Name: 지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 학습하세요 지능형 고처리량 항균 감수성 검사 및 파지 스크리닝 시스템을 Salmonella에 적용하는 방법을. LAR 지수로 항생제 내성을 평가하고 수의학 모니터링 네트워크를 구축할 수 있습니다.

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이 작업은 국가 핵심 연구 개발 프로젝트(2019YFA0904003)의 지원을 받았습니다. 산동성의 현대 농업 산업 시스템(SDAIT-011-09); 국제 협력 플랫폼 최적화 프로젝트 (CXGC2023G15); 중국 산둥성 농업과학원 농업과학기술혁신사업의 주요혁신과제(CXGC2023G03).

이 연구에 사용된 살모넬라 균주는 중국 산둥성 농업과학원 동물과학 및 수의학 연구소 생물안전위원회의 승인을 받은 후 중국 산둥성의 가금류에서 수집되었습니다.
1. 지능형 고처리량 AST 시스템 적용8
<ol><li>접종 준비<ol><li>품질 관리 유기체 대장균과 93개의 살모넬라 균주를 배양하여 37°C에서 16-18시간 동안 Mueller-Hinton 한천(MHA) 플레이트에서 AST를 테스트합니다3.</li>
		<li>CLSI 표준3에 명시된 방법에 따라 0.5 McFarland 탁도 기준에 맞게 각 균주의 접종물을 준비한 후 10회 희석합니다.</li>
		<li>멸균 생리식염수 200μL를 96웰 플레이트의 수평 1차 웰(A1)에 음성 대조군으로 배치하고, 품질 관리 유기체의 두 가지 현탁액을 각각 양성 대조군으로 수평 2차 및 3차 웰(A2 및 A3)에 배치하고 품질 관리를 수행합니다. 테스트된 각 염색제의 희석된 접종 현탁액 200μL를 96웰 시드 블록의 해당 93웰에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항균 한천 플레이트의 제조<ol><li>Lar 지수의 계산 범위(0.125R에서 8R까지)에 따라 테스트한 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다. 농도 범위는 품질 관리 범위 또는 0.0625R(더 낮은 범위에 따름)에서 8R입니다. 알림: Lar 지수가 계산되지 않은 경우 AST의 필요에 따라 항생제 농도 범위를 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>CLSI 표준3에 지정된 한천 희석 방법에 따라 적절한 스톡 농도로 시작하여 항생제 용액에 대한 log2 이중 희석 계획을 실행합니다.</li>
		<li>18mL의 Mueller-Hinton 한천 배지가 들어 있는 50mL 유리병을 멸균합니다. 45-50 °C로 냉각된 용융 배지 18mL에 적절한 항균 용액 2mL를 희석하여 넣고 완전히 혼합한 다음 생물 안전 캐비닛의 플레이트에 붓습니다.</li>
		<li>한천이 실온(RT)에서 응고되도록 하고 배양된 접시의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 한천 표면을 건조시킨 후 접종합니다.</li>
		<li>항균제의 종류와 농도를 배양 플레이트의 뒷면에 표시하십시오. 각 항균제의 여러 배양 플레이트를 log2-doublebling 희석 순서로 스택에 배열합니다.</li>
		<li>각 항균제에 대한 대조군으로 두 개의 약물이 없는 한천 플레이트를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>96 도트 매트릭스 접종기의 접종 단계<ol><li>생물 안전 캐비닛의 96점 매트릭스 접종기 지지대에 고압멸균 접종 핀 플레이트를 설치합니다.</li>
		<li>테스트된 균주와 한천 배양 플레이트가 있는 준비된 시드 블록을 두 플레이트에 대해 동일한 위치 각도로 모바일 캐리어에 놓습니다.</li>
		<li>시드 블록이 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 이동 통신사를 밉니다.</li>
		<li>작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 96개의 핀을 종자 블록의 96웰에 있는 접종물에 향하게 합니다.</li>
		<li>제어 상태에서 작동 핸들을 놓은 다음 스프링의 작용으로 접종 핀 플레이트를 재설정합니다.</li>
		<li>작동 손잡이를 2-3회 눌러 각 접종물을 잘 저어주고 담그십시오. 배양된 플레이트가 접종 핀 플레이트 바로 아래에 오도록 캐리어 플레이트를 밀고 이동합니다.</li>
		<li>작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 아래로 이동한 다음 1-2초 동안 정지하여 접종 핀이 배양 플레이트의 표면에 완전히 닿도록 합니다.</li>
		<li>작동 핸들을 놓습니다. 이것으로 1회의 접종이 완료됩니다. 다른 배양 플레이트를 교체하고 한 그룹의 항균 한천 플레이트가 완성될 때까지 사이클을 계속합니다.</li>
		<li>다른 접종 핀 플레이트와 시드 블록을 교체하고 테스트된 다른 균주 그룹을 접종합니다. 모든 접종이 완료될 때까지 순환합니다. 알림: 대조군 한천 플레이트(항균제 없음)를 먼저 접종한 다음 약물 농도가 낮은 것부터 높은 것까지 플레이트를 접종하고 두 번째 대조군 한천 플레이트를 마지막에 접종하여 오염 또는 항균제 이월이 없도록 합니다. 접종 부피는 약 2μL의 각 핀의 자연 증착 부피에 의존합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항균 한천 플레이트 배양<ol><li>접종 지점의 수분이 한천에 흡수될 때까지 접종된 항균 한천 플레이트를 RT에서 배양합니다.</li>
