Name: 인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포를 EECM 방법으로 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화하는 기술입니다. 이 방법은 혈관뇌장벽 특성과 성숙한 면역 표현형을 가진 세포를 생성하여 다발성 경화증 등 신경 질환 연구에 활용됩니다.

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HN은 우에하라 기념 재단, ECTRIMS 박사후 연구 교환 펠로우십, SNSF (JRPs) 보조금 번호 JPJSJRP20221507 및 KAKENHI 보조금 번호 22K15711, JST FOREST 프로그램 (보조금 번호 JPMJFR2269, 일본), 요코야마 임상 약리학 재단 보조금 번호 YRY-2217, 이치로 카네하라 재단, 나리시게 신경 과학 연구 재단, 과학 진흥을 위한 노바티스 재단(일본), 야마구치 대학 기금. BE는 스위스 MS 소사이어티와 스위스 국립 과학 재단(보조금 310030_189080 및 ZLJZ3_214086) 및 전략적 일본-스위스 과학 기술 프로그램(SJSSTP) 보조금 IZLJZ3_214086의 지원을 받았습니다.

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BE는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 T 세포 이동에 대한 나탈리주맙의 연장 투여를 연구하기 위해 Biogen으로부터 보조금을 받았고 신경 장애에서 혈액-뇌 장벽 기능 장애의 분자적 토대를 조사하기 위해 CSL Behring으로부터 보조금을 받았습니다. HN 및 BE는 EECM-BMEC-유사 셀과 관련된 임시 미국 특허 출원(63/084980 및 63/185815)의 발명자입니다.

중요 사항 및 문제 해결 EPC 분화를 시작하기 전에 연구자들은 hiPSC 배양에서 자발적인 세포 분화 사건이 발생하지 않았는지 확인해야 합니다. 자발적으로 분화된 세포의 부재와 순수한 hiPSC 콜로니의 사용은 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다. -3일의 hiPSC 파종 밀도는 MACS 후 CD31+ EPC의 고순도를 얻는 데 중요합니다. 각 hiPSC 라인 및 각 통로에 대한 파종 밀도는 최적화가 필요할 수 있습니다. hiPSC 라인 및 계대 수에 따라 시딩 밀도는 12웰 플레이트(20-100 x 10 3/cm2)의 웰당 75 x 10 3 내지 400 x 103 hiPSC의 범위일 수 있다. hiPSC의 최소 밀도 체크포인트는 2일째의 세포 밀도입니다. hiPSC는 늦어도 2일차까지 100% 밀도에 도달해야 합니다. hiPSC가 2일까지 합류하지 않으면 MACS 후 CD31+ EPC의 순도는 일반적으로 매우 낮습니다. 이 경우, hiPSC 시딩 밀도를 증가시킬 수 있다. 3일차에서 5일차 사이에 많은 수의 분화 세포가 플레이트에서 분리되면 초기 hiPSC 파종 밀도가 감소할 수 있습니다. 우리의 경험에서 7-8μM CHIR99021은 여기에 사용된 hiPSC 라인에 대한 최적의 농도이지만 억제제 치료에 다르게 반응할 수 있는 다른 hiPSC 라인에 대해 농도를 최적화해야 할 수도 있습니다. CD31+ EPC의 순도는 MACS 전후에 확인해야 합니다. MACS를 계속하기 전에 미리 분류된 세포 혼합물은 >10% CD31+ 세포여야 합니다. <6%의 CD31+ 세포 비율은 일반적으로 MACS 후 <80% EPC를 초래합니다. 이 상황에서는 초기 파종 밀도 및/또는 CHIR99021 농도의 최적화가 필요합니다.
