Name: 기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 기능성 내배엽 간 오가노이드(eHEPOs) 생성 프로토콜을 활용한 2주 단기 배양 및 1년 이상 장기 확장 기법. 이 방법은 분화능과 기능성을 유지하며 간 질환 연구 및 재생의학 발전에 기여합니다.

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<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>코 닝</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td>N&uuml; ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, 5% CO2 인큐베이터</td><td>멤머트</td><td>인코 153</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>코 닝</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 & 마이크로; m 및 40 & micro; m 셀 스트레이너</td><td>송골매</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>시그마</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>아브캠</td><td>AB166610</td><td>희석: 1/500(IF), 1/50(IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (TGF-&베타; 억제제)</td><td>토크리스 바이오시엔</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>아이소랩</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>히스토본드</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM-F12</td><td>깁코</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP 통신</td><td>아브캠</td><td>AB3980</td><td>희석: 1/25(IHC)</td></tr><tr><td>한천</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>알비</td><td>아브캠</td><td>AB10241</td><td>희석: 1/100(IF), 1/20(IHC)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (마우스)</td><td>인비트로젠</td><td>A11001</td><td>희석: 1/1000(IF)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (토끼)</td><td>인비트로젠</td><td>A110034</td><td>희석: 1/1000(IF)</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (마우스)</td><td>인비트로젠</td><td>A11005</td><td>희석: 1/1000(IF)</td></tr><tr><td>알렉사 밀가루 594(토끼)&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>A11037</td><td>희석: 1/1000(IF)</td></tr><tr><td>암모니아 분석 키트</td><td>시그마-알드리치</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 클로라이드</td><td>산타크루즈</td><td>SC-202936</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 50x</td><td>깁코</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>베이스 금형</td><td>사쿠라</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>비-FGF</td><td>페프로텍</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전, 클래스 II, 안전 캐비닛</td><td>열</td><td>안전한 2020</td><td></td></tr><tr><td>보정된 피펫</td><td>길슨</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>에펜도르프</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>콜릴글리실아미도-플루오레세인</td><td>코 닝</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>구연산염 완충액 pH 6.0</td><td>바이오옵티카</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18 시리즈</td><td>산타크루즈</td><td>SC-51582</td><td>희석: 1/100(IF), 1/20(IHC)</td></tr><tr><td>CK-19 시리즈</td><td>산타크루즈</td><td>SC-6278 시리즈</td><td>희석: 1/100(IF), 1/20(IHC)</td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>자이스</td><td>LSM880 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>극저온 취급 장갑 및 눈 보호 장치</td><td>크로오킷</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>극저온 조절기</td><td>라이카</td><td>CM 1950년</td><td></td></tr><tr><td>극저온 튜브</td><td>코 닝</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>소량</td><td>로슈</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>댑트</td><td>시그마-알드리치</td><td>ᅡ5942</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마-알드리치</td><td>디4902</td><td></td></tr><tr><td>분산&nbsp;</td><td>줄기세포 기술</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>깁코</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>산타크루즈</td><td>SC-8426 시리즈</td><td>희석: 1/100(IF), 1/20(IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>인비트로젠</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경</td><td>자이스</td><td>시그마500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 키트</td><td>Fortis 생명 과학 베틸</td><td>88-129 회</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 임베딩 키트</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>엔텔란</td><td>머 크</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>에오신 Y %1</td><td>시그마-알드리치</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>밀테니 바이오텍</td><td>130-059-901</td><td>희석: 1/11(FACS)</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>머 크</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>깁코</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>포스콜린(FSK)</td><td>토크리스 바이오시엔</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기(Mr. Frosty)</td><td>열</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>냉동 매체</td><td>깁코</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>아이소랩</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 100x</td><td>깁코</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>글루트알데히드 %25, EM 등급</td><td>EMS</td><td>16210-1엘</td><td></td></tr><tr><td>염소 항마우스 HRP</td><td>써모 피셔</td><td>62-6520</td><td>희석: 1/1000(IHC)</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 HRP</td><td>써모 피셔</td><td>31460</td><td>희석: 1/1000(IHC)</td></tr><tr><td>염소 세럼</td><td>깁코</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>머 크</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>헤마톡실린</td><td>밀리포어</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>깁코</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&알파;</td><td>아브캠</td><td>AB55223</td><td>희석: 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>얼음과 드라이아이스</td><td>만든</td><td>만든</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터(65 &deg; C)</td><td>N&uuml; ve</td><td>EN 400 인증</td><td></td></tr><tr><td>이소프로파놀</td><td>시그마-알드리치</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 가스트린 I 인간</td><td>시그마-알드리치</td><td>지9145</td><td></td></tr><tr><td>발광계</td><td>베르톨트 테크</td><td>파운드 960</td><td></td></tr><tr><td>마스터 믹스&nbsp;</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스, hESC 인증</td><td>코 닝</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스, 페놀 레드 프리</td><td>코 닝</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>머 크</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>미세 원심분리기 튜브</td><td>액시젠</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>자이스</td><td>액시오 버트 A1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>깃털</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>엠테SR1</td><td>줄기세포 기술</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>멀티 웰 현탁액 배양 플레이트</td><td>사르슈테트</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 100x</td><td>깁코</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린 %10</td><td>철킴</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>깁코</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>10월</td><td>티슈텍</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>사산화오스뮴</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo 분석 키트&nbsp;</td><td>프로메가</td><td>V9001</td><td></td></tr><tr><td>팍펜</td><td>시그마</td><td>Z377821-1개</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>철킴</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>PAS 염색 키트</td><td>아브캠</td><td>AB150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>론자</td><td>베17-516</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>깁코</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>포스포퉁구스산</td><td>테드 펠라</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>피펫 보조 장치</td><td>액시젠</td><td>모토펫-1</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더 varioskan flash&nbsp;</td><td>열</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>퇴색 방지 마운팅제 연장</td><td>인비트로젠</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드, EM 등급</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 시스템</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>7500 빠름&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 액티빈 A</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP7</td><td>페프로텍</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>페프로텍</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF10</td><td>페프로텍</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF19</td><td>페프로텍</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 HGF</td><td>페프로텍</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rho 키나아제 억제제, Y-27632 이염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase 프리 1.5mL 튜브</td><td>액시젠</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase 프리 필터 팁</td><td>사르슈테트</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>회전식 마이크로톰</td><td>라이카</td><td>2245 링깃</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 중간</td><td>깁코</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Rspo1 컨디셔닝 배지</td><td>만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 마스터</td><td>바이오옵티카</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>소렌슨' s 인산염 완충액</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>회전자</td><td>열</td><td>마이 스핀 6</td><td></td></tr><tr><td>멸균 혈청학적 피펫</td><td>송골매</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>티슈 카세트</td><td>라이카</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>트리머</td><td>라이카</td><td>EM 트림2</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>써모 사이언티픽</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 효소</td><td>깁코</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>깁코</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>울트라마이크로톰</td><td>라이카</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>우라닐아세테이트</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>소용돌이</td><td>열</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Wnt 대리-Fc 융합 단백질</td><td>면역정밀</td><td>엔001</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>시그마&nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>인비트로젠</td><td>40-2200</td><td>희석: 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

