된 비드를 항원 샘플 항체 혼합물로 옮기고 엔드 오버 엔드 믹서에서 회전하면서 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션합니다. 동일한 조건에서 하룻밤 동안 입력 샘플을 배양합니다.그 후, 2.5 내지 3분 동안 마그네틱 스탠드를 사용하여 음성 분획 또는 상층액으로부터 표적 리보솜 RNA와 함께 양성 분획 또는 자성 비드를 분리한다. 음수 분획을 흡인합니다. 신선한 2 밀리리터 둥근 바닥 튜브에 넣고 얼음 위에 따로 보관하십시오.500마이크로리터의 고염분 세척 버퍼를 양성 분획과 함께 튜브에 넣고 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 1분 동안 유지된 마그네틱 스탠드에 올려 놓아 비드를 분리합니다. 상층액을 버린 후 자석에서 튜브를 제거하고 총 3회 세척 단계를 반복합니다.최종 세척 후, 3.5 마이크로리터의 2-메르캅토에탄올로 보충된 350 마이크로리터의 RNA 용해 완충액에 비드를 재현탁시킨다. 디지털 셰이커에서 900RPM으로 10분 동안 혼합하면서 실온에서 튜브를 배양합니다. 표적 리보솜 RNA를 포함하는 용액에서 비드를 실온에서 1분 동안 자기 스탠드로 분리합니다.용출된 양성 분획을 새로운 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다. Cyp17-Cre 양성 NuTRAP flox 및 Cyp17-Cre 음성 NuTRAP flox 마우스의 파라핀화된 난소에서 면역형광 이미징을 수행했습니다. EGFP 단백질은 염소 항-GFP 1차 항체와 Alexa 488 당나귀 항염소 2차 항체를 이용하여 염색하였고, 핵은 DAPI로 염색하였다.이미지는 형광 현미경으로 20x 배율로 촬영되었습니다. 입력 및 TRAP 양성 분획 RNA를 Cyp17-Cre 양성 NuTRAP 플록스 마우스 난소에서 분리하고 쌍을 이루는 말단 방식으로 시퀀싱했습니다. 발현된 모든 유전자의 주성분 분석은 제1 성분에서 TRAP 입력과 양성 분획의 분리를 보여주었다.입력 분획과 양성 분획 사이에 차등적으로 발현된 유전자의 화산 플롯이 여기에 표시됩니다. 입력에 대한 TRAP 양성 분획의 비교는 TRAP 양성 분획에서 간질/세카 세포 마커 유전자의 전반적인 농축과 난모세포, 과립구, 면역 및 평활근 세포 마커 유전자의 고갈을 보여주었습니다. 해리되지 않은 혈관을 제거하기 위해 핵 현탁액의 첫 번째 원심 분리 후, 핵은 상청액에 있습니다.이 시점에서 상층액을 유지하고 펠릿을 폐기하십시오. 온전한 방법에 따라 염색질 접근성 또는 DNA 변형에 대한 분석을 포함하여 여러 후성유전체 기술을 수행할 수 있습니다. TRAP 방법에 따라 RT-qCPR 또는 RNA 시퀀싱을 수행하여 번역체를 평가할 수 있습니다.이것은 마우스 난소에서 NuTRAP 방법의 첫 번째 적용입니다. 이를 통해 특정 난소 세포 유형에서 고처리량 후성유전체학 및 전사체 분석이 가능하며, 이는 난소 노화 또는 암을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

cell-specific-paired-interrogation-mouse-ovarian-epigenome

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

Bisulfite의 돌연변이 유발이의 DNA methylation 분석을위한 황금 표준입니다. 우리 수정된 프로토콜은 단일 세포 수준에서 DNA의 methylation 분석을 허용하고 특별히 개별 oocytes를 위해 설계되었습니다. 또한 절단 단 배아 사용할 수 있습니다.

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

배우세요 마우스 난소 특정 세포군에서 후성유전체와 전사체를 동시에 분석하는 TRAP 및 INTACT 최적화 방법. 세포 분류 없이 노화 관련 세포 특이적 변화를 효율적으로 규명할 수 있습니다.

마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사

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