Name: 염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: 배우세요 염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집 방법을. 혈전 성장과 구조의 세포 수준 변화를 재현 가능하게 연구하여 심혈관 질환 치료 개발에 기여합니다.

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저자는 이 원고를 주의 깊게 정독한 Whiteheart Laboratory 회원들에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH, NHLBI(HL56652, HL138179 및 HL150818)의 보조금과 SWW에 대한 재향 군인회 공로상, BS에 R01 HL 155519, RDL에 대한 NIBIB 교내 프로그램 보조금으로 지원되었습니다.

여기에서 논의된 모든 실험은 켄터키 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인했습니다.
참고: 수술 기구는 그림 1 과 재료 표에 나와 있습니다. C57BL/6J 마우스, 8-10주령, 수컷/암컷 또는 관련 유전자 조작(Knockout 또는 Knockin) 균주를 사용했습니다.
1. FeCl3 유발 경동맥 손상
<ol><li>마우스 마취 유도<ol><li>마우스의 무게를 잰다.</li>
		<li>0.2g/kg 트리브로모에탄올 용액을 복강내(i.p.) 주사하여 마우스를 마취합니다. 마취액을 주입하기 전에 실온(RT)에 있는지 확인하십시오. 이 용량은 약 1 시간 동안 마우스를 진정시키기에 충분합니다.</li>
		<li>주사 후 5분 후에 발가락을 꼬집어 발가락 반사를 확인하여 마우스가 진정되었는지 확인합니다. 마우스가 진정되지 않으면 발가락이 당겨집니다. 이 경우 5분 정도 기다렸다가 다시 확인하세요.</li>
		<li>마우스가 여전히 완전히 진정되지 않으면 초기 용량의 1/4을 투여하고 5 분 동안 기다리십시오.</li>
		<li>시술 전반에 걸쳐 발가락 핀치를 통해 마우스의 마취면을 주기적으로 모니터링하십시오. 또한 최적의 마취를 유지하기 위해 호흡수와 체온을 모니터링할 수도 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스를 고정시킵니다<ol><li>마우스를 앙와위 자세로 가열 패드(37°C)에 놓고 접착 테이프를 사용하여 사지를 고정합니다.</li>
		<li>수술용 실(0.1mm)을 사용하여 마우스의 위쪽 앞니를 부드럽게 당겨 경추/목 부위를 확장합니다. 이는 수술 부위를 더 잘 시각화하고 도플러 프로브의 안정성을 높이는 데 중요합니다. 실의 크기는 목을 늘리기 위해 동물의 앞니를 당기는 데만 사용되기 때문에 중요하지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>베기<ol><li>수술 부위에 70% 에탄올을 뿌리거나 알코올 물티슈로 닦아냅니다.</li>
		<li>면봉을 사용하여 수술 부위에 소량의 제모 크림을 바릅니다. 1-2분 동안 기다린 다음 젖은 종이 타월이나 티슈를 사용하여 크림을 제거합니다. 알림: 이 단계는 깨끗한 수술 부위에 중요합니다.</li>
		<li>가위와 집게(그림 1B11,1B13)를 사용하여 하악에서 흉골 위 노치까지 정중선을 절개합니다. 영역을 더 잘 시각화하기 위해 피부를 수축시킵니다(그림 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>경동맥 노출<ol><li>외과 용 겸자와 미세 해부 겸자를 사용하여 겹쳐진 표면 근막을 무디게 해부하고 제거하여 왼쪽 경동맥을 노출시킵니다 (그림 1B12,1B13). 이 단계에서 가위를 사용하지 마십시오.tage 이 부위의 다른 혈관 구조가 손상되지 않도록 하십시오.</li>
		<li>경동맥을 둘러싼 여분의 조직을 제거하십시오. 이 부위에는 미주 신경과 척추 동맥이 있으므로 주변 조직의 과도한 절개를 피하십시오.</li>
		<li>경동맥을 수술 및 봉합사 묶는 집게로 해부하여 주변 조직과 분리합니다(그림 1B12,1B15,2C). 동맥이나 주변 혈관 구조에 기계적 손상을 방지하기 위해 동맥을 확장하거나 당기지 마십시오.</li>
		<li>부상 위치를 표시하기 위해 동맥 아래에 플라스틱 조각을 놓습니다(그림 2D). 수술 현장에서 더 쉽게 볼 수 있도록 컬러 투명 시트를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>유량 프로브의 배치<ol><li>도플러 천음향 흐름 프로브를 식염수(0.9% NaCl indH2O)에 약 10분 동안 수술 전에 놓습니다. 유량을 쉽게 읽을 수 있도록 프로브의 다른 쪽 끝을 유량계의 부착물에 삽입합니다. 유량계를 컴퓨터에 연결합니다. 알림: 수술 사이에 도플러 천음속 유량 프로브는 식염수에 있어야 합니다. 절차 내내 프로브를 촉촉하고 깨끗하게 유지하십시오.</li>
		<li>초음파 도플러 천음속 흐름 프로브를 플라스틱의 상류 동맥 주위에 놓습니다(그림 2D). 프로브의 용기 홀더 영역이 너무 확장되지 않았는지 확인합니다(그림 1C, 빨간색 화살표). 알림: 필요한 경우 거즈 패드(그림 1B1)로 프로브를 지지하여 프로브의 적절한 높이를 달성하여 최적의 판독 위치를 용이하게 합니다.</li>
		<li>이 시점까지 수술 부위가 건조하면 RT 식염수 몇 방울을 추가하여 해당 부위를 촉촉하게 유지하십시오. 유량 프로브 판독값을 모니터링합니다. 최적의 판독값은 동물마다 다르며 0.6-1.2mL/분 사이일 수 있습니다. 덜 안정적이거나 안정적이지 않은 경우 최적의 판독값을 얻기 위해 유량 프로브 위치를 변경하십시오. 참고: 마우스의 목이 너무 길어지지 않았는지, 수술 부위가 깨끗한지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>흐름 기준선 기록<ol><li>프로브를 배치한 후 2분 동안 혈류를 모니터링하여 흐름이 안정적인지 확인합니다. 그런 다음 2분 동안의 흐름을 기준으로 기록합니다(그림 3B). 유량계에 대한 자세한 설명은 Subramaniam et al.17을 참조하십시오.</li>
