기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

우리의 연구는 전임상 연구에서 건강한 간 조직과 병든 간 조직을 밀접하게 모방하여 약물 효능 및 안전성 테스트를 위한 인간 관련 체외 간 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 전체 간 복잡성을 재현하고, 장기적인 기능을 달성하고, 프로토콜을 표준화하고, 처리량이 많은 응용 분야를 위한 오가노이드 생산 확장은 오가노이드 연구에서 여전히 주요 실험적 과제로 남아 있습니다. 우리는 최근 건강한 간 오가노이드에서 간 섬유증을 모델링하고 환자 유래 세포에서 시트룰린혈증 및 피루브산 카르복실라아제 결핍을 포함한 간 희귀 질환 모델을 확립했습니다. 다른 방법과 달리 당사의 eHEPO 프로토콜은 기능성 간 오가노이드를 빠르고 대규모로 제공하여 하나의 일관된 시작 모집단에서 장기적인 기능과 여러 분석을 지원합니다.

[해설자] 시작하려면 6밀리리터의 차가운 DMEM/F-12를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 추가합니다. 즉시 80마이크로리터의 FOD 기저막 매트릭스 또는 BMM을 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 조직 배양 처리된 웰 플레이트에 BMM 용액을 코팅하고 용액을 분배하여 웰 플레이트 표면을 덮습니다. 플레이트를 섭씨 37° 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 유도성 만능줄기세포 또는 IPSC 플레이트를 가져와 IPSC 특이적 배지를 흡인합니다. DMEM/F-12 또는 DPBS로 플레이트를 헹구고 6웰 플레이트의 웰 1에 특정 효소 1밀리리터를 추가합니다. 1분 동안 배양한 후, 효소를 흡인하고 플레이트를 섭씨 37°에서 5-7분 동안 배양합니다. 다음으로, 예열된 IPSC 배지 1밀리리터를 플레이트에 추가하고 측면을 부드럽게 두드려 플레이트 표면에서 미분화 콜로니 응집체를 분리합니다. 현탁액을 5밀리리터 혈청학적 피펫과 부드럽게 혼합한 다음 원하는 밀도로 세포 현탁액을 BMM 코팅 웰에 시드합니다. 세포를 섭씨 37°에서 3-5일 동안 배양하여 70%의 컨플루언스에 도달합니다. 분화를 시작하기 전에 IPSC 배지를 내배엽 배지로 교체하십시오. 세포는 분화 후 뾰족한 모양을 얻어 세포-세포 상호 작용을 나타냅니다. PBS로 내배엽 세포를 헹굽니다. 300마이크로리터의 트립신을 첨가합니다. 그리고 인큐베이터에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 3밀리리터의 차가운 DMEM/F-12를 세포에 넣고 1,000마이크로리터 필터 팁으로 피펫팅하여 단일 세포를 생성합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 실온에서 5분 동안 300 x g으로 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버린 후 10밀리리터의 FACS 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 단일 세포 현탁액을 만들려면 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리하기 전에 100마이크로미터 메쉬 스트레이너로 세포를 여과한 다음 40마이크로미터 메쉬 스트레이너로 여과합니다. 1,500만 개의 세포를 105마이크로리터의 FACS 완충액으로 재현탁하고 45마이크로리터의 FcR과 15마이크로리터의 EpCAM을 현탁액에 첨가합니다. 세포를 섭씨 4°에서 10분 동안 배양하여 튜브를 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 FACS 완충액을 첨가하여 세포 현탁액을 세척합니다. 세포를 원심분리한 후, 펠릿을 500마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁하고 밀리리터당 0.5마이크로몰 DAPI를 세포 현탁액에 첨가하여 죽은 세포를 정량화합니다. 세포 분류 후, 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다. 그리고 20마이크로리터의 BMM에 3,000-5,000개의 세포를 재현탁합니다. 각 48웰 플레이트의 중앙에 BMM 방울을 추가하여 세포를 시드하고 BMM이 응고될 때까지 섭씨 37°에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 물방울을 팽창 매체로 오버레이합니다. 오가노이드 방울을 분할하려면 오가노이드 배지를 버리고 500마이크로리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 웰에 첨가합니다. 1,000마이크로리터 필터 팁을 사용하여 BMM 방울을 세게 피펫팅합니다. 최대 10개의 BMM 방울을 15밀리리터 원추형 튜브에 수집하고 5밀리리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 3-5분 동안 놓습니다. 세포를 섭씨 4°에서 5분 동안 200 x g으로 원심분리하고 상청액 1밀리리터가 남을 때까지 상청액을 버립니다. 200마이크로리터 필터 팁을 사용하여 세포 펠릿을 30-40회 세게 피펫팅합니다. 기계적 해리 후, 세포를 5분 동안 원심분리하기 전에 5밀리리터의 차가운 Ad-DMEM/F-12를 첨가합니다. 상청액을 버리십시오. 그리고 서스펜션을 얼음 위에 놓습니다. 50마이크로리터 BMM 방울을 시드합니다. 그리고 확장 매체에 밀리리터당 25나노그램의 BMP7을 첨가한다. 3일 동안 배양한 후 배지를 분화 배지로 교체하고 최소 14일 동안 세포를 배양합니다. EpCAM+ 세포에서 유래한 오가노이드가 간 계통에 전념하는지 여부를 검증하기 위해 면역염색 분석을 수행했습니다. CK19+ 및 HNF4ɑ+ 세포의 존재는 간모세포 및 담관 전구 세포가 오가노이드에 존재함을 나타냅니다. 또한, E-CAD+ 세포 및 ZO-1을 발현하는 입방체 또는 다면체 상피 세포와 같은 상피 조직 마커를 발현하는 오가노이드는 세포 사이에 밀착 접합이 존재함을 나타냅니다. 면역조직화학은 E-CAD+ 세포가 간세포와 유사한 표현형을 반영하는 다각형 상피 구조를 나타낸 것으로 나타났습니다. eHEPO의 투과 전자 현미경 이미지가 여기에 나와 있습니다. 흰색 원은 세포간 접합 복합체를 나타냅니다. 검은색 화살표는 정점 표면 분화를 나타냅니다. 그리고 빨간색 화살표는 미세융모의 가로 단면을 보여줍니다. qPCR 분석은 오가노이드가 ALB, A1AT, CYP3A4 및 CYP3A7과 같은 성숙한 간세포 마커를 얻는 것으로 나타났습니다. PAS 염색에서 분홍색 염색 영역은 오가노이드의 글리코겐 저장 용량을 나타냅니다. 또한, 우리의 분석은 ALB를 배양 배지로 분비하고, 배양 배지에서 암모니아를 제거하는 오가노이드의 능력, CYP3A4 효소 활성 및 담즙산 수송 능력을 보여주었습니다.