먼저, 인간 섬유아세포 또는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 세포를 배양하고 에피솜 재프로그래밍 을 통해 iPSC로 전환했습니다. 신선한 녹아웃 세럼은 건강한 iPSC를 얻는 데 필수적이었습니다. 그런 다음 iPSC를 50%-60% 포화도로 BMM 코팅된 배양 플레이트에 파종했습니다. 중소형 iPSC 콜로니가 있으면 분화 효율이 향상되었습니다. 그런 다음, iPSC를 5일 동안 Activin A, Wnt3a 및 R-spo1 인자를 함유하는 배지를 가진 최종 내배엽으로 분화시켰습니다. 분화 과정에서 세포의 수와 크기가 크게 증가했습니다. 따라서 매체를 새로 고치는 데 주의를 기울여야 합니다. 내배엽 분화가 끝나면 EPCAM+ 세포를 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법으로 농축하고, 분류된 세포를 BMM에 내장하고 팽창 배지(EM)에서 10-14일 동안 성장시켰습니다. 오가노이드 형성 능력은 신선한 배지 성분과 순수한 세포 집단에 따라 다릅니다. 따라서 성공적인 세포 분류는 중요한 단계입니다. eHEPO의 크기가 1...

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

우리의 연구는 전임상 연구에서 건강한 간 조직과 병든 간 조직을 밀접하게 모방하여 약물 효능 및 안전성 테스트를 위한 인간 관련 체외 간 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 전체 간 복잡성을 재현하고, 장기적인 기능을 달성하고, 프로토콜을 표준화하고, 처리량이 많은 응용 분야를 위한 오가노이드 생산 확장은 오가노이드 연구에서 여전히 주요 실험적 과제로 남아 있습니다. 우리는 최근 건강한 간 오가노이드에서 간 섬유증을 모델링하고 환자 유래 세포에서 시트룰린혈증 및 피루브산 카르복실라아제 결핍을 포함한 간 희귀 질환 모델을 확립했습니다. 다른 방법과 달리 당사의 eHEPO 프로토콜은 기능성 간 오가노이드를 빠르고 대규모로 제공하여 하나의 일관된 시작 모집단에서 장기적인 기능과 여러 분석을 지원합니다.[해설자] 시작하려면 6밀리리터의 차가운 DMEM/F-12를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 추가합니다. 즉시 80마이크로리터의 FOD 기저막 매트릭스 또는 BMM을 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 조직 배양 처리된 웰 플레이트에 BMM 용액을 코팅하고 용액을 분배하여 웰 플레이트 표면을 덮습니다. 플레이트를 섭씨 37° 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 유도성 만능줄기세포 또는 IPSC 플레이트를 가져와 IPSC 특이적 배지를 흡인합니다. DMEM/F-12 또는 DPBS로 플레이트를 헹구고 6웰 플레이트의 웰 1에 특정 효소 1밀리리터를 추가합니다. 1분 동안 배양한 후, 효소를 흡인하고 플레이트를 섭씨 37°에서 5-7분 동안 배양합니다. 다음으로, 예열된 IPSC 배지 1밀리리터를 플레이트에 추가하고 측면을 부드럽게 두드려 플레이트 표면에서 미분화 콜로니 응집체를 분리합니다. 현탁액을 5밀리리터 혈청학적 피펫과 부드럽게 혼합한 다음 원하는 밀도로 세포 현탁액을 BMM 코팅 웰에 시드합니다. 세포를 섭씨 37°에서 3-5일 동안 배양하여 70%의 컨플루언스에 도달합니다. 분화를 시작하기 전에 IPSC 배지를 내배엽 배지로 교체하십시오. 세포는 분화 후 뾰족한 모양을 얻어 세포-세포 상호 작용을 나타냅니다. PBS로 내배엽 세포를 헹굽니다. 300마이크로리터의 트립신을 첨가합니다. 