		<li>플레이트를 뒤집고 테스트된 균주에 대해 37°C에서 16-20시간 동안 배양하여 억제되지 않은 박테리아가 콜로니를 형성하도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 수집 및 데이터 통계<ol><li> 96 도트 매트릭스 AST 이미지 수집 시스템을 두 번 클릭하여 프로그램을 엽니다.</li>
		<li>작업 표시줄에서 테스트 정보를 클릭합니다. 새로 만들기 를 클릭하여 새 테스트 작업을 만들고 프롬프트에 따라 코드, 이름, 출처, 박테리아, 균주 수, 항생제 및 그래디언트를 포함한 정보를 입력합니다.</li>
		<li>데이터 수집&gt; 사진 &gt; 테스트 항목을 클릭하여 생성된 새 작업을 선택합니다. 항생제(Antibiotics)를 클릭하여 항생제의 이름을 선택하고 그라데이션(Gradient)을 클릭하여 이 항생제의 초기 농도를 선택합니다.</li>
		<li>Connect( 연결 )를 클릭하여 이미지 획득 변환기와 연결합니다.</li>
		<li>해당 배양된 플레이트를 검출 플레이트 베이스에 놓고 방향을 위해 오른쪽 전면에 누락된 각도를 두고 이미지 획득 변환기에 밀어 넣습니다.</li>
		<li>컬렉션을 클릭하여 이미지를 가져옵니다. 항생제 그라데이션은 자동으로 다음 그라데이션으로 이동합니다. 다음 플레이트를 차례로 놓고 이 항생제의 플레이트가 수집될 때까지 수집을 계속 클릭합니다.</li>
		<li>Antibiotics(항생제)를 클릭하고 다음 배양 플레이트 세트를 선택합니다. 그라디언트를 클릭하여 시작 그라디언트를 선택하고 이미지 컬렉션의 다음 라운드로 진행합니다.</li>
		<li>모든 수집을 완료한 후 제출을 클릭합니다. 이 프로그램은 이미지의 각 접종 지점에서 포맷된 흰색 픽셀의 수를 자동으로 인식하고 콜로니 형성이 있는지 확인하고 이미지를 MIC 값으로 변환합니다.</li>
		<li>Query( 쿼리 )를 클릭하면 테스트된 항생제에 대한 균주의 모든 MIC 결과를 얻을 수 있습니다. 참고: 지능형 고처리량 AST 시스템은 대규모 박테리아 균주의 MIC를 결정하는 데 적합합니다. 준비, 접종, 배양 및 결과 판독을 포함한 테스트 과정은 3일이 소요됩니다. 항생제의 종류와 MIC 검출 범위는 각각의 필요에 따라 설정할 수 있으며 주요 소모품을 재사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lar 지수 계산<ol><li>다음 공식을 사용하여 Lar 지수를 정확하게 결정하십시오. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64785/64785eq01.jpg" style="margin: auto;"> MICi: 최소 억제 농도. MIC-3에서 MIC3까지의 MIC 분포 범위는 R을 중심으로 한 직렬 2중 농도(0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R 및 8R)를 나타냅니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64785/64785eq02.jpg" style="margin: auto;"> 는 2 i이고,i의 범위는 -3 내지 3이다. R : CLSI에 의해 표준화 된 항균제에 대한 박테리아의 내성 중단 점. f: MIC 주파수 분포. 참고: 일반 Lar 지수는 모든 Lar 지수의 산술 평균입니다. Lar 지수를 계산한 후 최종 값을 소수점 뒤의 유효 두 자리로 반올림합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 지능형 고처리량 파지 스크리닝 시스템9
<ol><li>파지 종자 블록과 박테리아를 포함하는 이중층 배양 플레이트를 준비합니다.<ol><li>다른 파지를 만들기 위해 이중층 한천 방법10 또는 액체 배양 방법11 을 사용하십시오. 1 x 104-5 pfu/mL의 역가를 사용하여 적절한 병렬 농도로 희석하고 200μL의 파지 접종물을 96웰 종자 블록에 추가합니다.</li>
		<li>테스트할 박테리아(10mL의 하단 한천 배지[한천 12g/L] 및 6mL의 상부 세미 한천 배지[6g/L]와 100μL의 박테리아[0.5 McFarland])가 있는 이중층 플레이트를 만듭니다.</li>
		<li>테스트할 각 균주에 대해 이중층 배양 플레이트를 만듭니다. 이중층 플레이트의 뚜껑 아래에 틈을 두고 불어서 생물 안전 캐비닛의 한천 표면을 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>선별 검사<ol><li>준비된 파지 종자 블록과 이중층 플레이트를 96점 매트릭스 접종기의 이동 캐리어에 놓고 모든 파지 접종물을 반한천 표면으로 옮깁니다. 테스트된 모든 균주가 완료될 때까지 사이클을 계속합니다.</li>
		<li>접종 부위의 수분이 반 한천에 완전히 흡수 될 때까지 접종 된 이중층 플레이트를 RT에 유지하십시오.</li>
		<li>플레이트를 뒤집고 4-6시간 동안 테스트된 균주에 적합한 조건에서 배양하여 명확한 용해 반점이 형성되도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석<ol><li>이미지 획득 변환기(1.5.4-1.5.6단계)를 사용하여 각 이중층 플레이트의 실험 결과 이미지를 얻고 저장합니다.</li>
		<li>획득한 이미지를 기반으로 다양한 모양의 반점의 수와 형태를 스프레드시트에 기록하고 다양한 종류의 파지의 각 비율을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Yuqing Liu et al.은 96도트 매트릭스 접종기 및 이미지 획득 컨버터 및 그 응용 분야에 대한 중국 특허를 출원했습니다(특허 번호 ZL 201610942866.3 및 특허 번호 ZL 201910968255.X).

