결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성
2023년 3월 24일
이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.
이 프로토콜은 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용하여 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스를 생성합니다. 여기에는 갈색 지방에 AAV를 안전하게 투여하는 수술 기술이 포함됩니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스를 선택적으로 번식시킬 필요 없이 조직 특이적 녹아웃을 빠르게 생성할 수 있다는 것입니다.
조직 특이적 녹아웃 또는 녹다운을 만드는 접근 방식은 AAV 주입을 위한 수술 절차가 표적 기관에 따라 수정되는 경우 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 먼저, 수술 후 통증과 고통을 최소화하고 예방하기 위해 마취된 UCP1 Cre Cas9 마우스에 진통제를 피하 투여합니다. 그런 다음 면도기를 사용하여 견갑간 부위의 털을 면도하고 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올을 사용합니다.
메스를 사용하여 견갑골 사이의 갈색 지방 조직 위의 피부에 2cm 절개를하여 견갑간 지방을 노출시킵니다. 단일 절개를 한 후 지방 조직과 근육의 원위 영역 사이의 경계에서 지방 조직을 자릅니다. 그런 다음 주로 사용하는 손에 있는 수술용 가위를 사용하여 지방 조직을 무뚝뚝하고 수직으로 떼어내어 갈색 지방 조직을 노출시키고 갈색 지방 조직을 포함한 지방 조직을 비우세 손으로 꼬집습니다.
Sulzer의 정맥을 랜드마크로 사용하여 정확한 갈색 지방 조직 위치를 나타냅니다. 다음으로, 각 마우스에 대해 100 마이크로 리터 해밀턴 주사기에 연결된 날카로운 32 게이지 바늘을 사용하여 두 개의 갈색 지방 조직의 각 엽에 20 마이크로 리터의 아데노 관련 바이러스 또는 AAV를 천천히 주입합니다. AAV 투여 중 주입 부위에서 누출이 없음을 나타내는 성공적인 주입을 확인합니다.
항상성을 확보한 후 노출된 지방 조직을 정상 위치로 되돌려 5-0 흡수성 모노필라멘트 실을 사용하여 지방 조직과 근육의 가장자리를 봉합합니다. 마지막으로 5-0 코팅된 VICRYL 염색되지 않은 편조 실로 열린 피부를 봉합합니다. 갈색 지방 조직의 정확한 위치는 노출시키지 않고는 식별할 수 없지만 조직에 대한 과도한 노출 손상.
주사 실패로 이어질 수 있는 잠재적인 결함에는 AAV 용액을 잘못된 부위에 주입하는 것, 조직을 통한 바늘 침투, 과도한 양의 AAV 용액으로 인한 조직 풍선이 포함됩니다. 갈색 지방 조직에 AAV 단일 가이드 RNA를 정확하게 전달하는 것은 프로토콜의 성공에 결정적이었습니다. 갈색 지방 조직을 노출시키면서 성공의 열쇠는 가위의 방향과 깊이, 해밀턴 주사기의 위치를 포함한 수술용 가위 기술입니다.
이 기술은 갈색 지방 관련 에너지 대사의 분자 조절자를 이해하기 위해 부하를 발생시키는 조직 특이적 녹아웃 동물을 가지고 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 부속 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA 기술의 조합을 사용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법을 활용하면 선택적 교배 없이도 조직 특이적 녹아웃 마우스를 신속하게 생성할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 유전학
- 세포 생물학
- 분자 생물학
배경
- 갈색 지방 조직은 에너지 대사에 매우 중요합니다.
- 조직 특이적 녹아웃(knockout) 모델을 제작하면 생물학적 과정을 이해하는 데 도움이 됩니다.
- 이 방법은 잠재적으로 다른 조직에도 적용될 수 있습니다.
사용된 방법
- Cre-LoxP 및 CRISPR-Cas9 기법의 적용.
- 사용된 마우스 모델: UCP1 Cre Cas9 마우스.
- 외과적 미세주입을 통한 AAV-sgRNA 투여.
주요 결과
- 갈색 지방 조직의 성공적인 타겟팅 및 녹아웃.
- 조직 특이적 유전자 편집에서 AAV의 효능 입증.
- 정밀 전달을 위해 검증된 핵심 외과적 기술.
결론
- 본 연구는 갈색 지방 대사와 관련된 녹아웃 모델을 빠르게 생성하는 기술을 보여줍니다.
- 이는 에너지 대사의 분자 조절 인자에 대한 이해를 증진시킵니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 기술을 결합하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 신속하게 생성함으로써 대사 연구의 기능적 게놈 분석을 가속화할 수 있습니다. 이 접근 방식은 에너지 조절과 관련된 유전자의 표적 검증 및 기전적 위험 제거 과정을 간소화하여, 기존의 교배 방식에 비해 사이클 시간을 단축합니다. 또한, 이 방법은 초기 발견 및 중개 연구의 연속성에 필수적인 조직 특이적 통찰력을 제공함으로써 포트폴리오 결정 과정을 지원합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 갈색 지방 조직(BAT) 내 유전자 기능에 대한 직접적인 조사를 가능하게 하여 메커니즘을 명확히 규명합니다.
- 질병 관련 조직에서 유전자 효과를 분리함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 대사 질환의 표적 선택 시 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 하위 표현형 스크리닝을 위해 검증된 녹아웃 모델을 제공합니다.
- 재현 가능한 정량적 판독을 위해 유전적 배경을 표준화합니다.
- 긴 교배 주기를 생략함으로써 분석법 개발을 가속화합니다.
중개 및 전임상 연구
- BAT 특이적 유전자 편집을 통해 전임상 모델을 인간의 대사 질환 메커니즘과 일치시킵니다.
- 에너지 대사에 대한 유전자의 기여도를 명확히 하여 리스크가 조정된 연구 진행을 가능하게 합니다.
- 대사 연구에서 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 발견 및 표적 검증 단계에 통합되어, 대사 및 내분비 연구 포트폴리오를 위한 전임상 모델 개발로 이어지는 가교 역할을 합니다.
- 발견 생물학: 갈색 지방 조직(BAT) 매개 에너지 조절에서 가설 검증과 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량적 표현형 분석을 위한 재현 가능한 녹아웃 모델을 제공합니다.
- 분석: 생체 내(in vivo)에서 대사 출력물에 미치는 유전자 특이적 효과의 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 전임상 모델과 인간 갈색지방조직(BAT) 생물학 간의 일관성 확보를 용이하게 합니다.
- 기업 재사용: AAV 전달 방식을 수정하여 다른 조직에도 적용 가능한 프로토콜로, 더 광범위한 연구를 지원함&D 효용성
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화되고 재현 가능한 절차를 통해 모델 생성을 효율화합니다.
- 전략적 가치: 더 빠른 go/no-go 결정과 자본 효율적인 자원 배분을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 대사 및 내분비 타겟의 위험 조정 우선순위 지정을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 갈색지방조직(BAT)의 수술적 미세주입 및 해부학적 위치 파악에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- AAV 생산 및 CRISPR-Cas9 유전자 공학 인프라에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 재현성을 위해 팀 간의 엄격한 표준화가 요구됩니다.
- 다른 조직이나 장관을 표적으로 하는 경우 프로토콜 조정이 필요합니다.
- 성공 여부는 정밀한 AAV 전달과 조직 손상의 최소화에 달려 있습니다.
