Name: 전사체학(transcriptomics)을 통한 온대 박테리오파지가 라이소겐에 미치는 영향 이해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 온대 박테리오파지의 라이소겐 상태에서 유전자 발현 프로파일링 방법을. RT-qPCR을 활용한 전사체학 기법으로 박테리아 숙주의 프로파지 조절 메커니즘을 연구하고 새로운 치료 표적을 발굴할 수 있습니다.

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E. coli MC106137,38,39로부터 Stx 파지의 자발적 유도를 보다 정확하게 정량화하기 위해 이전에 플라크 분석에서 사용되었던 선택 가능한 지표 호스트의 생성이 녹농균 파지 LESΦ2에 대해 여기에 설명되어 있습니다. 이 개입은 시료 처리 단계와 시간을 줄여 여러 배양 조건에서 자발적 유도 속도를 동시에 평가할 수 있다는 추가적인 이점이 있습니다. 리팜피신-내성 변이체(40)의 생성 동안에 다른 돌연변이를 발생시킬 위험이 있다; 그러나 이 연구에서 진화된 균주는 관심 배양에서 플라크를 열거하기 위한 지표 숙주로만 사용되었으며 전사체 분석에는 포함되지 않았습니다. 선택 가능한 지표 균주가 관심 파지에 의한 감염에 동등하게 취약한 상태로 유지되는 한, 다른 후천성 돌연변이에 대한 우려는 없습니다. 그럼에도 불구하고, PAO1WT 및 PAO1RIF의 펄스장 겔 전기영동(PFGE) 분석에 의해 제한 단편 길이 다형성 프로파일의 차이가 검출되지 않았다(데이터 미도시).
숙주 세포를 선택할 때, 이미 프로파지를 가지고 있지 않은 지표 균주를 찾는 것은 드뭅니다. 예를 들어, PAO1은 사상체 프로파지 Pf4를 보유하고 있습니다. 이 연구의 실험 대조군은 특정 파지(이 경우 LES 프로파지 2)의 유전자 발현과 이 파지가 박테리아 유전자 발현에 미치는 영향을 직접 검사할 수 있도록 설계되었습니다. LES 프로파지 2를 운반하는 PAO1과 LES 프로파지 2가 결핍된 전사체(라이소겐과 비라이소겐 모두 내인성 Pf4를 운반함)의 전사체를 비교한 결과, 이는 숙주에 대한 Pf4의 영향을 배제하기 위한 내부 대조군 역할을 합니다. 추가적으로, Pf4는 통상적으로 숙주 세포(41 )에서 용해를 일으키지 않으며, 따라서 이들 실험의 결과를 교란시킬 수 없다는 것이 입증되었다.
의미 있는 오믹스 데이터를 생성하기 위한 시료 전처리에서 신중한 품질 관리가 중요하다는 것은 잘 알려져 있다42. 그러나, 앞서 기술한 바와 같이,11, 이러한 연구를 위한 리소겐 배양의 제조에서 프로파지 활성의 신중한 특성화는 거의 수행되지 않는다. 여기에서는 박테리아와 온대 파지 간의 상호 작용을 더 잘 탐구하기 위해 전사체 연구를 위해 잘 제어되고 최적화된 배양 세트를 준비하기 위한 체계적인 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 개체군의 동시성은 유도 항생제인 노르플록사신(norfloxacin)으로 치료하기 전에 배양을 최소 4배로 늘림으로써 제어되었습니다. 연구에서 균주에 대한 노르플록사신의 MIC를 결정함으로써 유도제의 농도가 "유도" 처리를 위한 MIC 바로 위에 있는지 확인할 수 있었습니다. 그런 다음 처리된 세포를 1:10으로 희석하여 1시간 처리 후 노르플록사신 농도를 MIC 이하로 낮추어 세포가 회복되고 파지 복제 과정을 완료하여 세포의 용해 및 감염성 파지 자손의 방출로 끝납니다. 세포는 회복 기간 동안 노르플록사신의 농도가 MIC 아래로 내려간 후에만 유도 자극 후 용해 복제 주기에 들어갑니다. 이 경우 PAO1에 대한 노르플록사신의 MIC가 0.19μg·mL-1이므로 1μg·mL-1 노르플록사신을 초과하면 약물을 MIC 이하로 효과적으로 희석할 수 없습니다. 유도제 희석 수준은 라이소겐 회수 필요성 및 RNA 수확을 위한 배양 밀도 유지와 균형을 이루어야 합니다. 여기에서 논의된 데이터는 배양을 동기화하여 lysogeny가 우세한 샘플을 생성함으로써 자발적 유도로 인한 노이즈를 줄이고 유전자 발현에서 진정한 lysogeny에 의한 변화를 검출할 수 있음을 보여줍니다. 박테리아 세포 밀도가 낮을 때 성장의 초기 기하급수적 단계에서 용원 상태가 우세하기 때문에 RNA-Seq와 같은 후속 유전자 발현 연구를 위해 충분한 RNA를 수확할 수 있도록 배양을 확대하는 것이 좋습니다.
배양을 용해 회로로 강제하기 위한 유도제로서 노르플록사신의 사용은 잘 보고되어 있다43,44; 그러나, 이것은 또한 과정에서의 다른 박테리아 유전자의 발현에 영향을 미칠 것이다(45,46). 이를 완화하기 위해 동일한 유도 및 비유도 조건에서 성장한 대조군 야생형 배양의 RNA 라이브러리를 RNA-Seq 실험에 포함해야 합니다. qRT-PCR에 의한 파지 복제 단계를 검증하기 위해 내부 대조군 및 주요 마커 유전자를 사용하는 것도 정확한 비교를 위해 중요합니다. 정량적 RT-PCR 프로파일링은 다양한 시점에서 각 유전자에 대한 전사체의 절대 수를 비교하여 해석할 수 없습니다. 중요한 것은 프로파일의 모양입니다. 첫째, 어떤 유전자에 대한 전사체의 작은 영역 하나만 샘플링되었기 때문에, 그것이 수명이 짧은 요소인지 아니면 수명이 긴 요소인지는 알 수 없다27. 확실히, 전사체의 RNA-Seq 매핑은 매핑 데이터의 밀도가 유전자의 길이에 따라 크게 변한다는 것을 보여줍니다. 둘째, 용해 주기 또는 용원 생활 방식과 관련된 마커 유전자에 대해 해석되어야 하거나 심지어 파지 조절 회로(11)로부터 분리되어야 하는 것은 유전자 발현 프로파일의 모양이다. 자발적 유도는 라이소겐 배양에서 실질적인 문제이며 항상 용해 주기 관련 유전자의 발현을 초래합니다. 그러나, 프로파일링은 용해 복제 주기와 관련된 유전자가 발현 전 유도(최소 2개의 로그 폴드) 및 상향 조절된 유도 후에서 억제됨을 보여줍니다.
이전에 수행된 Stx 파지와 대장균의 상호작용에 대한 전사체 분석은 용해를 유지하고 용해 회로를 유발하는 데 관여하는 파지 유전자에 대한 철저한 이해를 뒷받침한다11,17. 현재 녹농균(P. aeruginosa)의 LES 파지에는 주석이 달렸지만, 주요 유전자 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 전사체 연구는 LES 프로파지의 재주석을 가능하게 하고 용해 및 용해 주기에 관여하는 유전자에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 유전자 염기서열을 기능에 연결하는 것은 새로운 프로파지 연구에서 중요한 도전이며, 이는 더 나은 주석 도구의 생산을 위해 파지 유전자 기능을 확인하기 위한 더 많은 연구의 필요성을 더욱 강조한다47. 이 비디오 기사에 자세히 설명된 프로토콜과 추가 품질 관리 조치의 광범위한 적용 및 적응은 다양한 프로파지 기능을 밝히고 주석 파이프라인을 개선하고 파지 및 박테리아 생물학에 대한 이해를 변화시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

