Name: Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 포리-트랜스펙션을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발 방법입니다. 포유류 세포에서 다양한 DNA 비율을 단일 웰에서 테스트하고 유세포 분석으로 출력을 측정하여 유전자 회로의 복잡한 관계를 효율적으로 특성화할 수 있습니다.

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우리는 폴리 형질 주입 방법 및 세포 분류제에 대한 적용을 주도하거나 기여한 전 Weiss Lab 구성원 인 Jeremy Gam, Bre DiAndreth 및 Jin Huh에게 감사드립니다. 추가 분석법 개발/최적화에 기여한 다른 Weiss 연구소 구성원: Wenlong Xu, Lei Wang 및 Christian Cuba-Samaniego; Josh Leonard 교수와 Patrick Donahue 및 Hailey Edelstein을 포함한 그룹 구성원은 poly-transfection을 테스트하고 피드백을 제공했습니다. 그리고 이 원고를 초대하고 피드백을 제공한 Nika Shakiba 교수. 또한 국립 보건원 [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]에도 감사드립니다. 국립 과학 재단 [1745645]; 이 작업에 자금을 지원하기 위해 NCI 및 국립 보건원 [P30GM14051]의 암 센터 지원 (핵심) 보조금 [P50CCA14051, 부분적으로].

참고: 표 1 과 표 2 는 이 프로토콜에 대한 중요한 참조 역할을 합니다. 표 1 은 반응에 대한 시약 스케일링을 보여주고, 표 2 는 프로토콜에 기술된 폴리형질감염의 예(상반부) 및 가능한 후속 실험(하반부)에 대한 DNA 비율 산술을 나타낸다.
1. 형질주입을 위한 세포 준비
<ol><li>프로토콜을 시작하기 전에 인간 배아 신장(HEK293) 세포의 배양이 60%-80% 융합되는지 확인합니다. 이렇게 2일 전에 100 mm x 15 mm 조직 배양 페트리 디쉬에6 x 10 세포를 시딩하고, 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다. 참고: 당사의 프로토콜은 HEK293 세포에 중점을 두고 있지만 다른 세포 유형으로 대체될 수 있습니다.</li>
	<li>형질주입을 위한 배지 및 세포를 하기에 기재된 바와 같이 준비한다.<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 비필수 아미노산(NEAA; 재료 표 참조)을 갖는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)의 용액을 최소 20 mL 37°C로 예열한다. 적어도 2.4 mL의 트립신 및 2.4 mL의 인산염 완충 식염수 (PBS)를 37°C로 예열한다. 예열은 혈청 배지를 ~16°C로 감소시켰습니다. 알림: 모든 조직 배양 작업은 생물 안전 캐비닛에서 주의해서 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 대로 DMEM 용액에서 세포를 재현탁합니다.<ol><li>현재 미디어를 흡인하고 폐기하십시오. HEK293 세포 배양액에 PBS 2mL를 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.</li>
		<li>HEK293 세포 배양액에 트립신 2mL를 분주합니다. 페트리 접시를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 접시를 생물 안전 캐비닛으로 되돌리고 8mL의 DMEM 용액을 플레이트에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.</li>
		<li>부드럽게 위아래로 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 배지를 흡인하고(세포를 흡인하지 않도록 주의) 폐기합니다. 5mL의 DMEM 용액에 세포를 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
	<li>자동화된 세포 계수기( 재료 표에 나열됨)를 사용하여 현재 세포 농도를 추정합니다. 1 x 105 세포(50,000 cells/cm2의 파종 밀도의 경우)가 있는 24웰 플레이트에 6개의 웰(이 예에서)을 시드합니다.</li>
	<li>DMEM 용액을 최대 500μL까지 추가하고(먼저 웰에 DMEM 용액 추가) 처리당 하나의 웰에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어 및 폴리-형질감염 1로 라벨을 붙입니다. TagBFP, mKO2 및 NeonGreen 대조군 웰은 폴리 트랜스펙션에 포함된 모든 형광 단백질에 대한 단색 대조군입니다.</li>
</ol>2. 형질주입 수행
<ol><li>각 DNA 응집체에 대한 튜브를 준비하십시오. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 따로 보관하고 튜브에 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, NeonGreen 제어, 모든 색상 제어, 폴리 트랜스펙션 믹스 1 및 폴리 트랜스펙션 믹스 2로 라벨을 붙입니다.<ol><li>36μL의 환원된 혈청 배지를 무색 대조군, mKO2 대조군, TagBFP 대조군, NeonGreen 대조군 및 모든 색상 대조군 튜브에 추가합니다. 18 μL의 환원된 혈청 배지를 각각의 폴리형질주입 믹스 1 및 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다. 참고: 플라스미드 농도는 150ng/μL로 가정합니다.</li>
