Name: 탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔 합성법을. 물리적·화학적 처리와 효소 소화를 활용하여 세포 물질을 제거하고 생물학적 활성과 저면역원성을 유지하는 조직공학 기법을 익히세요.

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이 작업은 절강성 의학 및 건강 기술 계획(2019KY050), 저장성 한의학 과학 기술 계획(2019ZA026), 절강성 중점 연구 개발 계획(보조금 번호 2020C03043), 절강성 한의학 과학 기술 계획(2021ZQ021), 중국 저장성 자연과학재단(LQ22H060007)의 후원을 받았습니다.

이 연구는 저장성 퉁덕병원 윤리위원회의 승인을 받았다.
1. DC-ECM 하이드로겔의 제조
참고: 이 연구에서 연골은 12개월 된 Bama 미니어처 돼지의 무릎 관절에서 얻어져 뼈 조직의 수집을 피했습니다.
<ol><li>채취한 연골을 메스로 1-2mm3 개로 잘라 차단한다.</li>
	<li>다진 연골 20g을 50mL 원심 분리 튜브에 넣고 20mL의 저긴장성 Tris-HCl 완충액 (10mM Tris-HCl, pH 8.0)을 추가하여 조직을 완전히 담그십시오. 원심분리기 튜브를 -80°C 냉동고에 3시간 동안 넣은 다음 37°C 오븐에 3시간 동안 넣습니다. 냉동 및 가열 단계를 6회 반복합니다. 이 단계에서, 저긴장성 Tris-HCl 완충액은 교체할 필요가 없다.</li>
	<li>30rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 원심분리기 튜브를 1,000초 동안 흔듭니다. 스테인리스 스틸 체(기공 크기: ~250μm)를 새 50mL 원심분리 튜브에 놓습니다.</li>
	<li>탈세포화된 연골을 스테인리스 스틸 체에 천천히 디캔팅하고 멸균 PBS로 조직을 세 번 세척하고 연골을 채취합니다.</li>
	<li>트립신 용액 10mL(PBS의 트립신 0.25%)를 넣고 튜브를 37°C의 셰이커에 24시간 동안 놓습니다. 이 기간 동안 4시간마다 트립신을 교체하십시오. 스테인리스 스틸 체를 사용하여 현탁액을 여과하고 조직을 보존합니다. 트립신은 소화 과정 중 하나에서 하룻밤 동안 치료할 수 있으며 최종 소화에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>트립신화 된 조직을 고긴장성 완충액 (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6)으로 세척하십시오.</li>
	<li>10mL의 뉴클레아제 용액(50mM Tris-HCl에 10U/mL 디옥시리보뉴클레아제 및 1U/mL 리보뉴클레아제 7.5)을 넣고 튜브를 37°C에서 4시간 동안 셰이커에 놓습니다.</li>
	<li>뉴클레아제 용액을 제거하고 멸균 PBS로 연골을 3회 세척하고 저긴장성 Tris-HCl 용액을 추가합니다. 원심분리기 튜브를 셰이커에 놓고 실온(RT)에서 20시간 동안 헹굽니다.</li>
	<li>저긴장성 Tris-HCl 용액을 제거하고 멸균 PBS로 연골을 세 번 세척하고 1% Triton X-100 용액을 첨가하여 조직을 24시간 동안 담그십시오.</li>
	<li>Triton X-100 용액을 제거하고 탈세포화된 연골을 증류수로 3일 동안 철저히 헹구고 12시간마다 증류수를 교체합니다.</li>
	<li>연골을 과초산 용액(4% 에탄올에 0.1% PAA)에 4시간 동안 담그십시오. 과초산 용액을 제거하고 멸균 증류수로 연골을 세 번 씻습니다.</li>
	<li>스테인리스 스틸 체(기공 크기: ~250μm)를 50mL 원심분리기 튜브에 놓습니다. 탈세포화된 연골을 스테인리스 스틸 체에 천천히 넣고 연골을 모은다. DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 추정하여 연골의 탈세포화 정도와 기질 보유 정도를 테스트합니다.</li>
	<li>탈세포화된 연골을 그라인딩 볼에 넣고 액체 질소를 넣고 탈세포화된 연골을 갈아서 분말을 만듭니다. 탈세포화된 연골 분말 2g을 취하여 0.5M 아세트산 80mL와 펩신 20mg을 넣고 24시간 동안 소화합니다. 400 x g 에서 10분 동안 원심분리기; 침전물을 버리고 상층액(DC-ECM 용액)을 수집합니다.</li>