한천 희석 방법은 잘 확립되어 널리 사용되고 있습니다. 고처리량 AST 시스템의 원리는 한천 희석 방법의 원리였습니다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 중 하나는 한 번에 96개의 접종물을 정확하게 고처리량으로 이전하는 것이었고, 이는 연속으로 여러 번 수행되었습니다. 이 중요한 단계를 완료하기 위해 96 도트 매트릭스 접종기의 핀은 균일하고 매우 매끄러웠습니다. 각 핀의 자연 증착은 약 2μL의 부피였으며, 이는 한천 매체 표면의 작은 물방울로 응집되어 한천으로 빠르게 흡수되어 흐르거나 튀어 교차 오염을 일으키지 않았습니다. 두 번째 중요한 단계는 대규모 AST 데이터의 통계적 처리였습니다. 고처리량 접종의 경우 테스트 데이터를 결정해야 했고 작업량도 엄청났습니다. 지능형 이미지 수집 컨버터 및 지원 소프트웨어에 의해 생성된 지능형 분석 및 통계 결과는 이 문제에 대한 완벽한 솔루션이었습니다. AST 결과는 자동으로 Varms 데이터베이스에 직접 업로드되었습니다. 결과 해석의 효율성과 정확성이 향상되고 인적 요인으로 인한 오류가 ...