		<li>600ng의 필러 플라스미드를 무색 조절 튜브에 추가합니다. mKO2 색상 제어 튜브에 mKO2 300ng과 필러 플라스미드 300ng을 추가합니다. 300ng의 TagBFP와 300ng의 필러 플라스미드를 TagBFP 색상 제어 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>300ng의 구성적 NeonGreen 플라스미드와 300ng의 필러 플라스미드를 NeonGreen 색상 제어 튜브에 추가합니다. mKO2, TagBFP 및 구성 NeonGreen의 각각 100ng과 필러 플라스미드 300ng을 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>150ng의 mKO2를 폴리형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다. 75ng의 리포터 NeonGreen 플라스미드와 75ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 1 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>150ng의 TagBFP를 폴리형질주입 믹스 2 튜브에 추가합니다. 75 ng의 L7ae 플라스미드 및 75 ng의 필러 플라스미드를 폴리-형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.</li>
	</ol></li>
	<li>216 μL의 환원된 혈청 배지와 9.48 μL의 형질주입 시약을 결합하여 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 만듭니다(시약 비율 및 반응 스케일링은 표 1 참조). 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 따로 보관합니다.</li>
	<li>1.58μL의 인핸서 시약을 각각 색상 제어 없음, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 79 μL의 인핸서 시약을 각각의 폴리-트랜스펙션 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.</li>
	<li>DNA가 들어 있는 각 튜브에 형질주입 마스터 믹스를 추가합니다.<ol><li>37.58μL의 transfection 마스터 믹스를 각각 무색 제어, 단일 색상 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.</li>
		<li>18.79 μL의 형질주입 마스터 혼합물을 각각의 폴리-형질주입 믹스 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형질주입 믹스를 웰 내로 분배한다.<ol><li>65.97 μL의 각 형질주입 혼합을 무색, 단색 및 모든 색상 대조군을 상응하는 웰에 피펫팅합니다.</li>
		<li>32.98 μL의 폴리형질주입 피펫을 폴리형질감염 웰 내로 혼합하고, 복합체를 효과적으로 분배하기 위해 평평한 표면을 따라 타이트한 8자형 패턴으로 플레이트를 신속하지만 부드럽게 소용돌이친다. 이어서, 32.98 μL의 폴리형질주입 혼합된 2를 동일한 폴리형질주입 웰 내로 피펫팅하고 동일한 방식으로 플레이트를 소용돌이친다.</li>
	</ol></li>
	<li>플레이트를 37°C의 인큐베이터에 5%CO2 로 진탕하지 않고 48시간 동안 두었다. 참고: 세포 생존율을 높이기 위해 형질주입 후 6시간마다 세포 배지를 교체할 수 있습니다(항상 필요한 것은 아니지만 HEK293 세포 및 그 유도체의 경우 배지를 교체할 때 플레이트에서 세포를 분리하지 않도록 주의해야 함).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td colspan="3">분량</td>
			<td colspan="3">스케일링</td>
		</tr><tr><td>DNA 혼합물에 대한 혈청 배지 감소</td>
			<td colspan="3">대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL</td>
			<td colspan="3">튜브당 혈청 배지/ng DNA 0.05μL 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피</td>
		</tr><tr><td>DNA (유전자)</td>
			<td colspan="3">튜브 당 300-600 ng</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>P3000 (영문)</td>
			<td colspan="3">대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL</td>
			<td colspan="3">튜브당 0.0022 μL P3000/ng DNA, 10-20% 추가</td>
		</tr><tr><td>Lipo 마스터 믹스를 위한 환원된 혈청 배지</td>
			<td colspan="3">대조군 튜브당 36 μL, 폴리-트랜스펙션 튜브당 18 μL</td>
			<td colspan="3">0.05 μL의 혈청 배지/ng 총 DNA 감소, 피펫팅을 설명하기 위해 10-20% 추가 부피</td>
		</tr><tr><td>형질주입 및 인핸서 시약</td>
			<td colspan="3">대조군 튜브당 1.58 μL, 폴리 트랜스펙션 튜브당 0.79 μL</td>
			<td colspan="3">0.0022 μL 리포펙타민 3000/ng DNA, 10-20% 추가</td>
		</tr></tbody></table>표 1: transfection을 위한 시약 스케일링. 이 표는 단일 웰에 포함된 DNA 양에 대해 포함할 시약의 정확한 비율을 나타냅니다. 이것은 반응을 효과적으로 확장하고 마스터 믹스를 형성하는 데 사용할 수 있습니다. 시약의 양은 20% 초과분을 포함하도록 조정되었습니다.
3. 유세포 분석을 위한 세포 준비
<ol><li>적어도 4.2 mL의 DMEM 용액을 37°C로 예비-가온한다. 적어도 4.2 mL의 트립신 및 4.2 mL의 PBS를 37°C로 예열한다. 사용할 준비가 될 때까지 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충 용액을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>응집을 줄이기 위해 FACS 완충액(1% BSA, 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA] 및 0.1% 아지드화나트륨[NaN3]으로 보충된 PBS; 재료 표 참조)에 세포를 재현탁합니다.<ol><li>각 웰에서 현재 매체를 흡인하고 폐기하십시오. PBS 5mL를 각 웰에 분주하여 세포를 세척합니다. PBS를 흡인하고 폐기하십시오.</li>