최근에는 항생제 내성1 및 CRISPR-Cas 기반 유전자 편집2을 해결하기 위한 파지 요법이 박테리오파지 연구에 대한 새로운 관심을 불러일으켰습니다. 다시 말하지만, 생명공학의 발전은 박테리아와 파지 사이의 상호작용에 대한 더 깊은 연구를 가능하게 했다3. 그러나 파지의 치료적 사용("파지 요법")은 파지가 독성 및 내성 유전자를 수평적으로 전달할 수 있는 능력을 가진 이동성 유전 요소로 작용할 수 있다는 우려로 인해 방해를 받고 있다4. "암흑물질(dark matter)"5 (알려지지 않은 기능을 가진 유전자들)의 광활함은 우려스러우면서도 매력적이다. 암흑물질은 파지 생물학에 대한 우리의 이해의 격차로 간주되며, 분자 도구 및 잠재적인 새로운 치료법을 위한 미개척 자원으로 간주된다6. 개선된 유전자 주석 7,8,9 및 새로운 펩타이드 접힘 알고리즘(10)과 함께 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발은 파지 유전자의 검출, 설명 및 기능적 예측을 개선하고 있습니다. 그러나 과학은 배양이나 현실 세계에서 대부분의 파지의 유전자 기능을 검증하기에는 아직 멀었다.
RNA 염기서열분석(RNA-Seq)은 파지 감염 중 유전자 발현을 전체적으로 매핑할 수 있으며 용해 및 용원 주기에 관여하는 파지 및 박테리아 요소에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다11,12. 용원 과정(lysogenic process) 동안, 온대 파지 게놈(temperate phage genome)은 박테리아 DNA에 통합되어 프로파지(prophage)가 된다 13. 글로벌 유전자 발현 프로파일링 실험은 온대 파지 게놈에 암호화되어 있지만 용원 상태 동안에만 발현되는 프로파지-제한 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다11. 이러한 유전자는 파지 구조 단백질을 암호화하지 않으며 파지 감염 과정에 관여하지 않습니다. RNA-Seq는 기능 향상을 유도하거나 기존 박테리아 유전자를 조절하여 박테리아가 변화하는 환경에 적응할 수 있도록 함으로써 박테리아 숙주의 생물학에 영향을 미칠 가능성이 더 높은 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 박테리아 기능을 제어하는 미생물 꼭두각시 주인 역할을 하는 프로파지의 능력을 연구할 수 있습니다.
프로파지 제한 유전자 발현의 효과적인 분석에는 두 가지 주요 장벽이 있습니다. 첫째, 취약한 호스트의 가용성이 핵심 문제입니다. 정의에 따르면, 프로파지는 이미 특정 숙주 게놈에 통합되어 있기 때문에 프로파지의 존재 여부와 관계없이 전체 유전자 발현을 비교하기 위해 감수성 야생형 숙주를 찾는 것은 어렵습니다. 이는 다른 감수성 숙주의 de novo 감염 또는 숙주 게놈의 나머지 부분을 방해하지 않고 원래 야생형 분리물에서 프로파지의 삭제를 통해 달성할 수 있습니다. 두 번째 장벽은 용원 개체군의 이질적인 특성에 있습니다. 일부 프로파지는 돌연변이 또는 재조합을 통해 분해되어 박테리아 게놈의 특정 위치에 고정되어 있는 "비밀"이 됩니다. 그러나, 다른 프로파지들은 "활동적"이며, 자발적으로 또는 유도 인자에 노출된 후에 복제적, 용해적 회로로 유도될 수 있다. 많은 용원 배양에서 자발적 유도 속도는 박테리아 세포의 일부가 항상 용해성 파지 복제를 겪고 있음을 의미합니다14,15,16. 이들 집단에서 후기 파지 유전자의 높은 수준의 발현은 리소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 가린다11,17. 자발적 프로파지 유도를 받는 리소겐의 비율은 성장 상태, 성장 조건 또는 기타 유발 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 프로파지가 리소겐에 미치는 영향을 연구하기 위해서는 리소겐 상태에 유리하도록 성장 조건을 최적화하여 자발적인 프로파지 유도 사건을 최대한 최소화해야 합니다.
이 연구는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 리버풀 전염병 균주(LES)의 동거 프로파지 세트의 영향을 조사하기 위해 수행된 준비 작업을 보고합니다. 활성 프로파지를 LES에서 유도 및 분리하여 모델 녹농균 숙주 PAO116,18,19를 감염시키는 데 사용하였다. 야생형 녹농균 균주 PAO1 및 이의 라이소겐 PAO1Φ2의 전체 게놈 염기서열을 분석하여(30배 깊이에서) 야생형 균주의 정체를 확인하고 라이소겐이 동원성임을 확인했습니다. LES는 낭포성 섬유증 환자의 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있으며, LES 파지(19)는 낭포성 섬유증 폐 환경에 대한 적응을 돕는 것으로 제안되었다16,19,20. 이러한 프로파지가 숙주20,21의 생물학에 영향을 미친다는 강력한 증거에도 불구하고, 대부분의 유전자 기능은 아직 특성화되지 않았으며, 상호작용의 구체적인 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있다. 전사체학 접근법은 통제된 숙주 배경에서 프로파지 유전자 기능을 경험적으로 밝혀낼 수 있습니다. 자발적 유도는 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이 기사에서는 용원 상태를 선호하도록 성장 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 동기화는 PAO1에서 LES 파지 복제의 중요한 단계와 관련된 주요 유전자 마커의 발현 수준을 정량화하기 위해 Real-Time PCR로 검증할 수 있습니다. 동일한 접근법은 이전에 대장균 11,17,21,22에서 운동성, 내산성 및 항균성 내성에 영향을 미치는 Shiga-toxigenic 파지의 프로파지 제한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>PAO1</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LESB58</td><td></td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>LES 파지는</td><td>Norfloxacin을 사용하여 LESB58에서 유도 및 정제되었습니다.</td><td>이 연구는</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td> <td>Merck</td><td>1.10285.500</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Agar Fisher</td><td>A / 1080 / 53</td><td></td></tr><tr><td>Top Agar</td><td>0.4 g Agar + 2.5 g LB 100 mL 물에 국물; 오토 클레이브 및 사용.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>시그마 (재고 : 메탄올 50 mg / mL - 잘 섞어 0.22 &micro를 사용하십시오. -20°C에서 살균하고 저장하는 M 여과기; C 사용할 때까지)</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>피셔 1 % (v / v) 물</td><td>10060000</td><td></td></tr><tr><td>Norfloxacin</td><td>Sigma (재고 : 25 mg / mL의 1 % 빙하 아세트산을 잘 섞고 0.22 &micro를 사용하십시오. -20°C에서 살균하고 저장하는 M 여과기; C를 사용할 때까지; 동결 해동 주기를 방지하려면 작은 분취물로 보관하십시오)</td><td>N9890</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액으로 포화된 페놀 pH 4.3</td><td>Sigma</td><td>P-4682</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 에탄올</td><td>Fisher</td><td>16695992</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>12044977</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher</td><td>11398187</td> 이소프로판올 Fisher 17150576 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>10X TURBO DNase</td><td></td><td>Ambion AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS, BR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q10210</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptIII first strand synthesis kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>PCR 시약</td><td>Bioline Mytaq Red 2X</td><td>BIO-25043</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 시약</td><td>Sensifast SYBR Hi Rox</td><td>BIO-92020</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>분리 II PCR 및 겔 키트</td><td>BIO-52060</td><td></td></tr><tr><td>TA 클로닝 키트</td><td>TA 클로닝 키트, pCR 2.1 벡터 포함, 적격 세포 미포함</td><td>K202040</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real Time PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