		<li>혈류를 기록하려면 WinDAQ 소프트웨어를 시작하십시오. 파일 옵션을 클릭 한 다음 기록을 클릭하십시오. 새 폴더와 파일을 만들고 녹음을 시작합니다. 녹음을 중지하려면 파일 섹션에서 중지 를 클릭하십시오. 참고: WinDAQ 소프트웨어는 출판사에서 무료로 사용할 수 있습니다: https://www.dataq.com/products/windaq/.</li>
	</ol></li>
	<li>부상<ol><li>흐름 기록을 중지합니다. 부상 후 판독값이 일정하게 유지되도록 프로브 위치를 변경하지 않도록 하십시오.</li>
		<li>물티슈/종이 타월로 해당 부위를 완전히 말리십시오. 알림: 소량의 잔류 액체라도 혈관 손상을 입히는 데 사용되는 FeCl3 용액의 농도를 변경할 수 있습니다. 이는 다양한 결과로 이어지고 재현성에 영향을 미칩니다. 해당 영역이 완전히 건조되면 프로브가 유량을 측정할 수 없습니다.</li>
		<li>플라스틱 계량 보트에 원형 여과지 (직경 1mm, 직경 1mm 이어 펀치로 자른 것)를 넣습니다. 1 μL의 6 % FeCl3 용액 (dH2O로 만든)을 여과지에 첨가한다. 알림: 여과지를 사용하기 직전에 FeCl3 용액을 추가해야 합니다. 종이를 너무 일찍 담그면 FeCl3 용액이 증발하고 부상의 심각성이 바뀔 수 있습니다.</li>
		<li>미세 집게를 사용하여 여과지를 집어 플라스틱으로 표시된 동맥 부분의 프로브 상류에 놓습니다(그림 2D,E). 이 플라스틱은 마커와 스페이서 역할을 합니다. 부상 부위를 표시하고 주변 습한 부위와의 접촉을 피함으로써 FeCl3 의 우발적 인 희석을 방지합니다. 알림: 여과지가 똑바로, 끼이거나 어떤 식으로든 접히지 않았는지 확인하십시오. 동맥에 놓인 후에는 여과지의 위치를 변경하지 마십시오. 그렇게 하면 부상의 정도가 바뀝니다.</li>
		<li>여과지를 놓은 후 타이머를 시작하고 혈류를 기록하십시오. 3분 후 종이를 제거하고 부상 부위에 식염수를 첨가하여FeCl3 를 제거하고 부상 과정을 중지합니다. 또한 해당 부위를 촉촉하게 만듭니다. 이 단계에서 혈류는 기록 된 부상 전과 같이 기준 수준으로 돌아 가야합니다.</li>
		<li>원래 기록의 10%로 감소하거나 0에 도달할 때까지 흐름을 모니터링하고 기록합니다. 손상 부위에 혈전이 형성되기 시작하면 꾸준히 감소합니다(그림 3C). 이 시간 동안 흐름의 상당한 변동에 유의하십시오.</li>
		<li>혈전의 안정성을 연구하려면 각각의 유의미하고 일관된 감소 후 혈류의 급격한 증가를 기록하십시오. 이러한 사건은 불안정한 혈전증으로 인한 색전술로 분류됩니다(그림 4D). 유량이 지속적으로 감소한 후 작업자는 실험이 종료될 때 동맥의 손상을 볼 수 있습니다(그림 2F, 파란색 화살표/점선 타원).</li>
		<li>혈관 폐색 시간은 최소 1분 동안 혈류가 완전히 중단된 것으로 정의됩니다. 폐색 혈전이 형성되는 시간을 기록하며, 판독값이 0이거나 흐름이 크게 감소합니다.</li>
		<li>30분에 실험을 종료합니다. 모니터링 후 30분 이내에 혈전이 형성되지 않으면 흐름을 기록하고 기록을 중지한 다음 프로브를 제거합니다.</li>
		<li>70% 에탄올과 브러시로 프로브를 청소하여 잔여 조직/머리카락 또는 부스러기를 제거합니다. 보관 상자에 넣기 전에 프로브를 완전히 건조시키십시오. 장기 보관을 위해 보관 상자에 넣기 전에 프로브를 완전히 건조시키십시오.</li>
		<li>자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 시체를 시체 처리 가방에 넣고 실험실 이름과 날짜가 표시되어 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>
2. FeCl3 유발 손상 후 직렬 블록 표면 주사 전자 현미경(SBF-SEM) 연구를 위한 샘플 수집 및 준비
참고: 제시된 EM 프로토콜은 s에 적합합니다.ampSBF-SEM을 위한 준비. 이 이미징 기술은 혈전에서 혈소판의 3차원 구조를 연구하는 전례 없는 능력을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 샘플이 일련의 순차적 블록 SEM 이미지로 시각화되며, 샘플을 진행하면서 생성됩니다. 이 준비의 요점은 다음과 같습니다 : 1) 샘플은 미리 임베딩 된 중금속으로 염색되어야합니다. 2) 플라스틱 내장 샘플은 SEM 내에 장착하기 위해 적절하게 트리밍되어야 합니다(트리밍된 샘플의 시각적 내용은 그림 6 참조). SEM 내에서는 포매 후 염색이 불가능합니다. EM 분석을 위해 FeCl3 유발 혈관 손상에서 샘플을 수집할 때 수술을 수행하는 동안 다음과 같은 변경이 필요합니다. 제시된 FeCl3 수술 프로토콜의 수정은 모든 형태의 전자 현미경에도 적용할 수 있습니다. 마취 상태와 절개 및 경동맥 노출 단계는 프로토콜 1과 동일합니다.
<ol><li>경동맥을 노출시킨 후 두 수술실(크기: 0.1mm) 사이의 영역을 느슨하게 둘러싸서 부상 부위를 표시합니다(그림 5A,B).</li>
	<li>프로브를 하부 나사산에서 말단의 동맥 아래에 놓습니다(그림 5C).</li>
	<li>두 나사산 사이의 동맥 아래에 플라스틱 조각을 삽입하여 FeCl3 손상 부위를 표시합니다(그림 5C).</li>
	<li>부상을 입기 전에 유량을 측정하여 기초 유량을 기록하십시오. 이러한 측정은 샘플을 수집할 단계를 결정하는 데 사용됩니다. 알림: 고정액(3% 파라포름알데히드/PFA + 0.1% 글루타르알데히드, 둘 다 1x PBS로 만듦)이 준비되어 있고 RT에 있는지 확인하십시오. 또는 식염수 배경에 2.5% 글루타르알데히드로 고정하는 것도 사용할 수 있습니다. 주의: 파라포름알데히드와 글루타르알데히드는 모두 독성이 강하고 자극적입니다. 취급하는 동안 장갑, 보안대 및 마스크를 사용하여 노출로부터 보호해야 합니다. 모든 고정 용액은 독성이 있으며 고정 단계는 흄 후드에서 수행해야합니다.</li>