		<li>5mL의 트립신을 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 3분 동안 또는 세포가 더 이상 접시에 부착되지 않을 때까지 놓습니다. 플레이트를 생물안전 캐비닛으로 되돌리고 5mL의 DMEM 용액을 각 웰에 분배하여 세포 용액을 희석합니다.</li>
		<li>각 웰에 대해 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 각 웰에 대해 모든 배지를 흡인하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포를 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다. 세포를 흡인하고 버리지 않도록 주의하면서 배지를 흡인합니다. 각 튜브에서 세포를 5mL의 FACS 완충 용액에 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.</li>
	<li>각 세포 현탁액 용액을 스트레이너(덩어리 제거용)를 통해 별도의 유세포 분석 원추형 튜브로 통과시킵니다. 이 튜브를 얼음 위에 1시간 이상 두지 말고 가능한 한 빨리 유세포 분석을 수행하십시오.</li>
</ol>4. 유세포 분석 수행
참고: 유세포 분석기를 작동하려면 필요한 작업에 대한 적절한 교육과 지식이 필요합니다. 소프트웨어 및 장비가 다를 수 있고 사용자는 일반적으로 교육을 받아야 하므로 이 섹션에서는 수행하는 데 유용한 특정 작업을 참조합니다.
<ol><li>먼저, 필러 플라스미드 대조군(색상 대조군 없음)으로 형질감염된 세포를 검사하여 세포 특성을 선택하고 이상(응집체, 파편 등 포함)을 방지합니다. 셀을 구별하기 위한 다양한 매개변수 조합이 있지만, 구별되는 특징을 시각화하는 좋은 방법으로 다음 세 가지 일반 옵션을 사용하십시오.<ol><li>측면 산란 영역(기본 설정/셀 유형별 로그 또는 선형 스케일)과 전방 산란 영역(선형 스케일)을 확인합니다.</li>
		<li>측면 산란 높이(로그 스케일)와 측면 스캐터 폭(선형 스케일)을 확인합니다.</li>
		<li>전방 산란 폭(선형 스케일)과 전방 스캐터 높이(선형 스케일)를 살펴봅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음으로 단색 컨트롤을 살펴봅니다. 모든 색상 제어를 사용하여 기기 전압을 조정하여 각 형광 단백질의 신호가 형광의 등가 임의 단위(a.u.)로 정규화되도록 합니다. 다음으로, 보상 매트릭스를 설정하는 데 사용되는 각 형광 단백질에 대해 단색 컨트롤을 실행하여 블리드스루 보정을 허용합니다. 알림: 이상적으로는 형광 값의 전체 동적 범위가 표시되어야 합니다. 형광 단백질 신호의 추가 정규화는 표준화된 단위(예: 등가 플루오레세인 분자[MEFL]; Beal et al.15 참조)로의 변환을 통해 수행할 수 있습니다. 해석 중에 MEFL 변환을 활성화하려면 무지개 보정 비드를 실행합니다. 이러한 교정은 또한 기기 간 및 일상적인 신호 변동을 감소시키는데 유용하다(16).</li>
	<li>poly-transfection 샘플 튜브를 실행합니다. 참고: 가능한 경우 1,000 x 10^(^ = 혼합) 세포를 실행하는 것이 좋으며, 분석 중에 고차원 폴리트랜스펙션을 더 많은 빈으로 세분화해야 하고 각 빈에는 통계적으로 유의미한 비교를 위해 충분한 세포(이상적으로는 >10)가 필요합니다.</li>
</ol>5. 실험 후 분석 수행
<ol><li>처음에는 컨트롤(및 해당되는 경우 비드)의 데이터를 사용하여 정확한 결과를 보장합니다. 사용 가능한 소프트웨어 도구 중 하나를 사용하여 라이브 셀 게이팅(위에서 설명한 게이트 사용), 보정 및 자가형광 보정을 수행합니다. 참고: 일반적으로 사용자 지정 MATLAB 코드(예: https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis 또는 Cytoflow17)를 사용하며, 이 코드에는 그래픽 사용자 인터페이스와 전처리 단계 및 폴리 트랜스펙션 분석에 적합한 Python 라이브러리가 모두 있습니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>메서드</td>
			<td>콤플렉스</td>
			<td>ng 형광 마커</td>
			<td>ng L7ae (분획)</td>
			<td>ng 리포터 (분수)</td>
			<td>ng 필러 DNA(분획)</td>
			<td>합계 (ng)</td>
		</tr><tr><td>폴리-형질주입 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>75 (½)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>폴리-형질주입 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>600</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>1</td>
			<td>150</td>
			<td>25 (1/6)</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr><tr><td>→</td>
			<td>2</td>
			<td>150</td>
			<td></td>
			<td>125 (5/6)</td>
			<td>25(1/6)</td>
			<td>300</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 프로토콜에서 입증된 폴리형질감염을 위한 DNA 양, 및 조정된 플라스미드 비율을 사용한 후속 실험의 예. 표의 상반부는 간단한 폴리형질감염 실험에 사용된 플라스미드의 조성을 나타낸다. 하반부는 가상의 농도 공간을 더 잘 서브샘플링하기 위해 플라스미드 비율을 조정하는 업데이트된 실험의 구성을 보여주며, 여기서 유전자 발현 조절자는 리포터에 비해 더 최적의 1:5 비율에 있어 이 비율 주변의 샘플에 더 많은 형질주입된 세포를 생성합니다.