전사체학(transcriptomics)을 통한 온대 박테리오파지가 라이소겐에 미치는 영향 이해

Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics

온대 파지는 대부분의 박테리아 게놈에서 프로파지로 통합되는 것으로 발견됩니다. 일부 프로파지는 비밀스럽고 박테리아 염색체에 고정되어 있지만 다른 프로파지는 활성화되어 자발적으로 또는 유도 인자에 노출되어 복제 형태로 촉발될 수 있습니다. 프로파지는 일반적으로 숙주 세포에 독소 생산 또는 기타 독성 관련 형질을 부여하는 능력과 관련이 있습니다. 보다 최근의 연구는 그들이 숙주의 생리학을 변화시키는 데 훨씬 더 큰 역할을 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기에 설명된 기술을 통해 프로파지가 기회 박테리아 녹농균의 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지 조사할 수 있었습니다.
이 연구에서, 야생형 녹농균 균주 PAO1의 성장은 Liverpool Epidemic Strain(LES) LESB58의 다양한 프로파지 조합을 운반하는 동인성 라이소겐의 성장과 비교되었습니다. 라이소겐 배양에서 박테리아 세포의 일부는 파지 입자의 조립과 관련된 것과 같은 후기 파지 유전자의 세포당 높은 수준의 발현으로 용해성 박테리오파지 복제(자발적 유도)를 지원하여 라이소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 마스킹합니다. 따라서 자발적 유도의 영향은 라이소겐 집단에서 프로파지 유전자 발현을 모호하게 할 수 있습니다.
성장 프로파일링 실험은 초기 기하급수적 성장 단계에서 최소화된 자발적 유도를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 초기 기하급수적 성장 단계에서 샘플 배양을 준비하는 방법과 낮은 세포 수에도 불구하고 적절한 대조군을 설정하는 방법을 보고합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 조건에서 야생형 및 용원 박테리아의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 비교를 보장하여 프로파지 게놈의 전사체 프로파일링을 개선하고 이전에 인식되지 않은 프로파지 기능을 식별하는 데 도움이 됩니다.