	<li>웰당 1mL의 DC-ECM 용액을 6웰 플레이트에 디캔팅합니다. 6웰 플레이트를 동결건조기에 넣습니다. DC-ECM 솔루션을 동결합니다. 동결 건조기의 온도가 -40°C로 떨어지면 진공 펌프를 켜고 진공을 10시간 동안 22Pa로 유지합니다.</li>
	<li>동결 건조된 DC-ECM 용액을 꺼내 원심분리 튜브에 넣고 -20°C에서 보관합니다. 동결 건조 DC-ECM 용액의 최소 보관 기간은 반년을 초과합니다.</li>
	<li>멸균 증류수 1mL를 추가하여 동결 건조된 DC-ECM 용액 20mg을 원심분리 튜브에 녹입니다. RT에서 1rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 1,000분 동안 흔듭니다. DC-ECM 용액에 비타민 B2 1mg(0.1% w/v)을 넣고 37°C에서 60분 동안 배양한 후 UV 광(370nm, 3.5mW/cm2)을 3분 동안 조사하여 하이드로겔(DC-ECM 하이드로겔)을 형성합니다.</li>
</ol>2. 탈세포화된 연골의 검출
<ol><li>탈세포화된 연골의 DNA 함량 검출 참고: DNEasy Blood & Tissue Kit를 사용하여 DNA를 추출합니다.<ol><li>먼저 원심분리 튜브에 DC-ECM 연골 20mg을 넣습니다. 와류 진동에 의해 180μL의 Buffer GTL과 20μL의 Proteinase K를 추가하고 연골이 완전히 용해될 때까지 56°C에서 4시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>RT에서 15rpm의 속도로 와류 믹서를 사용하여 원심분리기 튜브를 1,000초 동안 흔듭니다. 다음으로 200μL의 Buffer GL과 무수 에탄올을 넣고 와류 진동으로 완전히 혼합합니다. 4°C에서 6,000 x g 의 속도로 1분 동안 샘플을 원심분리합니다.</li>
		<li>흡착 컬럼에 500μL의 버퍼 GW1을 추가하고 4°C에서 12,000 x g의 속도로 1분 동안 샘플을 원심분리합니다. 흡착 컬럼에 500μL의 버퍼 GW2를 추가하고 4°C에서 20,000 x g으로 1분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 흡착 컬럼에 멸균수 50μL를 넣고 4°C에서 6,000xg의 속도로 1분 동안 원심분리하여 DNA 용액을 수집합니다. 분광 광도계를 사용하여 DNA 함량을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탈세포화된 연골의 콜라겐 함량 검출<ol><li>탈세포화된 연골의 콜라겐 함량을 검출하려면 하이드록시프롤린을 콜라겐 아미노산 마커로 사용하십시오. 탈세포화된 연골 5mg을 100°C에서 20분 동안 6M 염산 5mL로 산성화한 다음 5mL의 6M 수산화나트륨 용액으로 중화합니다.</li>
		<li>분광 광도계로 570nm에서 샘플의 흡광도를 측정하여 하이드록시프롤린의 함량을 계산합니다. 표준 hydroxyproline 샘플을 사용하여 농도-흡수 선형 회귀를 얻습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탈세포화된 연골의 GAG 함량 검출 참고: DC-ECM 연골의 GAG 함량은 조직 GAG 비색 정량 검출 키트를 사용하여 검출되었습니다. 아래의 모든 시약은 키트에서 사용할 수 있습니다.<ol><li>DC-ECM 연골 분말 200mg을 취하고 와류 진동으로 시약 A 500μL를 추가합니다. 샘플을 4°C에서 16시간 동안 배양한 다음 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>시료 용액 50mL를 취하여 고염 용액(시약 B) 50μL와 산성 용액(시약 C) 50μL를 와류 진동으로 첨가합니다. 샘플을 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>와류 진동으로 750μL의 염료 용액(시약 D)을 추가하고 어두운 조건에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.</li>