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<li>Sayeg, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+microRNA-based+genetic+classifiers+target+specific+neurons+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).</li>
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</ol>

RW는 Strand Therapeutics와 Replay Bio의 공동 설립자입니다. R.W.와 R.J.는 세포 유형 분류기와 관련된 임시 특허를 출원했습니다.

CAD(Computer-Aided Design), 브레드보드 및 3D 프린팅과 같은 신속한 프로토타이핑 방법은 기계, 전기 및 토목 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 주어진 과제에 대한 가능한 많은 솔루션을 신속하게 검색할 수 있는 능력은 해당 분야의 발전을 크게 가속화합니다. 우리는 폴리 트랜스펙션이 생물 공학과 유사한 기술로, 유전자 회로의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다고 믿습니다. 또한 다른 래피드 프로토타이핑 기술은 가능한 여러 솔루션을 순차적으로 직접 반복해야 하는 반면, 폴리 트랜스펙션은 많은 솔루션을 동시에 탐색할 수 있습니다. 폴리형질감염은 유전자 회로 성분 비율의 많은 조합이 단일 웰에서 시험될 수 있게 하고, 몇몇 공개된 유전자 회로를 최적화하기 위해 사용되어 왔다10,11,13. 실험 프로토콜은 표준 공동 형질감염의 간단한 확장으로, 많은...