세균성 전염병을 예방하기 위해 항생제가 널리 사용됨에 따라 항생제 내성(AMR)은 전 세계적인 공중 보건 문제가 되었습니다1. 항생제 내성 퇴치는 역학적 병원체의 항생제 내성 모니터링과 민감한 항균제 및 용해성 박테리오파지의 시너지 요법의 현재 주요 임무이다2.
체외 항생제 감수성 검사(AST)는 요법을 모니터링하고 항생제 내성 수치를 감지하기 위한 핵심입니다. 이는 항균 약리학의 중요한 부분이며 임상 약물의 중요한 기초입니다. 미국의 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)와 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)는 AST의 국제 기준을 공식화 및 개정하고 AST 방법 및 중단점을 지속적으로 수정 및 보완하여 특정 "유기체-항균제" 조합의 MIC를 민감성(S), 내성(R) 또는 중간체(I)로 결정합니다.3, 4입니다.
1980년대부터 1990년대까지 자동 마이크로 브로트 희석 기기가 빠르게 개발되어 임상 실습에 적용되었으며, Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM 및 Cobasbact 5,6,7 등이 그 예입니다. 그러나 이러한 기기는 고가의 소모품이 필요하고 검출 범위는 임상 환자 약물 5,6,7을 위해 설계되었습니다. 이러한 이유로 수의학 임상 검사 및 대량의 고내성 균주 검출에는 적합하지 않습니다. 이 연구에서는 96도트 매트릭스 접종기(그림 1), 이미지 획득 변환기(그림 2) 및 해당 소프트웨어8을 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템을 개발하여 한천 희석 방법으로 한 번에 여러 항균제에 대해 박테리아 균주 배치에 대해 AST를 수행했습니다. 또한, 이 시스템은 항생제 내성 박테리아9에 대한 파지의 용해 패턴을 검출하고 분석하는 데에도 사용되었으며, 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 선택했습니다. 이 시스템은 효율적이고 저렴하며 작동하기 쉬운 것으로 밝혀졌습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig01.jpg"> 그림 1: 96 도트 매트릭스 접종기의 구조도. 1: 접종 핀 플레이트; 2: 이동 통신사; 3 : 시드 블록; 4 : 배양 된 판; 5: 베이스; 6 : 작동 핸들; 7: 한계 핀. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64785/64785fig02.jpg"> 그림 2: 이미지 획득 컨버터의 구조도. 1: 쉘; 2 : 디스플레이 화면; 3 : 이미지 획득실; 4 : 검출 보드 베이스 ; 5: 창고 안팎의 감지 보드; 6 : 제어반 ; 7 : 영상 취득 변환 장치; 8 : 광원; 9: 이미지 스캐너. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64785/64785fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>96 웰&nbsp; 배양 플레이트</td><td>베이징 lanjieke Technology Co., Ltd</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>96-도트 매트릭스 AST 이미지 획득 시스템</td><td>산둥 농업 과학 아카데미 동물 과학 및 수의학 연구소</td><td>사내 소프트웨어 저작권</td><td></td></tr><tr><td>96-도트 매트릭스 접종기&nbsp;</td><td>산둥 농업 과학 아카데미 동물 과학 및 수의학 연구소</td><td>N/A</td><td>특허 제품</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd</td><td>HB8274-1</td><td></td></tr><tr><td>Amikacin&nbsp;</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>A857053</td><td></td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>A822839</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>A830931</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td></td></tr><tr><td>AMR의 Lar 지수에 대한 자동 계산 소프트웨어</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>사내 소프트웨어 Copyright</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria Salmonella strains</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>N/A</td><td>Animal origin</td></tr><tr><td>Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0</td><td>산동 농업 과학 아카데미 동물 과학 및 수의학 연구소</td><td>사내 소프트웨어 저작권</td><td></td></tr><tr><td>Ceftiofur</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>C873619</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>C824343</td><td></td></tr><tr><td>Clavulanic acid</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>C824181</td><td></td></tr><tr><td>Clean worktable</td><td>Suzhou purification equipment Co., Ltd</td><td>SW-CJ-2D</td><td></td></tr><tr><td>콜리스틴 설페이트</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>C805491</td><td></td></tr><tr><td>Culture plate</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>N/A</td><td>특허 제품</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td></td><td></td>D832390</tr><tr><td>Enrofloxacin</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>E809130</td><td></td></tr><tr><td>필터 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Florfenicol</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>F809685</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>G810322</td><td></td></tr><tr><td>유리병 50mL</td><td>Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd</td><td>QX-7</td><td></td></tr><tr><td>고처리량 저항 감지 시스템 V1.0</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>사내 소프트웨어 저작권</td><td></td></tr><tr><td>이미지 취득 변환기</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>N/A</td><td>특허 제품</td></tr><tr><td>Meropenem</td><td>Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd</td><td>M861173</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton 한천</td><td>칭다오 하이테크 산업 단지 Haibo Biotechnology Co., Ltd</td><td>HB6232</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 60mm x 15mm</td><td>칭다오 Jindian 생화학 장비 유한 회사</td><td>16021-1</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 90mm x 15mm</td><td>칭다오 Jindian 생화학 장비 유한 회사</td><td>16001-1</td><td></td></tr><tr><td>살모넬라 phages</td><td>동물 과학 및 수의학 연구소, 산동 농업 과학 아카데미</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd</td><td>MQD-S2R</td><td></td></tr><tr><td>탁도계</td><td>Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd</td><td>F-TC2015</td><td></td></tr><tr><td>Varms 기본 유형 라이브러리 시스템 V1.0</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>사내 소프트웨어 copyright</td><td></td></tr><tr><td>수직 고압 증기 살균기</td><td>상하이 Shen'an 의료 기기 공장</td><td>LDZX-75L</td><td></td></tr><tr><td>수의 병원체 내성 테스트 관리 시스템</td><td>동물 과학 및 수의학 연구소, 산동 농업 과학 아카데미</td><td>사내 소프트웨어 저작권</td><td></td></tr><tr><td>수의학 내성 구름 모니터링 및 파지 제어 플랫폼 V1.0</td><td>Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences</td><td>사내 소프트웨어 저작권</td><td></td></tr></tbody></table>