이 연구에서는 비유도 조건에서 성장한 PAO1 LESΦ2 라이소겐 배양에서 파지 생산의 직접적인 시간적 열거를 사용하여 자발적인 LESΦ2 유도의 영향을 확인했습니다. 파지 밀도는 성장의 초기 기하급수적 단계에서 신선한 배지에서 하위 배양 후 ~2.61 x 106 플라크 형성 단위(PFU)·mL−1 2시간의 평균으로 가장 낮은 지점에 있었으며, 이는 라이소겐이 지배적인 상태임을 시사합니다. LESΦ2 역가는 4시간 이내에 평균 ~2.4 x 108 PFU·mL−1로 급격히 증가했으며 6시간 후 최고 밀도에 도달했습니다(평균 ~5.83 x 109 PFU·mL−1; 그림 4).
최소 자발적 유도는 라이소겐 성장의 초기 로그 단계(2시간 후)에서 관찰되었습니다. 그러나, 배양 배지에서 측정 가능한 파지의 존재는 다음을 포함한 많은 이전 사건의 결과였습니다: 단백질 헤드로의 핵산 패키징, 파지 입자로의 단백질 조립, 후기 파지 유전자, 중간 단계 파지 유전자 및 초기 조절 파지 유전자의 발현. 파지 관련 복제 이벤트가 발현되기 전에 감염된 세포를 포착하는 것이 중요했습니다. 따라서 90 min은 입회 전에 문화가 성장할 수 있도록 선택되었습니다. PAO1의 유전자 발현 프로파일을 캡처하기 위해 배양물에서 LESΦ2 라이소겐 샘플을 3.4단계에서 언급한 대로 90분 동안 유도 전 및 유도 후에 수확했습니다. 이 90분 시점은 2.3.2단계의 플라크 분석에서 상주 프로파지의 높은 수준의 자발적 유도가 감지되기 훨씬 전입니다. 초기 기하급수적 성장 동안 박테리아 세포 밀도가 낮았기 때문에 유전자 발현 연구를 위한 충분한 물질을 보장하기 위해 배양 부피를 최대 800mL까지 확장했습니다. 샘플은 10분마다 유도되지 않은 배양 및 유도 배양에서 수집되었으며, RNA를 추출하여 박테리아 성장 중 용해 및 용해 복제에 대한 주요 마커의 발현 프로파일을 매핑했습니다. 총 RNA를 정제하고 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 qPCR 분석을 사용하여 게놈 DNA가 없는지 검증했습니다(단계 6.1). RIN ≥ 9에 도달한 샘플은 품질 관리를 통과하여 cDNA로 변환되었습니다.
주석이 달린 LESΦ2 게놈을 검사하여 온대 파지의 용원 및 용해 복제 주기에서 잘 알려진 유전자를 식별했습니다. 그런 다음 이러한 식별된 유전자를 사용하여 유도 및 비유도 배양에서 라이소겐 주기 제한 및 용해 주기 관련 유전자의 발현 프로파일링을 위한 qRT-PCR을 검증했습니다. 절대 DNA 복제 수를 정량화하고 R36을 사용하여 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 수행하여 유도되지 않은 배양과 유도된 배양의 발현 수준을 비교했습니다(그림 5). 유도되지 않은 배양에서 ~2.31 x 109 카피에서 유도 후 30분 후 ~3.02 x 1011 카피로 cro 유전자(용해 복제의 초기 마커)의 발현이 현저하게 증가하였다(Wilcoxon 부호 순위 테스트: p < 0.01). 유사하게, 용해 복제의 중간 단계 마커 인 O 단백질과 P 단백질은 (그리고 파지 게놈 복제에 관여 할 것으로 예측되는) ~ 1.74 x 108에서 ~ 1.25 x 10 10 사본 (Wilcoxon 부호 순위 검정 : p < 0.01) 및 ~ 6.05 x 102에서 ~ 5.68 x10 5 사본 (Wilcoxon 부호 순위 테스트 : p < 0.01)입니다. 마지막으로, 꼬리 관련 구조 유전자는 용해 복제 주기의 후기 마커로 사용되었습니다. 다시 말하지만, 유도되지 않은 배양에서 ~2.31 x 106 카피에서 유도 후 30분 후 ~4.38 x 108 카피로 발현이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(Wilcoxon 부호 순위 테스트: p < 0.01). 따라서, 정량적 RT-PCR 데이터는 용해 복제를 위한 잘 확립된 마커 유전자의 유전자 발현이 예상된 경향을 따랐음을 확인했으며, 초기, 중기 및 후기 마커는 예측된 순서로 다중 배의 차등 발현을 보였습니다(그림 5). 용해 복제에 대한 마커의 발현이 회복 후 30분 후에 상향 조절되었기 때문에, 이는 용해 주기 동안 활성 온대 파지와 박테리아 숙주의 전사체 지형을 연구하기 위한 적절한 대표 시점으로 간주됩니다.
유도되지 않은 조건에서 용해 유전자의 일부 발현을 관찰하여 초기 로그 단계에서 방출된 PFU에 대한 CFU의 비율이 가장 높은 최적화된 배양에서도 일부 자발적 유도가 항상 발생한다는 것을 확인했습니다. 이는 전사체학 데이터에는 항상 일정 수준의 "노이즈"가 존재한다는 것을 의미하며, 이는 유도 및 비유도 배양을 포함하여 신중하게 준비된 대조군의 중요성을 강화합니다. 발현의 접힘 변화를 결정하기 위한 내부 대조군 유전자의 적절한 선택은 유도되지 않은 샘플과 유도된 샘플 모두에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자를 식별하기 위해 전사체학 데이터를 주의 깊게 검사하는 데 달려 있습니다. 우리의 예비 결과는 rpoD가 테스트된 가장 신뢰할 수 있는 대조 유전자였으며 가장 안정적인 발현을 가졌음을 시사합니다(~1.71 x 10 유도 전 5개 사본 및 유도 후 30분 후 ~3.33 x 105개 복제; Wilcoxon 부호 순위 검정: p = 0.3594)와 16S rRNA 또는 proC 유전자 비교(그림 5). 내부 통제 표현의 가변성은 성적표의 절대 수를 측정하도록 이끌었습니다. 전사체학 데이터의 향후 검사는 추가 검증을 위한 적절한 내부 통제의 선택에 도움이 될 것입니다.