포유류 합성 생물학 분야는 배양된 세포주에서 간단한 감지 및 반응 부분을 개발하는 것부터 진단 및 치료의 실제 문제를 해결하기 위한 복잡한 유전자 네트워크의 최적화에 이르기까지 빠르게 발전했습니다1. 이러한 정교한 회로는 microRNA 프로파일에서 사이토카인, 저분자 약물에 이르기까지 생물학적 입력을 감지하고 트랜지스터, 대역 통과 필터, 토글 스위치 및 발진기를 포함한 논리 처리 회로를 구현할 수 있습니다. 그들은 또한 암, 관절염, 당뇨병 등과 같은 질병의 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다 1,2,3,4,5. 그러나 회로의 복잡성이 증가함에 따라 각 구성 요소의 레벨을 최적화하는 것이 점점 더 어려워지고 있습니다.
유전 회로의 특히 유용한 유형 중 하나는 세포 상태를 감지하고 반응하도록 프로그래밍할 수 있는 세포 분류기입니다. 특정 세포 상태에서 단백질 또는 RNA 산출물의 선택적 생산은 세포와 오가노이드의 분화를 유도 및 프로그래밍하고, 병든 세포 및/또는 바람직하지 않은 세포 유형을 식별 및 파괴하고, 치료 세포의 기능을 조절하는 강력한 도구입니다 1,2,3,4,5 . 그러나 여러 세포 RNA 및/또는 단백질 종에서 세포 상태를 정확하게 분류할 수 있는 포유류 세포에서 회로를 만드는 것은 매우 어려운 일이었습니다.
세포 분류 회로를 개발하는 데 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나는 회로 내에서 센서 및 처리 인자와 같은 개별 구성 요소 유전자의 상대적 발현 수준을 최적화하는 것입니다. 회로 최적화를 가속화하고 보다 정교한 회로의 구축을 허용하기 위해, 최근 연구에서는 최적의 조성 및 토폴로지를 예측하기 위해 셀 분류기 회로 및 그 구성 요소의 수학적 모델링을 사용했습니다(6,7). 이것은 지금까지 강력한 결과를 보여주었지만 수학적 분석은 회로에서 구성 요소 유전자의 입출력 거동을 체계적으로 특성화해야 하는 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리기 때문에 제한적입니다. 또한, 복잡한 유전 회로에서 무수히 많은 문맥 의존적 문제가 나타날 수 있으며, 이로 인해 전체 회로의 동작이 개별 부분 특성화에 기초한 예측을 무시하게 됩니다(8,9).
세포 상태 분류기와 같은 복잡한 포유류 회로를 보다 신속하게 개발하고 테스트하기 위해 우리 연구실은 플라스미드 공동 형질주입 프로토콜의 진화인 폴리 형질감염10이라는 기술을 개발했습니다. 동시 형질감염에서 여러 플라스미드 DNA 종은 양전하를 띤 지질 또는 고분자 시약과 함께 복합체화된 다음 상관관계가 있는 방식으로 세포에 전달됩니다(그림 1A). 폴리형질감염에서, 플라스미드는 시약과 개별적으로 복합체화되어, 각각의 형질주입 복합체로부터의 DNA가 비상관된 방식으로 세포에 전달된다 (도 1B). 이 방법을 사용하여, 형질주입된 집단 내의 세포는 상이한 회로 성분을 운반하는 2개 이상의 DNA 페이로드 비율의 수많은 조합에 노출된다.
각각의 세포에 전달되는 회로 성분의 비율을 측정하기 위해, 폴리형질주입 내의 각각의 형질주입 복합체는 복합체의 세포 흡수에 대한 프록시로서 기능하는 구성적으로 발현된 형광 리포터를 함유한다. 포유동물 세포 내에서 활성인 어떠한 요소도 함유하지 않는 필러 DNA는 단일 형질감염 복합체에서 세포에 전달되는 형광 리포터 및 회로 성분의 상대적인 양을 조정하기 위해 사용되며, 논의에서 더 상세히 논의된다. Weiss 연구실에서 사용되는 필러 DNA의 예로는 터미네이터 서열을 포함하지만 프로모터, 코딩 서열 등을 포함하지 않는 플라스미드가 있습니다. 그런 다음 회로 구성 요소의 비율이 다른 세포를 비교하여 유전자 회로 기능에 대한 최적의 비율을 찾을 수 있습니다. 이는 차례로 유전자 통합을 위해 회로 구성 요소를 단일 벡터(예: 렌티바이러스, 트랜스포존 또는 랜딩 패드)로 결합할 때 최적의 유전자 발현 수준을 달성하기 위해 프로모터 및 기타 회로 요소를 선택하는 데 유용한 예측을 제공합니다. 따라서 직관에 따라 또는 시간이 많이 소요되는 시행착오 과정을 통해 회로 구성 요소 간의 비율을 선택하는 대신 poly-transfection은 단일 포트 반응에서 유전 부분 간의 광범위한 화학량론을 평가합니다.
우리 연구실에서 폴리 형질 감염은 세포 분류자, 피드백 및 피드 포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프를 포함한 많은 유전 회로의 최적화를 가능하게했습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 크게 단축합니다. 폴리-형질감염(Poly-transfection)은 이후 여러 유전 회로를 특성화하여 고분해능(high resolution)에서 다차원 입출력 전달 함수(input-output transfer function)를 밝히고(10), 세포 상태 분류(cell state classification)11를 위한 대체 회로 토폴로지(alternate circuit topology)를 최적화하며, 다양한 발표된12,13 및 진행 중인 프로젝트를 가속화하는 데 사용되었다.
여기서는 유전자 회로를 신속하게 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 워크플로우를 설명하고 묘사합니다(그림 2). 이 프로토콜은 고품질 poly-transfection 데이터를 생성하고 poly-transfection 프로토콜 및 데이터 분석에서 몇 가지 일반적인 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다(그림 3). 그런 다음 poly-transfection을 사용하여 간단한 회로 구성 요소를 특성화하고 그 과정에서 co-transfection에 대한 poly-transfection 결과를 벤치마킹하는 방법을 보여줍니다(그림 4). 마지막으로, 폴리형질감염의 결과는 암 분류자 회로의 최적화를 보여준다(도 5).