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 lar 지수

Application of the Intelligent High-Throughput Antimicrobial Sensitivity Testing/Phage Screening System and Lar Index of Antimicrobial Resistance

내성 박테리아에 대한 항균제 감수성 검사(AST) 및 파지 고처리량 스크리닝의 효율성을 개선하고 검출 비용을 줄이기 위해 96도트 매트릭스 접종기, 이미지 획득 변환기 및 해당 소프트웨어를 포함한 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 AST 기준 및 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)에서 공식화한 내성(R) 중단점에 따라 개발되었습니다. 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 1,500개의 살모넬라 균주의 최소 억제 농도(MIC) 분포(R/8에서 8R까지)와 10개의 항균제에 대한 통계는 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템에 의해 수행되었습니다. "항생제가 적고, 내성이 적고, 항생제가 거의 없을 때까지 잔류한다"는 의미의 Lar 지수는 각 MIC의 가중 평균을 계산하고 R로 나누어 구했습니다. 이 접근법은 내성이 강한 균주의 항생제 내성(AMR) 정도를 특성화하기 위해 내성 유병률을 사용하는 것과 비교하여 정확도를 향상시킵니다. AMR이 높은 살모넬라 균주의 경우, 이 시스템에 의해 파지 라이브러리에서 용해 파지를 효율적으로 스크리닝하고 용해 스펙트럼을 계산 및 분석했습니다. 그 결과 지능형 고처리량 AST/파지 스크리닝 시스템이 작동 가능하고, 정확하고, 매우 효율적이며, 저렴하고, 유지 관리가 용이하다는 것을 보여주었습니다. 산둥성 수의학 항생제 내성 모니터링 시스템과 결합된 이 시스템은 AMR과 관련된 과학 연구 및 임상 검출에 적합했습니다.