순수 EC 단층의 성공적인 선택적 계대배양 및 생성을 위해서는 CD31+ EPC의 MACS 이후 순도가 매우 중요합니다. MACS 후 순도가 <90%이면 한두 번의 추가 세척이 권장됩니다(단계 1.4.11-1.4.12). 이상적으로, MACS 이후 순도는 >95%여야 합니다. 콜라겐 코팅 플레이트의 EPC 파종 밀도는 3-7일 이내에 100% 밀도를 달성하기 위해 hiPSC 라인에 따라 최적화되어야 합니다. EC가 100% 합류할 때까지 기다리면 일반적으로 성공적인 선택적 통과로 이어집니다. 그러나 100% 합류 EC의 경우에도 일부 hiPSC 라인의 SMLC도 조기에 분리됩니다. 이 경우, 더 낮은 밀도(예를 들어, ≤80%)에서의 선택적 패시징이 효과적일 수 있다. 일부 SMLC가 EC보다 먼저 분리되면 EC는 혼합 EC-SMLC 모집단에서 구출될 수 없는 경우가 많습니다. 이 경우 계대 교환 EC에서 해리 시약의 활성화 시간을 단축하고 반복적인 선택적 계대 교환이 도움이 될 수 있습니다. 트립신이 EC와 SMLC의 분리를 허용하지 않기 때문에 해리 시약으로 트립신이 아닌 상업용 해리 시약을 사용하는 것이 선택적 계대 시약에 유리합니다. 소분자 추적자를 사용한 당사의 투과성 분석과 밀착 접합 및 접착 분자 발현 수준 테스트는 EPC, EECM-BMEC 유사 세포 및 SMLC를 최소 2년 동안 액체 질소에 보관할 수 있음을 나타냅니다.
방법의 중요성과 한계 이 방법은 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 활성화하기 위해 화학적 GSK-3 억제제를 사용하여 CD31+ EPC를 hiPSC와 구별합니다. MACS에 의해 CD31+ EPC를 양성으로 선택한 후, EPC는 혼합 내피 및 SMLC 집단으로의 분화를 촉진하는 정의된 내피 배지에서 배양됩니다. 서로 다른 접착 특성을 가진 이러한 혼합 집단의 선택적 계대배양을 통해 SMLC에서 EC를 분리할 수 있습니다. 1회 또는 2회 계대 후, EECM-BMEC 유사 세포는 장벽 특성과 일차 인간 BMEC의 특성을 재현하는 내피 접착 분자의 발현을 나타냅니다. SMLC 또는 그의 상청액과의 공동 배양은 VCAM-1의 사이토카인 유도 발현을 유도합니다.
생체 내에서 BBB는 특정 수송체를 통한 영양소 수송 및 CNS로의 면역 세포 밀매 제어를 통해 분자의 낮은 세포 주위 및 세포 간 투과성을 확립함으로써 CNS 항상성을 유지합니다. BBB 연구의 경우, 관심있는 각 분자 및 기능을 표시하는 적합한 모델이 필수적입니다. 환자 또는 건강한 피험자로부터 정의된 시약 및 샘플을 사용하여 EECM-BMEC 유사 세포를 생산하면 확장 가능한 인간 BBB 모델이 제공됩니다. 다른 BBB 모델에 비해 EECM-BMEC-유사 세포를 사용하는 모델의 장점은 다음과 같다: 1) 일차 인간 BMEC의 형태 및 내피 전사체 프로파일(30); 2) 성숙한 밀착 접합부의 존재; 3) 바람직한 장벽 특성; 4) ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- 및 P-셀렉틴, CD99, 흑색종 세포 접착 분자(MCAM) 및 활성화된 백혈구 세포 접착 분자(ALCAM)22를 포함한 내피 접착 분자의 강력한 발현. 따라서 이 모델은 면역 세포와 BMEC 간의 상호 작용을 연구하는 데 특히 유용합니다. 소분자 추적자의 투과성은 iPSC 유래 BMEC 유사 세포에 대해 이전에 보고된 것보다 EECM-BMEC 유사 세포에서 더 높지만(14,15), 장벽 특성은 1차 인간 BMEC에 대해 설명된 것과 상당히 잘 비교됩니다. 이러한 유사성은 EECM-BMEC 유사 세포가 BBB의 양호한 시험관내 모델이 될 가능성이 높다는 것을 나타낸다. 생체 내에서 구성적 E-셀렉틴 발현이 결여된 비염증성 BBB를 연구하기 위해 이 모델을 사용할 때 생리학적 조건 하에서 EECM-BMEC 유사 세포에서의 E-셀렉틴 발현을 고려해야 한다 31. 이전 연구에서 우리는 EECM-BMEC 유사 세포가 단절된 밀착 접합부와 관련하여 MS 환자의 뇌에서 관찰된 바와 같이 BBB를 표현할 수 있음을 입증했습니다. 이는 소분자의 더 높은 투과성 및 기능적 접착 분자의 증가된 발현을 초래하여, BMEC-유사 세포32에 걸친 면역 세포의 증가된 접착 및 이동을 매개한다. 또한, 우리는 Wnt/β-카테닌 신호전달의 활성화가 MS 유래 EECM-BMEC 유사 세포에서 긴밀한 접합부의 파괴와 증가된 VCAM-1 발현을 개선할 수 있음을 보여주었습니다32. 이러한 결과는 모델이 MS와 같은 신경면역학적 질환에서 BBB의 역할을 연구하는 데 실제로 유용하다는 것을 나타냅니다.