	<li>FeCl3에 담근 여과지를 동맥(8% FeCl 3 사용)에3 분 동안 놓아(이 시간도 다를 수 있음) 부상을 수행합니다. 3분 후 여과지를 제거하고 부상 부위에 식염수를 추가하여 과도한 잔류 FeCl3를 제거합니다. 이 단계는 손상의 가변적인 정도를 방지하고 프로브에 의한 유량 계수를 용이하게 하기 위해 필요합니다(그림 5D).</li>
	<li>흐름 판독값을 모니터링합니다. 유량이 초기 값의 50% 미만으로 떨어지면 프로브를 제거합니다. 해당 부위를 빠르게 건조시키고 해당 부위에 고정제를 추가하여 부상 부위를 외부에 고정합니다.</li>
	<li>집게로 부상 부위 근처의 동맥을 즉시 잡고 하부 실의 하류와 상부 실의 상류를 절단합니다. 필요한 경우 다른 사람에게 한쪽 끝을 자르는 것을 도와달라고 요청하십시오. 플라스틱 조직 배양 접시에 조직을 채취 한 것과 같은 방향으로 놓고 고정액을 몇 방울 떨어 뜨립니다. 알림: 동맥을 절단하면 즉시 광범위한 출혈이 발생하므로 처음 절단하기 전에 동맥을 잡고 있어야 합니다. 이 시나리오에서는 마우스가 방혈됩니다. 마우스는 출혈과 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 동맥 주변의 여분의 조직을 청소하십시오. 혈류의 방향을 기록하는 데 유의하십시오. 이를 표시하려면 한쪽 끝을 수평으로 자르고 다른 쪽 끝을 가늘어지거나 비스듬히 자릅니다(그림 5E).</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 고정액(3% PFA 및 0.1% 글루타르알데히드)에 샘플을 보관합니다. 그런 다음 EM 분석을 위해 샘플 처리 실험실로 보낼 때까지 4°C에서 1% PFA에 샘플을 보관합니다. 알림: 샘플을 얼지 않아야 합니다. 이 샘플 수집 방법의 과제는 다음과 같습니다.<ol><li>초기 판독값이 최적이 아니거나 부상 후 변동될 수 있습니다. 이것은 EM 분석을 위해 체포하기 위해 선택된 부상의 정도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 프로브를 배치하는 다양한 위치를 시도한 후 몇 분 동안 기준선 판독값을 기록하여 최적의 위치를 결정해야 합니다.</li>
		<li>분석을 위해 외부 고정액을 추가하고 동맥 부분을 실제로 절단하여 부상을 체포하는 시간은 혈전증의 정도에 변동성을 추가할 수 있습니다. 외부에서 고정한 후 시료를 채취하는 동안 신속히 처리하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>습빙판에서 1% PFA로 EM 분석을 위한 처리를 위한 샘플을 받습니다. 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 헹구어 추가 처리를 시작합니다.</li>
	<li>샘플을 0.1 M 카코딜레이트 완충액 + 2.5% 글루타르알데히드 + 2 mMCaCl2에 얼음 상에서 1시간 동안 고정시킨다.</li>
	<li>고정액을 버리고 2mMCaCl2 를 함유하는 차가운 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액으로 샘플을 세척합니다(5 x 3분)(그림 6A).</li>
	<li>샘플을 얼음 상에서 1시간 동안 오스뮴 용액(3% 칼륨 페로시안화물[K4C6N6Fe] + 0.3 M 카코딜레이트 완충액 + 4 mMCaCl2와 동량의 4% 사산화오스뮴 수용액[OsO4; inddH2O])과 혼합하여 고정한다.</li>
	<li>샘플이 고정되는 동안 ddH2O에 신선한 1% 트리클로로아세트알데히드 수화물(TCH) 용액을 만들고 부드럽게 혼합하면서 60°C에서 1시간 동안 용액을 배양합니다.</li>
	<li>고정시킨 후, 샘플을 RT에서ddH2O로 5 x 3분 동안 세척한다.</li>
	<li>RT에서 20분 동안 여과된 1% TCH 용액(ddH2O로 제조됨)에서 샘플을 인큐베이션합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서ddH2O로 세척한다 (5 x 3 분).</li>
	<li>샘플을 RT에서 30분 동안ddH2O중의 2% 사산화오스뮴에 고정시킨다.</li>
	<li>샘플을 RT에서ddH2O로 각각 5 x 3분 동안 세척한다.</li>
	<li>샘플을 1% 우라닐 아세테이트(수용성)에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서ddH2O로 각각 5 x 3분 동안 세척하고, 이들을 월 튼의 납 아스파르테이트 염색으로 처리하였다.</li>
	<li>En bloc Walton의 납 아스파르테이트 염색3:<ol><li>ddH2O에 30mM L-아스파라긴산 용액을 만듭니다. 참고: 아스파라긴산은 pH가 3.8로 올라가면 더 빨리 용해됩니다. 이 원액은 냉장 보관하면 1-2개월 동안 안정적입니다.</li>
		<li>아스파라긴산 스톡 10mL에 20mM 질산납 용액을 만들고 1N KOH로 pH를 5.5로 조정합니다.</li>
		<li>샘플을 60°C에서 30분 동안 아스파르테이트납 용액에 넣고, RT에서ddH2O로 각각 3분 동안 5회 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>등급이 매겨진 에탄올 시리즈로 표본을 탈수합니다. 발디비아 프로토콜18에 의한 화학적 탈수를 사용하십시오.<ol><li>샘플을 점진적으로 탈수하기 위해 다음 각 용액에서 샘플을 세척합니다(그림 6B). 3 분 동안 25 % 에틸 알코올 3 분 동안 50 % 에틸 알코올 3 분 동안 75 % 에틸 알코올 3분 동안 95% 에틸 알코올 100% 에틸 알코올을 10분 동안 반응시키고, 상기 단계를 2회 반복한다(총 3회 세척).</li>
	</ol></li>
	<li>샘플을 100% 프로필렌 옥사이드(PO)로 10분 동안 세척하고, 단계를 2회 반복한다(총 3회 세척).</li>
	<li>RT에서 하룻밤 동안 DMP 30 활성제를 사용하여 50%/50% PO/수지에서 배양하고 100% Araldite 502/embed 812/DDSA를 DMP30 활성제와 함께 48시간 동안 포함합니다.</li>
</ol>