지능형 고처리량 AST 시스템의 프로토콜에 따라 중국 산둥성 가금류의 살모넬라균 을 예로 들 수 있습니다.
이미지 획득 변환기에 의해 측정된 2 - 256 μg/mL 농도에서 암피실린(R 32 μg/mL)이 포함된 한천 플레이트에서 살모넬라 균주의 성장은 그림 3에 나와 있습니다. 수평 1st웰 A1은 음성 대조군이었고 콜로니 성장을 보여주지 않았습니다. A2 및 A3은 CLSI(2-8μg/mL)에 의해 표준화된 품질 관리 범위 내에서 MIC 4μg/mL(2μg/mL 암피실린으로 한천 플레이트에 콜로니를 형성하지만 4μg/mL의 암피실린에는 형성되지 않음)를 사용한 품질 관리 균주였습니다. A4의 살모넬라 균주의 MIC는 64μg/mL인 반면, A5의 MIC는 16μg/mL였습니다. 암피실린에 대한 93개의 살모넬라 균주의 MIC 분포는 소프트...

여기에서는 지능형 고처리량 항균 감도 검사/파지 스크리닝 시스템의 원리, 구조 및 지침을 소개합니다. 그 응용은 중국 산둥성의 가금류에서 분리한 살모넬라균 을 예로 들어 설명합니다. Lar 지수를 계산하고 항생제 내성 평가에 대한 중요성을 종합적으로 논의합니다.

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

To improve the efficiency of antimicrobial susceptibility testing (AST) and phage high-throughput screening for resistant bacteria and to reduce the ...