그리고 인큐베이터에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 3밀리리터의 차가운 DMEM/F-12를 세포에 넣고 1,000마이크로리터 필터 팁으로 피펫팅하여 단일 세포를 생성합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 실온에서 5분 동안 300 x g으로 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 10밀리리터의 FACS 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 단일 세포 현탁액을 만들려면 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하기 전에 100마이크로미터 메쉬 스트레이너로 세포를 여과한 다음 40마이크로미터 메쉬 스트레이너로 여과합니다. 1,500만 개의 세포를 105마이크로리터의 FACS 완충액으로 재현탁하고 45마이크로리터의 FcR과 15마이크로리터의 EpCAM을 현탁액에 첨가합니다. 세포를 섭씨 4°에서 10분 동안 배양하여 튜브를 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 FACS 완충액을 첨가하여 세포 현탁액을 세척합니다. 세포를 원심분리한 후, 펠릿을 500마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁하고 밀리리터당 0.5마이크로몰 DAPI를 세포 현탁액에 첨가하여 죽은 세포를 정량화합니다. 세포 분류 후, 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다. 그리고 20마이크로리터의 BMM에 3,000-5,000개의 세포를 재현탁합니다. 각 48웰 플레이트의 중앙에 BMM 방울을 추가하여 세포를 시드하고 BMM이 응고될 때까지 섭씨 37°에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 물방울을 팽창 매체로 오버레이합니다. 오가노이드 방울을 분할하려면 오가노이드 배지를 버리고 500마이크로리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 웰에 첨가합니다. 1,000마이크로리터 필터 팁을 사용하여 BMM 방울을 세게 피펫팅합니다. 최대 10개의 BMM 방울을 15밀리리터 원추형 튜브에 수집하고 5밀리리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 3-5분 동안 놓습니다. 세포를 섭씨 4°에서 5분 동안 200 x g으로 원심분리하고 상청액 1밀리리터가 남을 때까지 상청액을 버립니다. 200마이크로리터 필터 팁을 사용하여 세포 펠릿을 30-40회 세게 피펫팅합니다. 기계적 해리 후, 세포를 5분 동안 원심분리하기 전에 5밀리리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 첨가합니다. 상청액을 버리십시오. 그리고 서스펜션을 얼음 위에 놓습니다. 50마이크로리터 BMM 방울을 시드합니다. 그리고 확장 매체에 밀리리터당 25나노그램의 BMP7을 첨가한다. 3일 동안 배양한 후 배지를 분화 배지로 교체하고 최소 14일 동안 세포를 배양합니다. EpCAM+ 세포에서 유래한 오가노이드가 간 계통에 전념하는지 여부를 검증하기 위해 면역염색 분석을 수행했습니다. CK19+ 및 HNF4ɑ+ 세포의 존재는 간모세포 및 담관 전구 세포가 오가노이드에 존재함을 나타냅니다. 또한, E-CAD+ 세포 및 ZO-1을 발현하는 입방체 또는 다면체 상피 세포와 같은 상피 조직 마커를 발현하는 오가노이드는 세포 사이에 밀착 접합이 존재함을 나타냅니다. 면역조직화학은 E-CAD+ 세포가 간세포와 유사한 표현형을 반영하는 다각형 상피 구조를 나타낸 것으로 나타났습니다. eHEPO의 투과 전자 현미경 이미지가 여기에 나와 있습니다. 흰색 원은 세포간 접합 복합체를 나타냅니다. 검은색 화살표는 정점 표면 분화를 나타냅니다. 그리고 빨간색 화살표는 미세융모의 가로 단면을 보여줍니다. qPCR 분석은 오가노이드가 ALB, A1AT, CYP3A4 및 CYP3A7과 같은 성숙한 간세포 마커를 얻는 것으로 나타났습니다. PAS 염색에서 분홍색 염색 영역은 오가노이드의 글리코겐 저장 용량을 나타냅니다. 또한, 우리의 분석은 ALB를 배양 배지로 분비하고, 배양 배지에서 암모니아를 제거하는 오가노이드의 능력, CYP3A4 효소 활성 및 담즙산 수송 능력을 보여주었습니다.