		<li>1μL의 세척액(시약 E)을 넣고 잘 섞는다. 샘플을 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.</li>
		<li>1μL의 해리 용액(시약 F)을 샘플에 넣고 잘 섞습니다. 어두운 조건에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 마지막으로 600nm에서 분광 광도계를 사용하여 GAG 함량을 결정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탈세포화된 연골의 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM) 분석<ol><li>탈세포화된 연골과 정상 연골 조직을 비교합니다. 샘플을 2.5% 글루타르알데히드 용액에 넣고 4°C에서 밤새 배양한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.</li>
		<li>샘플을 1% OsO4에 1시간 동안 고정한 다음 PBS로 세 번 세척합니다.</li>
		<li>50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올과 100% 아세톤을 각각 15분 동안 순차적으로 담가 샘플을 탈수합니다. 샘플을 헥사메틸디실라잔과 에탄올(1:1)의 혼합 용액에 15분 동안 넣은 다음 순수한 헥사메틸디실라잔에 15분 동안 담급니다.</li>
		<li>샘플을 HCP-2 건조기에 넣은 다음 액체 질소를 사용하여 건조시킵니다. 그런 다음 스퍼터 코팅을 사용하여 금-팔라듐의 얇은 층으로 완전히 건조된 표본을 코팅하고 SEM을 사용하여 이미지를 코팅합니다. 스퍼터 코팅은 120W의 전력으로 5분 동안 수행하였다. 실험은 15kV의 작동 전압 및 5 x 10−5 Pa보다 낮은 진공도 조건에서 수행되었습니다.</li>
		<li>TEM 분석을 위해 샘플을 무수 아세톤과 수지(1:1)의 혼합물에 1시간 동안 넣은 다음 무수 아세톤과 수지(1:3)의 혼합물을 3시간 동안 넣습니다. 그런 다음 샘플을 수지에 밤새 담그십시오.<ol><li>샘플을 매립형 배지 캡슐에 넣고 70°C에서 9시간 동안 가열합니다.</li>
			<li>매립 후 초미세 마이크로톰을 사용하여 표본을 70nm 두께로 자르고 구리 메쉬 위에 놓습니다.</li>
			<li>20μL의 우라닐 아세테이트 염색 용액을 구리 메쉬에 피펫으로 고정하고 상온에서 15분 동안 염색합니다. 증류수로 메쉬를 부드럽게 두 번 세척하여 염색 용액을 제거합니다.</li>
			<li>그런 다음 구연산납 염색 용액 20μL를 구리 메쉬에 피펫하고 상온에서 15분 동안 염색합니다. 증류수로 메쉬를 세 번 세척합니다.</li>
			<li>여과지를 깐 깨끗한 페트리 접시에 구리 메쉬를 놓습니다. 자연 건조 후 TEM을 사용하여 단면을 촬영합니다. 프로브는 500nN의 하향력으로 적용되고 1Hz의 속도로 스캔되었으며 탄성 상수(k-값)는 40Nm-1이었습니다. 프로브 팁의 반경은 8nm로 측정되었습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 연골 조직의 본래 ECM을 밀접하게 모방하는 탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 제조를 위한 체계적인 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 구성을 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적, 효소적 파괴의 조합을 포함합니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 탈세포화 시간 및 방법 조정과 완전한 탈세포화 보장이 포함됩니다.
조직 공학 및 재생 의학을 위한 다른 기존 방법과 비교할 때 이 프로토콜은 몇 가지 이점을 제공합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생물학적 활성, 공간구조, 생물학적 유도 기능이 우수하고 면역원성이 낮으며, 이러한 특성은 세포 부착, 증식, 분화 및 이동을 촉진하는 데 유리하다11. DC-ECM 하이드로겔은 약물 전달 및 연골 결손 치료에도 사용할 수 있다12.
이 프로토콜에 적용할 수 있는...