<table><tbody><tr><td>15mL Corning Falcon 원뿔형 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>24웰 페트리 접시</td><td>원하는</td><td></td> 회사<td>(비발열성, 멸균성, RNase, DNase, DNA 및 발열원 없음)</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>선택한</td><td></td> 회사 <td>15mL Falcon 튜브를 300 rcf</td></tr><tr><td>에 노출할 수 있습니다.Countess 3 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflow</td><td>비상용 소프트웨어 패키지</td><td></td><td>https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>귀하의 세포 유형</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp에</td> 맞는 올바른 매체를 사용하십시오;<td>ThermoFisher Scientific</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>HEK 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>실험에 적합한 세포 유형을 사용하십시오. HEK 세포는 매우 효율적으로 transfection하는 경향이 있습니다.</td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-12401</td><td>실험에 적합한 세포 유형을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 및 P3000 enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000001</td><td>세포 유형에 맞는 시약을 사용하십시오. transfection 및 enhancer 시약</td></tr><tr><td>LSRFortessa 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>원하는</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>회사Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>감소 혈청 배지</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Rainbow calibration beads</td><td>Spherotech</td><td>URCP-100-2H</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발

Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection

포유류의 유전 회로는 광범위한 질병 상태를 감지하고 치료할 수 있는 잠재력을 입증했지만 회로 구성 요소 수준의 최적화는 여전히 어렵고 노동 집약적입니다. 이 과정을 가속화하기 위해 우리 연구실은 전통적인 포유류 형질감염의 고처리량 확장인 폴리 형질감염을 개발했습니다. 폴리형질감염에서 형질주입된 집단의 각 세포는 본질적으로 서로 다른 실험을 수행하여 서로 다른 DNA 복제 수에서 회로의 거동을 테스트하고 사용자가 단일 포트 반응에서 많은 수의 화학량론을 분석할 수 있도록 합니다. 지금까지, 세포의 단일 웰에서 3성분 회로의 비율을 최적화하는 폴리-형질감염이 입증되었다; 원칙적으로 더 큰 회로를 개발하는 데 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 폴리형질주입 결과는 일시적인 회로를 위한 동시 형질감염에 대한 DNA의 최적 비율을 찾거나 안정적인 세포주 생성을 위한 회로 성분에 대한 발현 수준을 선택하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.
여기서는 3성분 회로를 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 실험 설계 원칙으로 시작하여 폴리 트랜스펙션이 전통적인 공동 트랜스펙션 방법을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 다음에, 세포의 폴리형질감염을 수행하고, 며칠 후에 유세포 분석을 수행한다. 마지막으로, 데이터는 특정 성분 비율을 가진 세포의 하위 집합에 해당하는 단일 세포 유세포 분석 데이터의 슬라이스를 검사하여 분석됩니다. 실험실에서 폴리-트랜스펙션은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 단축합니다.

그림 1에서 우리는 co-transfection과 poly-transfection을 비교합니다. 공동형질감염에서, 모든 플라스미드는 동일한 형질주입 혼합물로 전달되어, 임의의 단일 세포가 받는 각 플라스미드의 양 사이에 높은 상관관계를 초래한다(도 1A). 각 세포에 전달되는 총 플라스미드의 수는 크게 다르지만, 집단 전체에 걸쳐 개별 세포에 있는 두 리포터 단백질의 형광은 상관관계가 있으며, 이는 두 플라스미드가 상당히 일정한 비율로 동시 전달되고 있음을 나타냅니다. 형질주입된 세포는 거의 또는 다수의 복합체를 흡수할 수 있지만, 각각의 복합체는 각각의 플라스미드의 상관된 양을 갖기 때문에, 공동-형질감염은 단지 2개의 플라스미드 사이의 농도 공간의 작은 대각선 영역만을 탐색한다. 대조적으로, 폴리형질감염에서, 플라스미드는 다중 형질주입 복합체로 전달되고, 그 결과 상이한 형질주입 혼합물에서 플라스미드의 비상관관계 전달이...

복잡한 유전 회로는 설계, 테스트 및 최적화에 시간이 많이 걸립니다. 이 과정을 촉진하기 위해 포유류 세포는 단일 웰에서 회로 구성 요소의 여러 화학량론을 테스트할 수 있는 방식으로 형질감염됩니다. 이 프로토콜은 실험 계획, transfection 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다.

Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발

Mammalian genetic circuits have demonstrated the potential to sense and treat a wide range of disease states, but optimization of the levels of circuit ...