generation-of-functional-endodermal-hepatic-organoids

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

여기에서는 인간 만능 줄기 세포 유래 소장 및 결장 오가노이드를 생성, 유지 및 특성화하는 자세한 방법에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 재현성을 개선하고, 확장성을 확장하며, 오가노이드의 도금 및 패시징에 필요한 작업 시간을 단축하도록 설계되었습니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 장 및 결장 오가노이드의 생성, 유지 및 특성화

여기에서 우리는 정상 상태 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 사용하여 인간 자가 간 스페로이드를 생성하는 비유전적 방법을 제시합니다.

간 질환 연구를 위한 말초 혈액의 인간 간 스페로이드

당사는 오가노이드 배양의 모든 단계를 포괄하는 간세포 암종(HCC) 오가노이드 형성에 대한 기존 프로토콜에 대한 포괄적인 개요와 개선을 제공합니다. 이 시스템은 잠재적인 치료 표적을 식별하고 약물 후보 물질의 효과를 평가하는 데 유용한 모델 역할을 합니다.

잠재적 표적 식별 및 약물 발견을 위한 인간 간세포 암종 환자 유래 오가노이드 모델의 개발 및 최적화

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 기능성 내배엽 간 오가노이드(eHEPOs) 생성 프로토콜을 활용한 2주 단기 배양 및 1년 이상 장기 확장 기법. 이 방법은 분화능과 기능성을 유지하며 간 질환 연구 및 재생의학 발전에 기여합니다.

기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

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