cI 유전자는 용원성(lysogeny)의 잘 알려진 표지자이기 때문에 유전자 프로파일링 연습에 사용되었습니다. 용해 복제에 대한 마커와 비교하여, cI 유전자의 발현은 비교적 안정적이었지만(그림 5), 이 유전자의 복제 수는 용해 복제에 대한 마커의 복제에 비해 유도되지 않은 배양에서 안심할 수 있을 정도로 높았습니다. 이러한 데이터는 동일한 샘플에서 낮은 PFU 수치와 일치하므로 높은 억제제 발현이 낮은 수준의 파지 생산과 관련이 있음을 확인합니다. 여기에 보고된 데이터는 이 특정 파지에 대한 cI 전사체의 발현이 Stx 파지(11,17)에서 볼 수 있듯이 유도 후 현저하게 하향 조절되지 않음을 보여줍니다. repressor 활성은 일반적으로 transcriptional 및 post-translational 수준 모두에서 제어되므로 repressor 유전자는 전사될 수 있지만 결과 단백질은 즉시 autocleavage를 받습니다. 전사 및 번역 후 대조군을 검증하기 위해 추가 실험이 필요합니다. 또한, 표준 곡선에서 qPCR의 최소 검출 한계는 ~102 사본으로 보입니다.
플라크 및 qRT-PCR 분석에서 얻은 결과는 RNA-Seq 실험을 위한 잘 제어된 입력을 생성하기 위한 배양 및 RNA 시료 전처리에 대한 당사의 전략을 검증합니다. 초기 지수 단계의 유도되지 않은 배양은 낮은 수준의 자발적 유도 및 용해 유전자 발현을 보였으며, 이는 lysogeny의 우세를 시사합니다. 대조적으로, 유도 후 30분 후에 분리한 배양물은 용해 복제의 우세를 나타내는 마커 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig01.jpg"> 그림 1: 리팜피신 내성 지표 호스트를 만들기 위한 프로토콜(BioRender.com 로 생성됨). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig02.jpg"> 그림 2: 동일한 샘플에서 라이소겐의 PFU 및 CFU를 열거하기 위한 실험 설계. (BioRender.com 로 생성) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig03.jpg"> 그림 3: RNA 분리를 위한 유도 및 비유도 배양 샘플링을 위한 실험 설계. (BioRender.com 로 생성) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig04.jpg"> 그림 4: 자발적 유도의 시간적 열거. PAO1 Φ2 라이소겐의 PFU와 동시 CFU, n = 8(2개의 생물학적 복제 및 4개의 기술적 복제)을 사용한 자발적 LES 프로파지 생산의 시간적 계수; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 짙은 빨간색 점은 CFU·mL−1 (LB)을 나타냅니다. 짙은 파란색 점은 PFU·mL−1 (LB)을 나타냅니다. 라이소겐에 의한 φ2 감염성 파지의 자연 방출은 접종 후 2시간에 측정 가능한 가장 낮은 수준입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64945/64945fig05.jpg"> 그림 5: 표적 마커 유전자의 절대 복제 수. 파지 마커 유전자의 절대 복제 수는 RT-qPCR을 사용하여 유도된 용원 및 용해 주기에서 중요한 역할을 할 것으로 예상되는 유전자의 예측된 발현 패턴을 확인합니다. 이 점들은 세 개의 생물학적 복제와 세 개의 기술적 반복실험(n = 9)을 모두 나타냅니다. (ᅡ) 빨간색 상자는 lysogeny 마커 cI를 나타냅니다. (B) 녹색은 초기 용해 마커인 cro를 나타냅니다. (C,D) 파란색은 중간 용해 마커, DNA 복제 유전자를 나타냅니다. (E) 자홍색은 후기 용해 마커, 꼬리 구조 유전자를 나타냅니다. (F-H) 회색은 내부 대조군으로 사용된 숙주 마커를 나타내고, (I) 흰색은 유도 대조군으로 사용된 DNA 자이라제 B를 나타냅니다. 수평 실선은 분포의 중위수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/64945fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 연구에서 설계된 프라이머. 이 연구에 사용된 마커 유전자 및 내부 대조군에 대한 특정 프라이머의 염기서열이 해당 NCBI 가입 ID와 함께 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: qPCR 표준 곡선을 사용하여 계산된 이 연구에 사용된 프라이머의 효율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64945/Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜을 통해 숙주에 대한 프로파지의 영향을 밝힐 수 있습니다. 박테리아 배양은 용원 상태를 가장 잘 지원하는 조건을 사용하여 동기화되어 자발적 유도를 제한합니다. RT-qPCR은 프로파지 제한 유전자 및 파지 제어에서 결합되지 않은 유전자를 용해 복제 주기 동안 발현되는 유전자와 명확하게 구별합니다.