우리의 프로토콜을 사용하면 생물학적 부분 간의 관계를 더 쉽고 빠르게 이해할 수 있습니다. 단일 웰에서 부품의 여러 비율 메트릭 조합의 동작을 테스트할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 기존 접근 방식보다 더 큰 실험 효율성으로 회로 구성 요소 간의 복잡한 관계를 보다 포괄적으로 특성화할 수 있습니다.이 방법은 합성 생물학 및 모든 생물학적 질문에 적용할 수 있으며, 유세포 분석을 통해 출력을 측정할 수 있는 다양한 수준의 형질주입된 유전자에 대한 반응으로 세포의 행동 변화를 조사합니다. 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, 네온 그린 제어, 모든 색상 제어, 폴리-형질주입 믹스 1 및 폴리-트랜스펙션 믹스 2로 표시된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 따로 보관하여 각 DNA 응집체에 대한 튜브 준비를 시작합니다. 36 마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 무색 대조군, mKO2 대조군, TagBFP 대조군, 네온 그린 대조군 및 모든 색상 대조군 튜브에 첨가한 다음, 18 마이크로리터의 감소된 혈청 배지를 각각의 폴리-형질주입 믹스 1 및 폴리-형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.다음으로, 600 나노그램의 필러 플라스미드를 무색 제어 튜브에, 300 나노그램의 mKO2 및 300 나노그램의 필러 플라스미드를 mKO2 색상 제어 튜브에 추가하고, 300 나노그램의 TagBFP 및 300 나노그램의 필러 플라스미드를 TagBFP 컬러 컨트롤 튜브에 추가한다. 네온 그린 색상 제어 튜브에 구성 네온 그린 300나노그램과 필러 플라스미드 300나노그램을 추가한 다음 각 mKO2, TagBFP, 구성 네온 그린 및 필러 플라스미드 300나노그램을 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 폴리형질주입 믹스 하나의 튜브에 150 나노그램의 mKO2, 75 나노그램의 리포터 네온 그린 플라스미드 및 75 나노그램의 필러 플라스미드를 첨가한다.폴리-형질주입 믹스 2개의 튜브에, 150 나노그램의 TagBFP, 75 나노그램의 L7Ae 플라스미드 및 75 나노그램의 필러 플라스미드를 첨가한다. 완료되면 216마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 9.48마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 결합하여 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 트랜스펙션 마스터 믹스를 만듭니다. 따로 보관하기 전에 피펫을 위아래로 잘 섞습니다.1.58 마이크로리터의 인핸서 시약을 무색 제어, 단색 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 첨가하고 79 마이크로리터의 인핸서 시약을 각각의 폴리-형질주입 혼합 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다. 37.58마이크로리터의 트랜스펙션 마스터 믹스를 무색 대조군, 단색 대조군 및 모든 색상 조절 튜브에 추가하고 강력하게 피펫팅하여 혼합합니다.다음으로, 18.79 마이크로리터의 형질주입 마스터 혼합물을 각각의 폴리-형질주입 혼합 튜브에 첨가하고, 각 튜브를 활발한 피펫팅으로 잘 혼합한다. 무색, 단색 및 모든 색상 대조군에 대한 각각의 형질주입 믹스 65.97 마이크로리터를 피펫팅하여 형질주입 믹스를 웰 내로 분주한 다음, 32.98 마이크로리터의 폴리형질주입 믹스를 폴리형질주입 웰 내로 옮기고, 플레이트를 팽팽하게 그러나 부드럽게 소용돌이킴으로써 복합체를 효과적으로 분배하고, 평평한 표면을 따라 패턴을 피구레이트한 다음, 32.98 마이크로리터의 폴리형질주입을 동일한 폴리형질주입 웰에 2개씩 혼합하고 동일한 방식으로 플레이트를 소용돌이친다. 이틀 동안 세포를 배양하십시오.유세포 분석을 수행하여 각 세포에 대한 transfection marker 및 출력 리포터의 형광을 판독합니다. 비디오에 표시된 폴리-형질감염과 구별되는 잘 수행된 동시형질감염은 TagBFP와 EYFP 사이의 긴밀한 상관관계를 보여주며, 동시-전달된 플라스미드를 발현합니다. 대조적으로, 저조하게 수행된 공동-형질감염은 2개의 플라스미드 사이의 불량한 상관관계를 나타낸다.잘 수행된 폴리형질감염은 2차원 공간의 양호한 커버리지 및 형광 단백질 사이의 스펙트럼 블리드의 양호한 보상을 보여주었다. 적은 수의 살아있는 세포를 갖는 폴리형질감염 데이터는 분석을 위해 각 빈에 충분한 수의 세포를 갖는 충분한 빈으로 세분하는 것이 어려웠다. 형질주입 효율이 좋지 않은 폴리형질주입은 분석을 위한 2차원 공간의 희박한 커버리지를 초래했습니다.출력 발현에 대한 효과적인 DNA 비율은 억제 단백질인 L7Ae와 mKO2 및 출력 단백질인 네온 그린과 TagBFP를 별도의 형질주입 혼합물에 배치하여 테스트했습니다. 이어서, 네온 그린 발현을 mKO2 및 TagBFP의 상이한 수준에서 모니터링하였다. 공동형질감염 및 폴리형질감염 결과를 이 회로에 대해 비교하였다.이전에 표시된 DNA 부분을 결합한 11개의 개별 공동 형질감염 결과를 단일 데이터 세트로 수집하고 폴리형질주입 데이터와 비교했습니다. 출력 리포터를 억제하는 L7Ae의 용량 반응 곡선의 비교는 빈당 평균 출력 레벨이 공동형질감염 및 폴리형질감염 데이터 사이에서 매우 유사하다는 것을 보여주었다. 폴리-형질감염의 성공적인 적용은 세포 유형 분류자를 최적화하기 위해 입증되었다.HeLa 세포와 not-HEK 세포에 존재하는 마이크로 RNA-21은 BM3R1이 회로 출력 mKO2의 생성을 억제하기 때문에 BM3R1의 발현을 녹다운시키는 역할을 합니다. 마이크로 RNA 21이 세포에 존재하면 mKO2 발현이 켜집니다. Gal4-VP16의 양은 BM3R1의 낮은 수준에서 mKO2 발현을 조정합니다.각 회로 구성 요소는 다른 형광 마커와 함께 전달되었습니다. 이 폴리-형질감염은 각 세포가 받은 각 회로 성분의 양을 정량화합니다. mKO2는 MIR21에서 생산되어 HeLa 세포를 생성하지만 HEK 세포에서는 생성하지 않습니다.mKO2 출력은 특정 세포에 의해 수신된 각 회로 성분의 양을 나타내기 위해 별개의 형광 리포터와 함께 별도의 형질감염 혼합물로 이들 회로 성분을 전달한 후 분석되었습니다. 이 하위 샘플링은 HEK293 대 HeLa 세포를 분류할 때 이 비율에서 공동 형질주입된 회로가 91%의 특이도, 62%의 민감도 및 77%의 정확도를 가질 것으로 예측했습니다. 이 프로토콜에서 가장 일반적인 문제점은 각 형질주입 믹스 내에서 긴밀한 상관관계가 없다는 것입니다.따라서 인핸서 시약을 첨가한 직후 형질주입 튜브를 격렬하게 혼합한 다음, 형질주입 혼합물을 함유한 지질을 첨가한 후 형질주입 튜브를 부드럽게 혼합하고 피펫팅하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차의 유전적 구성 요소는 다양한 환경에서 기능 성능에 대한 질문에 답하기 위해 다른 유전 구성 요소로 대체될 수 있습니다. 이 방법은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등과 같은 유전 회로를 빠르게 발전시켰습니다.