이 프로토콜은 EST 검출과 파지 수치 모두에 대한 다단계 방법을 제공합니다. 또한 다양한 제어 기술의 EMR 수준을 비교하기 위해 저장에 대한 큰 인덱스를 도입했습니다. 이 비용 효율적인 기술은 지능적이고 처리량이 높으며 다기능입니다.그것은 VAMS의 설립을 가능하게 했다 20, 000의 전염병 유전자 및 분석적인 파지를 모은 수의 감시 네트워크. 이 방법은 의학, 농업, 동물 심장 배터리 및 어업에서 병원성 박테리아를 모니터링하고 제어하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜과 이 회사 논문은 다음을 제공해야 합니다.우리는 기술 교육 가이드와 함께. 그것을 따르면 누구나 짧은 시간에 기술을 마스터하는 데 도움이 될 것입니다. 품질 관리 유기체인 대장균과 93개의 테스트 살모넬라 균주를 Mueller-Hinton 한천 플레이트에서 배양하는 것으로 시작합니다.다음으로, 각 균주의 제조된 접종물을 10회 희석한다. 200마이크로리터의 멸균 생리식염수를 음성 대조군으로 96웰 플레이트의 a-1 웰로 옮깁니다. 그런 다음 대장균 현탁액 2개를 a-2 및 a-3 웰에 각각 양성 및 품질 관리로 피펫팅합니다.나머지 93개의 웰에 희석된 테스트 균주 200마이크로리터를 추가합니다. 항균 한천 플레이트의 제조용. 먼저 LAR 지수에 따라 테스트 중인 다양한 항균제의 농도 범위를 설정합니다.CLSI 표준 한천 희석 방법에 따라 항생제 용액에 대해 log-two doublebling 희석 계획을 수행합니다. 이제 18ml의 용융된 Mueller-Hinton 한천 배지가 들어 있는 멸균된 유리병에 2ml의 항균 용액을 추가합니다. 완전히 혼합한 후 생물 안전 캐비닛 내부의 플레이트에 붓습니다.한천이 실온에서 응고되도록 합니다. 한천 표면이 건조될 수 있도록 접시 뚜껑 아래에 틈을 두십시오. 항균제의 종류와 각각의 농도를 배양 플레이트의 밑면에 표시하십시오.각 항균제에 대해 여러 개의 배양된 플레이트를 로그 2배 희석 순서로 정렬된 스택에 배열합니다. 마지막으로, 각 약제에 대한 대조군 역할을 할 두 개의 약물이 없는 한천 플레이트를 준비합니다. 생물 안전 캐비닛 내의 96 도트 매트릭스 접종기 지지대에 멸균된 접종 핀 플레이트를 설치합니다.다음으로, 준비된 종자 블록을 테스트 된 균주와 한천 배양 플레이트를 이동 통신사에 배열합니다. 시드 블록이 접종 핀 플레이트 아래에 올 때까지 이동 통신사를 밉니다. 이제 작동 핸들을 누르고 접종 핀 플레이트를 내려 96개의 핀을 종자 블록의 96개 웰에 있는 접종 쪽으로 안내합니다.제어된 방식으로 작동 핸들을 풀고 접종 핀 플레이트를 자동으로 재설정하여 각 접종물을 잘 저어주고 담그고 작동 핸들을 2-3회 누릅니다. 그런 다음 캐리어 플레이트를 이동하여 배양 플레이트가 접종 핀 플레이트 아래에 오도록 합니다. 작동 손잡이를 아래로 눌러 접종 핀 플레이트를 내리고 1-2초 동안 그대로 두어 배양된 플레이트의 표면에 완전히 닿도록 합니다.작동 핸들을 놓으면 1회 접종이 완료됩니다. 배양된 플레이트를 교체하고 항균 한천 플레이트 배치가 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다. 새로운 접종 핀 플레이트와 시드 블록으로 전환하여 테스트된 균주의 다른 그룹을 접종합니다.접종 부위의 수분이 한천에 완전히 흡수될 때까지 접종된 항균 한천 플레이트를 실온에서 배양합니다. 배양 후 플레이트를 뒤집고 배양을 계속하여 억제되지 않은 박테리아가 군체를 형성할 수 있도록 합니다. 이미지 수집 및 데이터 통계를 수행하려면 먼저 96 도트 매트릭스 AST 이미지 수집 시스템을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.작업 표시줄에서 테스트 정보를 선택합니다. 새로 만들기를 클릭하여 새 테스트 작업을 만들고 필요한 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 데이터 수집을 누른 다음 사진 및 테스트 항목을 눌러 새로 생성된 작업을 선택합니다.항생제 이름을 선택하려면 항생제를 선택하고 초기 농도를 선택하려면 그라데이션을 선택합니다. 마지막으로 연결을 클릭하여 이미지 획득 변환기와 연결합니다. 다음으로, 배양된 플레이트를 검출 플레이트 베이스에 놓고 이미지 획득 변환기에 삽입합니다.컬렉션을 클릭하면 플레이트의 이미지를 캡처할 수 있습니다. 항생제를 누르고 다음 플레이트 세트를 선택하십시오. 그라디언트를 선택하여 시작 그라디언트를 식별한 후 다음 이미지 컬렉션 라운드로 진행합니다.submit(제출)을 클릭하여 콜로니 형성을 결정하고 이미지를 최소 억제 농도, 즉 MIC 값으로 변환하여 절차를 마무리합니다. 쿼리를 클릭하여 모든 MIC 결과에 액세스합니다. 이중층 한천 방법을 활용하여 다양한 파지를 생산하는 것으로 시작합니다.파지를 적절한 평행 농도로 희석하고 200 마이크로 리터의 파지 접종물을 96 웰 시드 블록에 첨가합니다. 다음으로, 검사할 각 균주에 대해 이중층 배양 플레이트를 준비합니다. 건조를 위해 이중판의 뚜껑 아래에 틈을 두십시오.준비된 파지 시드 블록과 이중층 플레이트를 96도트 매트릭스 접종기의 이동체에 놓습니다. 모든 파지 inocular 를 semi agar 표면으로 옮깁니다. 모든 안구 수분이 반 한천에 흡수될 때까지 플레이트를 실온에 두십시오.이제 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 테스트된 균주를 위해 플레이트를 배양합니다. 이미지 획득 변환기를 사용하여 각 더블 레이어 플레이트의 실험 결과 이미지를 얻고 저장합니다. 획득한 이미지를 기반으로 스프레드시트에 다양한 스폿 모양의 수와 형태를 기록하고 다양한 유형의 파지의 각 비율을 계산합니다.암피실린이 함유된 플레이트에서 살모넬라균 성장에 대한 형태학적 연구는 a-1의 음성 대조군이 성장을 보이지 않는다는 것을 보여주었습니다. a-4에서 살모넬라 균주의 MIC는 밀리리터당 64마이크로그램인 반면, a-5의 MIC는 밀리리터당 16마이크로그램이었습니다. 암피실린, 시프로플록사신, 아목시실린-클라불란산의 저항성 백분율 값은 50% 이상이었고, 독시사이클린, 플로르페니콜, 세포탁심 및 엔로플록사신의 저항성 값은 30%에서 50%로 나타났으며, 겐타마이신, 아미카신, 메로페넴은 30% 미만의 저항성 백분율 값을 보였으며, 시프로플록사신과 아목시실린-클라불란산의 LAR 지수는 유의하게 지연되었다.이중층 플레이트에서 살모넬라균 성장의 형태학적 분석은 파지의 4가지 주요 반점 형태가 관찰되었음을 보여주었습니다. 둥글고 투명한 용해 반점은 접시 위의 숙주를 안정적으로 죽일 수 있는 파지에서 나온 것이지만 숙주의 비용으로 성공적으로 복제될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 명판의 수집은 진정한 명판으로 형성되었습니다.탁한 용해 반점은 플레이트에서 숙주를 안정적으로 죽이지 않고 숙주를 희생시켜 성공적으로 복제할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 파지로 인해 발생했습니다. 용해 반점이 없는 것은 비용해 특성을 나타냅니다. 이 기술은 한 번에 96개의 한천 렌즈를 효율적으로 쉽게 전송하고 기기가 자동으로 이미지를 인식한 다음 라인 주사위를 계산합니다.이 기술은 파지의 연구와 산업화를 촉진할 것으로 예상되며 파지의 적용은 AMR 문제를 줄이고 해결하는 놀라운 방법 중 하나입니다.