종합하면, EECM-BMEC 유사 세포는 BBB 수준에서 병태생리학적 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 BBB 안정화를 위한 새로운 치료 표적을 개발하는 도구를 위한 유망한 도구입니다. 앞으로 이 모델은 더 넓은 범위의 질병에서 BBB 기능 장애를 연구하는 데 적용될 수 있으며 새로운 치료 접근법을 위한 길을 열 수 있습니다.

중추 신경계(CNS)의 신경혈관 단위(NVU)는 고도로 전문화된 미세혈관 내피 세포(EC), 내피 기저막에 박힌 혈관주위세포, 실질 기저막 및 성상교세포말단발로 구성됩니다1. NVU 내에서 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 형성하는 핵심 구성 요소입니다. BMEC는 복잡하고 연속적인 밀착 접합부를 형성하고 말초 기관의 미세혈관 EC에 비해 피노세포화 활성이 매우 낮아 BBB가 수용성 분자가 CNS로 자유 세포상 확산되는 것을 억제할 수 있습니다. BMEC에 의한 특정 유입 수송체 및 유출 펌프의 발현은 CNS2로부터 각각 영양소 및 유해 분자의 흡수 및 내보내기를 보장합니다. 또한, BBB는 CNS3로의 면역 세포 이동에 중요한 낮은 수준의 내피 접착 분자를 발현함으로써 CNS로의 면역 세포 진입을 엄격하게 제어합니다. 생리학적 조건에서 세포간 접착 분자-1(ICAM-1) 및 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM-1)과 같은 BMEC 표면의 접착 분자의 발현 수준은 낮지만 일부 신경 장애에서는 이러한 수준이 증가합니다2. BBB의 형태학적 및 기능적 쇠약은 뇌졸중4, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)5 및 여러 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)과 같은 많은 신경계 질환에서 보고된다 6,7,8. 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 BMEC의 세포 및 분자 특성에 대한 자세한 조사는 BBB를 표적으로 하는 새로운 치료 전략을 식별하는 접근 방식입니다.
최근까지 일차 또는 불멸의 인간 및 설치류 BMEC가 BBB를 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 접착 분자와 용질 운반 단백질을 포함한 몇 가지 중요한 분자의 발현이 인간과 설치류 간에 다르기 때문에 BBB의 동물 모델에 기초한 결론이 인간 BBB에 쉽게 적용될 수 있는지 여부는 불분명합니다 9,10. hCMEC/D3와 같은 인간 BMEC 라인은 적절한 수준의 접착 분자를 발현하지만11, 이러한 불멸화된 BMEC는 일반적으로 복잡한 밀착 접합부와 견고한 장벽 특성을 갖지 않는다12. 일차 인간 BMEC는 장벽 기능(barrier function)13을 연구하는데 유용하지만, 모든 연구자들이 쉽게 이용할 수 있는 것은 아니다. 또한, 환자의 원발성 BMEC는 특정 임상 조건에서만 수행되는 뇌 생검 또는 수술을 통해 수집해야 하기 때문에 얻기 어려울 수 있습니다.