Temperate phages are found integrated as prophages in the majority of bacterial genomes. Some prophages are cryptic and fixed in the bacterial chromosome, ...

프로파지는 박테리아 게놈에 통합된 박테리아 파지입니다. 우리는 프로파지가 박테리아 숙주의 생물학에 미치는 영향을 포괄적으로 탐구하기 위해 전사체 접근법을 사용하고 있습니다. 여기에 설명된 방법은 프로파지 용해 주기의 자발적 유도라는 주요 과제를 해결합니다.배양 조건의 신중한 최적화를 통해 프로파지 상태에서 유전자 발현을 깔끔하게 프로파일링할 수 있습니다. 프로파지는 대부분의 박테리아 병원체에서 발견되지만 그 중요성은 일반적으로 이해되지 않습니다. 이러한 도구는 여러 박테리아 기능의 조절자로서 프로파지의 역할을 조명할 수 있습니다.아직 연구되지 않은 프로파지 숙주 관계는 거의 무한합니다. 이는 이러한 프로토콜이 예측하는 데 도움이 될 수 있는 잠재적인 치료 표적의 거대한 미개발 자원을 나타냅니다. 주요 과제는 라이소겐 성장과 자발적인 프로파지 유도의 균형을 맞추기 위해 올바른 배양 조건을 찾는 것입니다.잘 알려진 2차 과제인 lyson은 다운스트림 연구를 위한 RNA 무결성을 유지합니다. 100 밀리리터의 LB를 1:100의 비율로 접종하여 신선한 라이소겐 및 지표 숙주 배양을 시작합니다. 섭씨 37도에서 180RPM으로 흔들어 배양합니다.라이소겐 성장을 모니터링하려면 접종 시점부터 8시간 동안 매시간 1밀리리터 샘플을 수집합니다. 직렬로, LV 배지의 900 마이크로 리터에 100 마이크로 리터를 첨가하여 배양을 희석합니다. 최대 속도로 소용돌이치고 10에서 마이너스 1, 10에서 마이너스 9로 희석 시리즈를 계속합니다.필요한 희석액 10마이크로리터를 LB 오거 플레이트에 묻힙니다. 건조시키고 섭씨 30도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 배양 후 콜로니의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 생존 가능한 박테리아 세포의 수를 계산합니다.다음으로, 측두엽 샘플에서 감염성 파지 입자를 열거하기 위해 리팜피신과 함께 100마이크로리터의 로그 상 리팜피신 내성 지표 숙주 세포를 용융된 상단 오거에 추가합니다. 연속적으로 희석된 10마이크로리터의 라이소겐 배양액을 접종된 상단 오거 층에 스포팅합니다. 건조시키고 섭씨 37도에서 18-24시간 동안 배양합니다.배양 후 플라크의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 감염성 파지 입자를 계산합니다. 첫 번째 플라스크는 유도되지 않음으로, 다른 플라스크는 유도됨으로 라벨을 붙이고 각 샘플을 채취해야 하는 시점을 표시합니다. 그런 다음 8개의 250밀리리터 플라스크에서 1 대 100의 비율로 80밀리리터의 LB에서 하룻밤 동안 성장한 용원 배양물을 하위 배양합니다.플라스크를 섭씨 37도에서 180RPM으로 흔들어 배양합니다. 90분 후 600나노미터의 광학 밀도가 0.1에서 0.2 사이일 때 유도되지 않은 플라스크에 4마이크로리터의 1% 빙초산을 추가합니다. 유도되지 않은 플라스크에서 80 밀리리터 배양액을 720 밀리리터의 LB에 첨가하고 즉시 160 밀리리터의 정지 용액을 첨가한 후 플라스크를 30분 동안 얼음 위에 두어 RNA 전사체를 안정화시킵니다.다음으로, 80 밀리리터의 배양액을 함유 한 유도 라벨 플라스크에 밀리리터당 1 마이크로그램의 최종 농도로 노르플록사신을 첨가합니다. 잘 섞고 섭씨 37도에서 180RPM으로 1시간 동안 흔들어 배양합니다. 720 밀리리터의 LB에 80 밀리리터의 유도 배양액을 첨가하여 세포가 회복되도록 합니다. 정지 용액을 추가하여 0분에서 1시간까지 10분마다 각 플라스크에서 박테리아 세포를 수확합니다.4 섭씨 온도에 15 분 동안 10, 000 G에 분리기 및 상층액을 폐기하십시오. 