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세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

출처: 페린밤, K., 시리아폰, A. 아메바를 이용한 신속 영상 기반 박테리아 병원성 분석. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 아메바를 표면에 부착된 박테리아나 플랑크톤성 박테리아와 함께 배양하고, 칼세인-아세톡메틸 에스터(칼세인-AM) 아가로스 패드를 적용하며, 형광 영상을 이용해 숙주 세포 손상을 감지하는 빠른 이미지 기반 탐지 방법을 시연합니다.

표면에서 유도된 박테리아 병원성 스크리닝을 위한 신속한 영상 기반 분석

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

우리는 다른 박테리아에 대한 억제성 화합물의 생산을 위해 박테리아 배양을 스크리닝하는 간단한 방법을 설명합니다.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

이 프로토콜은 박테리오파지 칵테일의 항균 효능을 선별하기 위해 고처리량 설정을 사용하는 강력한 방법을 설명합니다.

높은 처리량 설정을 통해 평가된 식인성 병원체의 생물통제에 대한 박테리오파지 효과

여기에서는 물에서 항생제 내성 박테리아의 분리 및 식별과 항생제 내성 유전자(ARG)의 분자 특성 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 배양 기반 및 비배양 기반(메타게놈 분석) 기술을 사용하면 인도 뭄바이의 담수에 존재하는 다양한 ARG의 총 박테리아 다양성과 총 풀에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

이 프로토콜을 통해 숙주에 대한 프로파지의 영향을 밝힐 수 있습니다. 박테리아 배양은 용원 상태를 가장 잘 지원하는 조건을 사용하여 동기화되어 자발적 유도를 제한합니다. RT-qPCR은 프로파지 제한 유전자 및 파지 제어에서 결합되지 않은 유전자를 용해 복제 주기 동안 발현되는 유전자와 명확하게 구별합니다.

전사체학(transcriptomics)을 통한 온대 박테리오파지가 라이소겐에 미치는 영향 이해

학습하세요 지능형 고처리량 항균 감수성 검사 및 파지 스크리닝 시스템을 Salmonella에 적용하는 방법을. LAR 지수로 항생제 내성을 평가하고 수의학 모니터링 네트워크를 구축할 수 있습니다.

지능형 고처리량 항균 감수성 검사/파지 스크리닝 시스템 적용 및 항생제 내성 LAR 지수

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