최근 줄기 세포 기술의 발전으로 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)와 같은 줄기 세포 공급원에서 발생하는 다양한 인간 세포 유형의 분화가 가능해졌습니다. hiPSC 유래 모델을 통해 환자 유래 샘플을 사용하여 병태생리학적 모델을 설정할 수 있습니다. 여러 hiPSC 유래 세포 유형을 결합하여 생리학적 조건을 더 잘 모방하는 자가 공동 배양 또는 오가노이드를 설정할 수 있습니다. 몇몇 널리 사용되는 프로토콜(14,15,16,17,18,19)은 BBB-특이적 수송체 및 유출 펌프의 발현과 함께 강력한 확산 장벽 특성을 갖는 hiPSC-유래 BMEC-유사 세포를 분화시키는데 사용될 수 있고, 소분자의 세포 주위 확산, 분자 수송 메커니즘, 및 뇌로의 약물 전달을 연구하는데 유용하다 20,21. 그러나 이전 연구에서는 널리 사용되는 hiPSC 유래 BMEC 유사 세포가 면역 세포와 BBB22 사이의 상호 작용을 매개하는 VCAM-1, 셀렉틴 및 ICAM-2를 포함한 주요 내피 접착 분자의 발현이 부족하다는 것을 보여주었습니다. 또한, 이전의 hiPSC 유래 BMEC는 전사 수준23에서 혼합된 내피 및 상피 특성을 나타내는 것으로 보고되었습니다. 따라서 우리는 형태, 장벽 특성 및 내피 접착 분자 발현과 관련하여 hiPSC를 일차 인간 BMEC와 유사한 BMEC 유사 세포로 분화할 수 있는 새로운 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)을 개발했습니다. 이 프로토콜은 hiPSC를 성숙한 면역 표현형을 나타내는 BMEC 유사 세포로 분화하기 위한 자세한 방법론적 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.22 mm 주사기 필터</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Falcon 세포 여과기</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 튜브</td><td>SPL</td><td>40005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심 분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트, 둥근 바닥</td><td>SPL</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ml</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>All-in-One 형광 현미경</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(503), 무혈청</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA), dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere 희석 완충액</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-07183 중 7.5%</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>인간 태반의 콜라겐 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>코닝 조직 배양 플레이트(12웰)</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>코닝 조직 배양 플레이트(6-well)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>극저온 튜브 이너캡 2.0 mL</td><td>Watson</td><td>1396-201S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO), 멸균</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s (d) PBS (칼슘, 마그네슘 제외)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 배지/영양소 혼합물 F-12 (DMEM-F12)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>EasySepFITC 포지티브 셀렉션 키트 II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18558</td><td></td></tr><tr><td>EasySepMagnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 용액DPBS</td><td>Sigma</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td> 0.02%, 적격 <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>소 혈장에서 추출한 피브로넥틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17144002</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 소프트웨어(버전 2.0.0)</td><td>Image J, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version10</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 용액</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>인간 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)</td><td>Tocris</td><td>233-FB-500</td><td></td></tr><tr><td>iPS 인간 유도 만능 줄기 세포</td><td>Riken RBC</td><td>HPS1006</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate (100x)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15160-047</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus-cGMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-100-0276</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 전체 키트(기초 매체 플러스 53 보충제)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Millipore</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IFN-감마 