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<li>Refaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+light-responsive+liposomes+for+protein+delivery%3A+Towards+bleeding-free+photothermally-assisted+thrombolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis.</a> Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+nanoplatelets+to+target+delivery+hirudin+for+site-specific+photothermal%2Fphotodynamic+thrombolysis+and+preventing+venous+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation.</a> Small. 18 (51), 2203184(2022).</li>
<li>Subramaniam, S., Kanse, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).</li>
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<li>Shim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+model+of+mice+and+the+role+of+red+blood+cells+in+thrombosis+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration.</a> Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+prothrombotic+potential+of+four-factor+prothrombin+complex+concentrate+%284F-PCC%29+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models.</a> PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).</li>
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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+model+of+cerebral+microembolic+signals+for+translational+research%3A+preclinical+validation+for+aspirin+and+clopidogrel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).</li>
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<li>Bird, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+therapeutic+index+of+marketed+anti-coagulants+and+anti-platelet+agents+by+guinea+pig+models+of+thrombosis+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis.</a> Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).</li>
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저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.
ORCID 프로필 : SJ : 0000-0001-6925-2116; SWW: 00000-0001-5577-0473.

혈전증을 유도하기 위해 맥관 구조에 FeCl3 를 국소 적용하는 것은 널리 사용되는 기술이며 다양한 혈소판 수용체, 리간드 신호 전달 경로 및 그 억제제20,21,22,23에 대한 역할을 확립하는 데 도움이되었습니다. FeCl3 가 혈전증을 일으키는 메커니즘은 다각적입니다. 이전에는 내피 탈락이 혈전증의 원인으로 간주되었지만 최근 몇 년 동안 여러 보고서에서 이 과정에서 적혈구와 혈장 단백질의 역할을 제안했습니다24,25,26,27.</...