연골 조직 공학은 손상되거나 병든 연골 조직을 재생하기 위해 빠르게 발전하는 분야입니다1. 이 분야의 주요 과제 중 하나는 연골 생산을 담당하는 세포인 연골세포의 성장과 분화를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체의 개발입니다2. 연골 조직의 ECM은 연골세포의 행동을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. DC-ECM은 조직 공학 응용 분야에 효과적인 비계입니다3.
연골 조직에서 DC-ECM을 생산하기 위해 화학적, 효소적, 물리적 방법을 포함한 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 생체 모방이 불충분한 ECM 하이드로겔의 생성을 초래하여 조직 공학 응용 분야에서 사용할 수 있는 잠재력을 제한합니다 4,5. 따라서, DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 보다 효과적인 방법이 필요하다.
이 기술의 개발은 조직 재생 및 복구를 지원할 수 있는 생체 모방 지지체를 만들기 위한 새로운 접근 방식을 제공하여 조직 공학 분야를 발전시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 또한 이 기술은 다른 조직에서 ECM 하이드로겔을 생산하는 데 쉽게 적용할 수 있어 잠재적인 응용 분야를 확장할 수 있습니다.
광범위한 문헌에서 DC-ECM을 조직 공학 응용 분야의 스캐폴드로 사용하는 것에 대한 관심이 높아지고있습니다 6. 수많은 연구에서 DC-ECM 하이드로겔이 연골을 포함한 다양한 조직에서 세포 성장과 분화를 촉진하는 효과가 입증되었습니다 7,8. 따라서 연골 조직의 자연 ECM을 밀접하게 모방하는 DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 프로토콜의 개발은 이 분야에 상당한 기여를 하고 있습니다.
이 논문에 제시된 프로토콜은 연골 조직의 자연 ECM을 밀접하게 모방하는 DC-ECM 하이드로겔을 생산하기 위한 새로운 방법을 제공하여 이러한 요구를 해결합니다. 이 프로토콜에는 연골 조직을 탈세포화하고, 생성된 ECM을 분리하고, ECM을 생체적합성 폴리머와 가교하여 하이드로겔을 생성하는 작업이 포함됩니다. 그 결과 하이드로겔은 연골세포의 성장과 분화를 지원하는 유망한 결과를 보여주었습니다.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH7.6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH8.0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Freezer</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>No. 69506</td><td></td></tr><tr><td>GAG 비색 정량 감지 키트</td><td>Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2 건조기&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>주사 전자 현미경</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>투과 전자 현미경</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 체</td><td>SHXB-Z-1</td><td>상하이 Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>자외선 램프</td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>비타민 B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>보텍스 믹서</td><td>상하이 Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