조정 가능한 자동 피펫을 사용하여 잔류 액체에 펠릿을 부드럽게 다시 부유시키기 전에. 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 관에 현탁액을 옮기고 13에 원심분리기, 4 섭씨 온도에 1 분 동안 000 G.잔류 상층액을 버리고 펠릿을 액체 질소로 급속 동결하기 전에 미세분리기 튜브를 밀봉합니다. 각 냉동 펠릿에 1mL의 Trizol을 추가하고 피펫팅으로 현탁액을 균질화합니다. 관심 파지의 각 복제 단계에서 마커 역할을 할 수 있는 표적 유전자 세트를 식별한 후 관련 프라이머를 사용하여 게놈 DNA에서 각 표적 유전자를 증폭합니다.텍스트 원고에 기술된 증폭 조건을 사용하여 PCR을 수행합니다. PCR 후 PCR 정제 키트를 사용하여 각 앰플리콘을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 TA 클로닝 벡터에서 클로닝합니다. Sanger 염기서열분석을 통해 각 복제된 산물의 염기서열을 확인합니다.4개의 개별 플라스미드의 복제 수를 계산한 후, 플라스미드 DNA를 뉴클레아제 유리수에 연속적으로 희석하여 각 마커 유전자에 대한 표준 템플릿을 준비합니다. 각 타겟에 대해 1마이크로리터의 CDNA와 각 플라스미드 표준물질을 96웰 플레이트에 추가합니다. 그리고 제조업체의 지침에 따라 정량적 PCR을 수행합니다.PCR 후 Excel 프로그램을 사용하여 로그 DNA 복제 수와 주기 임계값을 플로팅합니다. 선형 회귀 계산을 수행하여 결정 계수와 선형 방정식을 표시합니다. 다음으로, 선형 회귀에서 파생된 선형 방정식을 사용하여 각 목표값에 대한 복사 수를 추정합니다.그런 다음 표준 곡선의 선형 회귀와 주어진 방정식의 매개변수를 사용하여 PCR 증폭의 효능을 계산합니다. 효율 측면에서 프라이머를 검증한 후 DNA의 절대 복제 수를 계산합니다. 자발적인 프로파지 생산이 적다는 시간적 열거는 2시간에서 세포당 가장 낮은 PFU 수와 6시간에 세포당 가장 높은 PFU 수를 시사했습니다.그런 다음 라이소겐은 2시간에 가장 안정적이었습니다. 따라서 이 조건은 QRTPCR 프로파일링에 사용되었습니다. 유도되지 않은 배양에서 2.31 배 10에서 9 번째 사본으로 용해 복제의 초기 마커인 cro 유전자의 발현이 현저하게 증가하여 유도 후 30 분 후에 10 대 11 사본으로 3.02 배 10 번째가 관찰되었습니다.마찬가지로, 용해 복제의 중간 단계 마커인 P 및 O 단백질도 각각 1.74 x 10에서 8번째에서 1.25 x 10 카피로, 6.05 x 10에서 두 번째에서 5.68 x 10에서 5번째 카피로 상당한 상향 조절을 보여주었습니다. 용해 복제 주기의 후기 마커는 유도되지 않은 배양물에서 유도 후 30분까지 발현이 상당히 증가했음을 나타냈습니다. 테스트된 내부 대조군 중 RPOD는 16개의 SRNA 또는 ProC 유전자에 비해 가장 안정적인 발현을 보였습니다.용해 복제에 대한 마커와 비교했을 때, C-one 유전자의 발현은 비교적 안정적이었습니다. 그럼에도 불구하고, C-one 유전자의 복제 수는 용해 복제에 대한 마커와 비교하여 유도되지 않은 배양에서 안심할 수 있을 정도로 높았습니다. 제대로 준비된 RNA 라이브러리에서는 좋은 데이터나 해석을 얻을 수 없습니다.자발적 유도와 RNA 무결성을 제어하는 것이 가장 중요합니다. 모든 유전자의 시간적 역학은 발현 프로파일링을 사용하여 연구할 수 있습니다. 올바른 실험 조건과 시점을 조정하는 것은 모든 자극에 대한 생물학적 반응을 올바르게 매핑하는 데 중요합니다.이 기술은 두 개의 서로 다른 프로파지 숙주 파트너십 사이의 이전에 알려지지 않은 상호 작용을 식별했습니다. 대부분의 박테리아는 연구되지 않은 프로파지를 수용하기 때문에 이 접근법은 많은 새로운 치료 표적 또는 응용 분야를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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연구