혈전증은 혈관을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 혈액의 자연스러운 흐름을 방해하는 혈전의 형성입니다. 이것은 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중과 같은 심각하고 치명적인 심혈관 사건으로 이어집니다. 심혈관 질환은 이환율과 사망률의 주요 원인이며 전 세계적으로 4명 중 1명이 사망합니다 1,2,3. 혈전증은 혈관계 기능 장애로 나타나지만 기저 미생물 또는 바이러스 감염, 면역 장애, 악성 종양 또는 대사 상태의 결과일 수 있습니다. 혈액의 흐름은 혈관 내피 세포, 적혈구/백혈구, 혈소판, 응고인자 등 혈관계의 다양한 구성 요소들 간의 복잡한 상호작용에 의해 유지된다4. 혈관 손상 시, 혈소판은 내피하 기질의 접착 단백질과 상호작용하여 과립 내용물을 방출하여 더 많은 혈소판을 모집한다5. 동시에 응고 캐스케이드가 활성화되어 피브린 형성 및 침착을 유발합니다. 궁극적으로, 혈소판과 적혈구가 피브린 메쉬(fibrin mesh) 내에 갇혀있는 혈전이 형성된다 6. 혈전증을 조절하기 위해 항혈소판제 및 항응고제를 사용할 수 있지만 가짜 출혈은 이러한 요법의 주요 관심사로 남아 있으며 이러한 약물의 복용량과 조합을 미세 조정해야 합니다. 따라서, 새로운 항혈전제를 발견하는 것이 여전히 시급하다7.
혈전증은 기계적 손상(혈관 결찰), 열적 손상(레이저 손상) 및 화학적 손상(FeCl3/로즈 벵골 적용)과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 연구됩니다. 혈전증의 성격은 부상의 위치(동맥 대 정맥), 방법 또는 정도에 따라 다릅니다. 이러한 모든 유형 중에서 FeCl3 유발 혈관 손상이 가장 널리 사용되는 방법입니다. 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그 및 개 8,9,10,11,12에 사용되었습니다. 이 방법은 비교적 간단하고 사용하기 쉬우며 주요 매개변수가 표준화되면 다양한 혈관계(예: 동맥[경동맥 및 대퇴골], 정맥[경정맥] 및 세동맥[크레마스터 및 장간막])에서 민감하고 재현 가능합니다(보충 표 1).
이 모델은 또한 혈전 형성의 역학과 형태에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 유속 지점에서 혈전증을 멈추고 폐색되기 전에 공정의 중간 단계를 연구할 수 있는 이점을 제공합니다. 혈전증 연구의 최근 발전은 이 모델을 사용하여 혈전용해의 비약리학적 방법13 또는 항혈전 및/또는 섬유소 용해제의 비침습적 전달에 주의를 집중시켰다14,15. 몇몇 연구진은 혈소판막이 이러한 치료제로 코팅될 때, 혈전을 표적으로 하는 열 자극에 의해 약물이 활성화될 수 있음을 보여주었다16. 여기에 설명된 기술은 단일 혈소판 수준에서 결과를 검증하는 것과 같은 연구에 유용할 수 있습니다. 이 원고에서 프로토콜 1은 기본적인 FeCl3 매개 혈관 손상 절차를 설명하는 반면, 프로토콜 2는 전자 현미경에 의한 추가 분석을 위해 혈관 손상 샘플을 수집하고 고정하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 식염수&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td>NaCl은 0.9% 식염수 용액을 만드는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>1 mL 주사기&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>309659 190 프루프 에탄올&nbsp;</td><td>콥텍</td><td>V1101&nbsp;</td><td>수술을 위해 마우스를 준비하는 데 사용할 70% 에탄올 용액을 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48402</td><td></td></tr><tr><td>25 야드 블랙 브레이디드 실크 봉합사 (5-0)</td><td>DEKNATEL</td><td>136082-1204</td><td></td></tr><tr><td>26G x 3/8 바늘&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸-2-부탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>7.5 mL 전사 피펫, 3 mL</td><td>Globe Scientific Inc.</td>로 졸업<td>135010</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드 (70% 이소프로필 알코올)</td><td>Medline</td><td>MDS090735</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 35mm x 10mm&nbsp;</td><td>코닝 주식회사&nbsp;</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>컴팩트 스케일&nbsp;</td><td>워드의 과학&nbsp;</td><td>470314-390</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 12.5 cm 길이의</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15922-G</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 활성화제&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Dodenyl 숙신산 무수물/DDSA</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>강아지 똥 가방/동물 사체 처리 가방</td><td>Crown Products&nbsp;</td><td>PP-RB-200</td><td></td></tr><tr><td>도플러 플로우프로브</td><td>천음속 시스템 Inc.</td><td>MA0.5PSB</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 레진&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 무수 200 proof&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>아이 드레싱 펜치, 4" 풀 커브드, 표준, 0.8mm 넓은 팁</td><td>Integra Miltex</td><td>18-784</td><td></td></tr><tr><td>필터 페이퍼&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28310-106</td><td></td></tr><tr><td>세밀한 가위 - 날카롭고 둔탁한</td><td>세밀한 과학 도구&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>핑거 루프 귀 펀치&nbsp;</td><td>고급 과학 도구&nbsp;</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지 2" x 2" &ndash; 12 Ply&nbsp;</td><td>Dukal Corporation</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드(10% 용액)</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Integra Miltex 탄소강 수술용 칼날 #10</td><td>Integra&reg; 밀텍스&reg;</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>철(III) 염화물&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>나이프 핸들 Miltex&reg; 초미세 스테인리스 스틸 사이즈 3</td><td>Integra Lifesciences&nbsp;</td><td>157510</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>시그마&nbsp; 어부</td><td>&nbsp; A93100</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>질산납&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 현미경</td><td>LEICA</td><td>더 이상 사용할 수 없음</td><td>회사에서 더 이상 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 현미경 스탠드&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>10447255</td><td>더 이상 회사에서 사용할 수 없습니다.</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 펜치; 1x2 이빨, 전체 곡선; 0.8 mm 팁 너비; 4" 길이</td><td>Roboz 수술 기구 회사</td><td>RS-5157</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 수용액&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16% 용액)</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>포타슘 페리시아나이드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드, ACS 시약&nbsp;</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic 피펫 PR-10</td><td>Rainin</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>연구용 유량계&nbsp;</td><td>천음속 시스템 Inc.</td><td>T402B01481</td><td>모델: T402</td></tr><tr><td>스카치 매직 인비저블 테이프, 3/4" x 1000", 클리어</td><td>스카치&nbsp;</td><td></td><td></td>305289</tr><tr><td>작은 동물 가열 패드</td><td>K & H 제조 Inc.</td><td>모델: HM10</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 카코딜레이트 버퍼 0.2M, pH7.4</td><td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>멸균 면 팁 애플리케이터&nbsp;</td><td>청교도 의료 제품&nbsp;</td><td>25-806 1WC</td><td></td></tr><tr><td>스테로마스터 조명기&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td>더 이상 회사에서 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>Surgical Dumont #7 Forceps&nbsp;</td><td>고급 과학 도구&nbsp;</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Universal Low Retention Pipet Tip Reloading (0.1-10 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>76323-394</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>전자 현미경 서비스&nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Veet 젤 크림 헤어 리무버</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>3116875</td><td></td></tr><tr><td>화이트 안티스태틱 육각형 무게 보트, 중간, 64 x 15 x 19 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S38975</td><td></td></tr><tr>Windows <td>DATAQ Instruments, Inc.</td><td>용 WinDAQ/100 소프트웨어</td><td>버전 3.38</td><td>무료로 다운로드할 수 있습니다. https://www.dataq.com/products/windaq/</td></tr> <tr><td>자이스 액시오캠 Icc 1</td><td>자이스</td><td>57615</td><td></td></tr></tbody></table>