탈세포화 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔은 생체 적합성과 자연 조직 특성을 모방할 수 있는 능력으로 인해 조직 공학 및 재생 의학을 위한 유망한 생체 재료입니다. 이 프로토콜은 연골 조직의 기본 ECM을 밀접하게 모방한 DC-ECM 하이드로겔을 생산하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 구성을 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적 파괴와 효소 분해의 조합을 포함합니다. DC-ECM은 화학 약품을 사용하여 가교되어 안정적이고 생물학적으로 활성 하이드로겔을 형성합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생물학적 활성, 공간 구조, 생물학적 유도 기능이 우수하고 면역원성이 낮습니다. 이러한 특성은 세포 부착, 증식, 분화 및 이동을 촉진하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 조성하는 데 유용합니다. 이 프로토콜은 조직 공학 분야의 연구자와 임상의에게 귀중한 리소스를 제공합니다. 생체 모방 하이드로겔은 연골 복구 및 재생을 위한 효과적인 조직 공학 전략의 개발을 잠재적으로 향상시킬 수 있습니다.

더 나은 DC-ECM 연골 하이드로겔을 제조하기 위해 이전 문헌을 연구 및 검토하고 탈세포화 비율, 면역원성 및 기계적 기능 측면에서 다양한 탈세포화 프로토콜을 비교했습니다9.
이를 바탕으로 DC-ECM 연골 하이드로겔을 준비하고, 골연골 결손 치료에 있어 방사형 배향 추출 매트릭스/중간엽 줄기세포 엑소좀 바이오잉크의 효과를 살펴보았습니다. 그 결과, DC-ECM 연골 하이드로겔은 면역원성이 낮고 세포 이동을 촉진하고 연골 복구를 촉진할 수 있는 것으로 나타났다10.
최근 몇 년 동안 당사는 DC-ECM 연골의 준비를 최적화했습니다. 위의 실험 단계를 사용하여 탈세포화된 연골을 준비했습니다. 그 결과, DNA 함량은 본래 연골의 DNA 함량과 비교하여 탈세포화된 연골에서 제거되었음을 보여주었습니다(p &lt; 0.001, <str...

이 논문은 탈세포화된 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔의 합성을 위한 새로운 방법을 소개합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생체 적합성이 우수하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 제공합니다. 따라서 이상적인 세포 스캐폴드 및 생물학적 전달 시스템이 될 수 있습니다.