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생물학

이 문서는 박테리오파지 람다의 감염의 휘황 라벨이 지정된 버전을 준비하기위한 절차를...

에 셀 운명을 따라<em&gt; E. 대장균</em&gt; 파지 람다에 의해 감염 후

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

여기에서는 추정되는 파지 유전자의 기능적 특성화를 위한 표현형 접근법을 제시합니다. 기술에는 숙주 동화 대사를 모니터링할 수 있는 개발된 분석법, 다중 표현형 분석 플레이트(MAP), 이화 대사에 대한 효과를 측정할 수 있는 확립된 대사체학 방법 등이 포함됩니다.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

이 프로토콜은 박테리오파지 칵테일의 항균 효능을 선별하기 위해 고처리량 설정을 사용하는 강력한 방법을 설명합니다.

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박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.

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쥐 장에서 T4 박테리오파지와 대장균 상호작용: 생체 내 숙주-박테리오파지 역학 연구를 위한 프로토타입 모델

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우리는 환경 mRNA로부터 cDNA 생성하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 총 RNA는 먼저 환경에서 수집, rRNA는 선택, 제거 mRNA가 선택적으로 증폭되고 농축 mRNA 수영장에서 합성된 cDNA가 합성됩니다. 복구된 시퀀스는 표현 유전자를 식별하는 표준 생물 정보학 기술을 사용하여 주석하실 수 있습니다.

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