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3d 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 비정상적인 혈전증은 당뇨병 및 비만과 같은 전신 질환과 죽상동맥경화증, 암 및 자가면역 질환과 같은 만성 염증성 질환의 일반적인 특징입니다. 혈관 손상 시 일반적으로 응고계, 혈소판 및 내피가 조율된 방식으로 작용하여 손상 부위에 혈전을 형성하여 출혈을 예방합니다. 이 과정의 이상은 과도한 출혈 또는 조절되지 않는 혈전증/불충분한 항혈전 활성으로 이어져 혈관 폐색 및 후유증으로 이어집니다. FeCl3 유도 경동맥 손상 모델은 생체 내에서 혈전증이 어떻게 시작되고 진행되는지 조사하는 데 유용한 도구입니다. 이 모델은 손상 부위의 내피 손상/탈락 및 후속 혈전 형성을 포함합니다. 다양한 정도의 혈관 손상에 대한 반응으로 혈관 손상 및 혈전 형성을 모니터링하기 위해 매우 민감한 정량적 분석을 제공합니다. 일단 최적화되면, 이 표준 기술은 혈전증의 기저에 있는 분자 메커니즘과 성장하는 혈전에서 혈소판의 미세구조적 변화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분석은 또한 항혈전제 및 항혈소판제의 효능을 연구하는 데 유용합니다. 이 기사에서는 FeCl3 유도 동맥 혈전증을 시작하고 모니터링하는 방법과 전자 현미경으로 분석할 샘플을 수집하는 방법을 설명합니다.