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

당사의 프로토콜은 연골 조직의 특성과 매우 유사한 하이드로겔에서 질병을 생성할 수 있다는 점에서 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 공간 구조에서 명백한 생물학적 활성, 낮은 면역원성 및 생물학적 산업 기능을 가진 하이드로겔에서 질병을 생성할 수 있다는 것입니다. 먼저 채취한 연골을 메스를 사용하여 1-2입방밀리미터 크기로 자른다.50mm 원심분리 튜브에 다진 연골 20g을 저긴장성 트리스-하이드로클로라이드 완충액 20ml에 담그십시오. 튜브를 섭씨 80도에서 3시간 동안 놓은 다음 섭씨 37도의 오븐에서 3시간 동안 굽습니다. 1000RPM에서 30초 동안 원심분리기 튜브를 소용돌이칩니다.그런 다음 50밀리리터 원심분리 튜브에 놓인 플라스틱 체를 사용하여 탈세포화된 연골을 여과합니다. 연골을 채취하기 전에 멸균 PBS로 연골을 세 번 씻으십시오. 채취한 연골에 트립신 용액 10mL를 넣고 섭씨 37도의 셰이커에서 24시간 동안 배양하고 4시간마다 트립신을 교체합니다.현탁액을 여과한 후 트립신화된 연골을 고긴장성 완충액으로 세척합니다. 연골이 보존되면 뉴클레아제 용액 10mL를 넣고 섭씨 37도의 셰이커에 4시간 동안 올려 놓습니다. 멸균 PBS로 세척한 후 연골에 고긴장성 트리스-하이드로클로라이드 용액을 첨가하고 설명과 같이 셰이커에 놓습니다.멸균 PBS로 세척한 후 조직을 1% Triton X-100 용액에 24시간 동안 담그십시오. Triton X-100을 제거한 후 탈세포화된 연골을 증류수로 3일 동안 헹구고 12시간마다 물을 교체합니다. 3일 후 연골에 과초산 용액을 넣고 4시간 동안 담가둔다.PBS로 세척한 후 이전에 설명한 대로 플라스틱 체를 사용하여 연골을 수집합니다. 액체 질소를 사용하여 탈세포화된 연골 분말을 준비합니다. 연골 분말 2g에 0.5몰 아세트산 80mL와 펩신 20mg을 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 혼합물을 소화시킵니다.분해 후 현탁액을 400G에서 10분 동안 원심분리하고 현재 DC-ECM 용액이라고 하는 상층액을 수집합니다 DC-ECM 용액을 보관하기 위해 6웰 플레이트의 각 웰에 용액 1밀리리터를 추가하고 동결건조기에 넣습니다. 용액이 동결 건조되면 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 하이드로겔을 형성하려면 동결 건조된 DC-ECM 용액 20mg을 멸균 증류수 1mL에 용해시킵니다.소용돌이가 생기면 DC-ECM 용액에 비타민 B2 1mg을 첨가합니다. 배양 후 3 분 동안 자외선을 조사합니다. DC-ECM 연골 분말 20mg에 완충액 GTL 및 단백질 분해 효소 K를 첨가하고 와류 진동을 사용하여 완전히 혼합합니다.연골을 완전히 용해시키려면 혼합물을 섭씨 56도에서 4시간 동안 배양합니다. 소용돌이가 발생하면 200마이크로리터의 완충액 GTL을 첨가한 다음 무수 에탄올을 추가합니다. 와류 후 샘플을 섭씨 4도에서 1분 동안 6000G로 원심분리합니다.그런 다음 원고에 설명된 대로 DNA를 수집하고 정량화합니다. 콜라겐 분석을 위해 DC-ECM 분말 5mg을 염산에서 섭씨 100도에서 20분 동안 산성화합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 6 몰 수산화 나트륨 용액으로 중화시킵니다.하이드록시프롤린 표준물질에 대해 570나노미터에서 흡광도를 사용하여 중화된 샘플의 하이드록시프롤린 함량을 계산합니다. 혼합 후 500 마이크로 리터의 시약 A를 200 밀리그램의 DC-ECM 분말에 첨가합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다.원심분리가 완료되면 50 마이크로 리터의 샘플 용액을 수집하고 50 마이크로 리터의 시약 B를 첨가 한 다음 시약 C를 첨가합니다.샘플을 10 분 동안 배양 한 후 750 마이크로 리터의 시약 D를 추가하고 어두운 곳에서 30 분 동안 배양합니다. 원심분리 후 펠릿에 시약 E 1마이크로리터를 넣고 원심분리하기 전에 잘 혼합합니다. 그런 다음 GAG 함량 측정 전에 샘플을 해리합니다.제조된 DC-ECM 연골에서, DNA 함량은 현저하게 제거되었다. 그러나 콜라겐과 GAG 함량은 천연 연골에 비해 유지되었습니다. SEM 및 TEM 분석은 준비된 DC-ECM의 초구조를 시연했습니다.역관에서 제조된 하이드로겔은 바닥으로 흐르지 않아 겔화를 나타낸다. 또한, DC-ECM 단독 용액에 비해 비타민 B2를 첨가하면 DC-ECM 하이드로겔 형성 시 유도된 가교에 의한 겔화 시간이 단축되었습니다. DC-ECM 하이드로겔 점도는 용액 점도보다 높았으며, 전단 속도가 증가하면 용액 점도가 감소하였다.또한, DC-ECM 용액과 하이드로겔의 높은 저장 탄성률은 둘 다 액체가 아닌 겔 특성을 가지고 있음을 나타냅니다. SEM 분석은 가교 및 동결 건조 후 하이드로겔 형태에서 DC-ECM 용액의 공극 크기가 현저히 감소했음을 입증했습니다. 이 프로토콜은 ECM의 구조와 대화를 보존하면서 세포 물질을 제거하기 위한 물리적, 화학적 파괴와 효소 분해의 조합을 포함합니다.

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

여기 우리는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 히드로 네이티브 신장 세포 외 기질 (ECM) 구조 및 생 화 확 적인 구성 유지를 조작 하는 프로토콜을 제시. 제조 프로세스와 응용 프로그램을 설명 합니다. 마지막으로, 신장 관련 세포 및 조직 재생 및 생명 공학 지원 하기 위해이 하이드로 겔을 사용 하 여에 대 한 관점을 설명 합니다.

날조는 신장 피 질 세포 외 매트릭스 파생 하이드로 겔

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

이 프로토콜은 토착 소 폐 조직에 적용되는 두 가지 뚜렷한 탈세포화 방법론을 설명하여 각각의 특성화에 대한 포괄적인 설명을 제공합니다.

탈세포화된 폐 세포외 기질 하이드로겔의 개발 및 특성 분석

배우세요 탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔 합성법을. 물리적·화학적 처리와 효소 소화를 활용하여 세포 물질을 제거하고 생물학적 활성과 저면역원성을 유지하는 조직공학 기법을 익히세요.

탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

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