rapid-development-cell-state-identification-circuits-with-poly

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

우리는 시험관 내 전사 반응을 조절하기 위해 새로운 DNA 테더T7 RNA 폴리머라제의 엔지니어링을 설명합니다. 우리는 단백질 합성 및 특성화를 위한 단계를 논의하고, 개념 증명 전사 적 조절을 검증하며, 분자 컴퓨팅, 진단 및 분자 정보 처리에 대한 응용 분야에 대해 논의합니다.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

무세포 시스템을 사용한 유전 부분의 신속한 특성 분석

본 프로토콜은 2i 및 LIF 배지를 사용한 배양 중 마우스 배아 줄기 세포의 역 다중-transfection 방법을 설명합니다. 이 방법은 기존의 forward transfection 프로토콜보다 더 높은 생존력과 효율성을 제공하는 동시에 plasmid 비율의 one-pot 최적화를 가능하게 합니다.

핵산 비율의 신속한 탐색을 위해 최적화된 마우스 배아 줄기 세포 기반 역 Poly-transfection 기술

학습하세요 포리-트랜스펙션을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발 방법입니다. 포유류 세포에서 다양한 DNA 비율을 단일 웰에서 테스트하고 유세포 분석으로 출력을 측정하여 유전자 회로의 복잡한 관계를 효율적으로 특성화할 수 있습니다.

Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발

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