데이터는 일반적으로 폐색까지의 시간 또는 완전 폐색 혈전을 형성하는 데 필요한 시간으로 표시됩니다. 이러한 데이터는 Kaplan-Meier 생존 곡선(그림 4A)19, 혈류 중단 또는 실험 종료 시점의 최종 혈류를 보여주는 막대가 있는 도트 플롯(그림 4B) 또는 선 그래프(그림 4C)로 표시할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 혈전 안정성을 연구 할 수 있습니다. 대부분의 경우 FeCl3 손상 시 혈전이 점진적으로 형성되고 성장함에 따라 혈류가 점진적으로 감소하여 혈관이 완전히 폐색되면 0에 도달합니다. 어떤 경우에는 몇 분 동안 점진적으로 감소한 후 혈류가 갑자기 증가합니다. 이것은 성장하는 혈전의 부분적인 탈락으로 해석되며 색전술 사건으로 간주될 수 있습니다(그림 4...

본 프로토콜은 동맥 혈전증을 유도하기 위해 FeCl3 매개 손상을 사용하는 방법, 및 전자 현미경 분석을 위해 혈전증의 다양한 단계에서 동맥 손상 샘플을 수집하고 준비하는 방법을 설명합니다.

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Aberrant thrombosis is a common feature of systemic conditions like ...

이 방법을 사용하면 혈소판과 지혈 시스템의 어떤 성분이 혈전증에 중요한지 결정할 수 있습니다. 또한 이 방법은 혈전 성장과 구조가 세포 수준에서 어떻게 영향을 받는지 결정할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 구조적 수준에서 혈전증의 여러 단계를 재현 가능한 방법으로 연구 할 수 있다는 것입니다.이 기술을 처음 접하는 사람은 수술 부위의 조직을 과도하게 취급하지 않아야 합니다. 이것은 출혈로 이어질 수 있으며 경동맥의 식별을 지나치게 복잡하게 만들 수 있습니다. 경동맥을 노출시킨 후 0.1mm 크기의 두 수술실 사이의 영역을 느슨하게 둘러싸서 손상 부위를 표시하기 시작합니다.프로브를 아래쪽 나사산에서 말단 동맥 아래에 놓습니다. 두 나사산 사이의 동맥 아래에 플라스틱 조각을 삽입하여 염화철 손상 부위를 표시합니다. 부상을 입기 전에 유량을 측정하여 기초 유량을 기록하십시오.염화철에 적신 여과지를 동맥에 3 분 동안 올려 놓아 부상을 입으십시오. 3분 후에 여과지를 제거하여 다양한 정도의 부상을 방지하고 프로브에 의한 유량 계산을 용이하게 합니다. 부상 부위에 식염수를 추가하여 과도한 잔류 염화철을 제거합니다.흐름 판독값을 모니터링합니다. 유량이 초기 값의 50% 미만으로 떨어지면 프로브를 제거합니다. 해당 부위를 빠르게 건조시키고 고정제를 첨가하여 부상 부위를 외부에 고정합니다.다음으로, 집게로 부상 부위 근처의 동맥을 즉시 잡으십시오. 하부 실의 하류와 상부 실의 상류를 자릅니다. 플라스틱 조직 배양 접시에 조직을 수집 된 방향과 동일한 방향으로 놓고 고정액 몇 방울을 첨가하십시오.메스를 사용하여 동맥 주변의 여분의 조직을 청소하십시오. 한쪽 끝을 수평으로 자르고 다른 쪽 끝을 가늘어지거나 비스듬히 절단하여 혈류의 방향을 기록하십시오. 샘플을 실온에서 1시간 동안 고정액에 넣은 다음 전자 현미경 분석을 위해 젖은 얼음으로 보낼 때까지 섭씨 4도에서 1% 파라포름알데히드에 샘플을 저장합니다.데이터는 Kaplan-Meier 생존 곡선, 혈류 중단 또는 실험 종료 시 말단 혈류를 보여주는 막대가 있는 도트 플롯 또는 선 그래프로 표시되었습니다. 혈류는 성장하는 혈전의 부분적인 흘림을 나타내는 몇 분 동안 점진적으로 감소한 후 어떤 경우에는 갑자기 증가했으며 색전술 사건으로 간주되었습니다. 폐색 혈전 형태도 이 방법을 사용하여 연구되었습니다.혈전증 과정에서 샘플을 신속하게 수집하는 것은 이 과정이 지연되면 구조 분석이 잘못 해석될 수 있기 때문에 가장 중요한 단계입니다.

ferric-chloride-induced-arterial-thrombosis-sample-collection-for-3d

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

마우스의 FeCl3 유도 혈전증 모델이 여기에 설명되어 있습니다. 장간막 혈관에 대한 생체 내 현미경 관찰과 경동맥의 혈류 측정을 통해 혈전 성장을 모니터링하는 방법이 제시됩니다.

철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델

우리의 목표는 설계, 제조 및 내피 세포 캡처를위한 강자성 스텐트를 테스트했다. 열 스텐트 파괴에 대해 시험하고, 10 이상이 유지 자성 스텐트에 대해 시험 하였다. 마지막으로, 10 스텐트는 시험관 시험하고 8 개의 스텐트는 세포 캡처 및 보존을 보여 4 돼지에 이식했다.

내피 세포 캡처 및 유지에 대한 강자성 베어 메탈 스텐트

이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.

직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

여기, 우리는 큰 동물 혈관 손상 모델에서 잘 특징이 고 일반적으로 사용 되 작은 동물 제 2 철 염화 유도 (FeCl3) 경 동맥 상해 모델에 사용 하기 위해 필요한 수정 제시. 결과 모델은 예방 및 thrombolytic 약리 및 기계적 개입의 전 임상 시험 평가 위해 활용할 수 있습니다.

제 2 철 염화 유도 개 경 동맥 혈전 증: 혈관 손상의 큰 동물 모델

여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

본 연구는 혈전 용해, 세포 염색 및 정기 혈액 검사를 통한 뇌혈전의 세포 성분 분석을 위한 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

뇌혈전의 세포 성분을 분석하기 위한 포괄적인 접근법

지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

본 연구는 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 평가를 위해 실크 봉합법과 레이저 반점 조영 영상 및 고해상도 초음파를 결합하여 상시상동 혈전증을 재현 가능하고 최소 침습 모델로 확립하는 프로토콜을 제시합니다.

수정된 염화철 유도 상시상동 혈전증 형성

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

배우세요 염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집 방법을. 혈전 성장과 구조의 세포 수준 변화를 재현 가능하게 연구하여 심혈관 질환 치료 개발에 기여합니다.

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

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