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>BD 생명과학</td><td>554603</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-알파 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-020</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 매체 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>FEATHER</td><td>2975-11</td><td></td></tr><tr><td>탈지유</td><td>BD Biosciences</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨(NaN3)</td><td>시그마-알드리치</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루베이트</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Transwells, PC 멤브레인, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated</td><td>Corning</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>078180</td><td></td></tr><tr><td>물, 멸균, 세포 배양</td><td>시그마-알드리치</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

혈액-뇌 장벽(BBB) 기능 장애는 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 많은 신경퇴행성 및 신경염증성 질환의 병리학적 특징입니다. 질병 관련 BBB 샘플에 대한 제한된 접근으로 인해 BBB 오작동이 질병 발병의 원인인지 아니면 신경염증 또는 신경퇴행성 과정의 결과인지는 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 따라서 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)는 건강한 기증자와 환자로부터 시험관 내 BBB 모델을 확립하여 개별 환자의 질병 특이적 BBB 특성을 연구할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다. hiPSC에서 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포를 유도하기 위한 여러 분화 프로토콜이 확립되었습니다. 각 BMEC 차별화 프로토콜의 올바른 선택을 위해서는 특정 연구 질문에 대한 고려가 필수입니다. 여기에서는 hiPSC를 성숙한 면역 표현형을 가진 BMEC 유사 세포로 분화하도록 최적화되어 면역 세포-BBB 상호 작용을 연구할 수 있는 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서 hiPSC는 먼저 Wnt/β-카테닌 신호 전달을 활성화하여 내피 전구 세포(EPC)로 분화됩니다. 그런 다음 평활근 유사 세포(SMLC)를 포함하는 결과 배양물을 순차적으로 계대배양하여 내피 세포(EC)의 순도를 높이고 BBB 특이적 특성을 유도합니다. EECM-BMEC와 이러한 SMLC 또는 SMLC의 컨디셔닝 배지의 공동 배양은 EC 접착 분자의 재현 가능하고 구성적이며 사이토카인 조절 발현을 허용합니다. 중요하게도, EECM-BMEC-유사 세포는 일차 인간 BMEC에 필적하는 장벽 특성을 확립하고, 모든 EC 부착 분자의 발현으로 인해, EECM-BMEC-유사 세포는 다른 hiPSC-유래 시험관 내 BBB 모델과 상이하다. 따라서 EECM-BMEC 유사 세포는 개인화된 방식으로 면역 세포 상호 작용에 영향을 미치는 BBB 수준에서 질병 과정의 잠재적 영향을 조사하기 위해 선택되는 모델입니다.

투과성 분석 소듐 플루오레세인의 투과성은 15분, 30분, 45분, 60분에 하부 챔버로부터 채취한 매질의 형광 강도를 측정함으로써 계산하였다. 각 시점에서 총 150 μL의 배지를 샘플링하고 150 μL의 누락된 부피를 hECSR 배지로 교체합니다. 형광 강도는 형광 플레이트 리더(485nm 여기/530nm 방출)를 사용하여 판독하고 올바른 신호, 간극 부피 및 투과율은 앞서 설명한 수식18 을 사용하여 계산됩니다(표 2). 시간이 지남에 따라 플루오레세인 나트륨의 형광 강도가 증가하는지 확인하는 것이 좋습니다. 재현성을 보장하기 위해 하나의 분석에 여러 필터(최소 3배)를 사용해야 합니다. 건강한 대조군 유래 EECM-BMEC 유사 세포의 경우 플루오레세인나트륨(376Da) 투과성은 0.3 x 10-3cm /min 미만이어야 합니다. 융합성 EECM-BMEC 유사 세포 단층의 형성을 확인하기 위해, 투과성 분석에 사용되는 각 필터의 EECM-BMEC 유사 세포의 접합 단백질에 대한 면역형광 염색을 이 분석에 따라 수행해야 합니다.
면역형광 염색 claudin-5, occludin, VE-cadherin1을 포함한 EECM-BMEC 유사 세포 접합 분자의 면역형광 염색을 사용하여 세포 형태와 연속적이고 성숙한 접합부의 존재를 평가했습니다(그림 4). 필터 삽입물의 멤브레인 상의 EECM-BMEC-유사 세포의 단층을 20초 동안 차가운 메탄올(-20°C)로 고정하고, 블로킹 완충액(표 1)으로 차단한 다음, 1차 및 2차 항체와 함께 배양하였다. EECM-BMEC 유사 세포는 방추형 및 지그재그 모양의 접합부를 나타내었으며, 이들 모두는 BMECs27의 특징적인 형태학적 특징이다. 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 인터페론-γ(INF-γ)(0.1ng/mL TNF-α + 2IU/mL IFN-γ)과 같은 전염증성 사이토카인으로 챔버 슬라이드에 파종된 EECM-BMEC 유사 세포의 자극은 SMLC 유래 조건 배지에 희석되어 ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 접착 분자의 발현을 상향 조절했습니다28 (그림 5). α-평활근 액틴(SMA), 칼포닌 및 평활근 단백질 22-알파(SM22a)29를 포함한 평활근 세포 마커의 대표적인 이미지가 그림 6에 나와 있습니다. 챔버 슬라이드에 시딩된 SMLC를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고 차단 완충액으로 차단한 다음 1차 및 2차 항체와 함께 배양했습니다.
EECM-BMEC 유사 세포에 의한 세포 표면 부착 분자 발현의 유세포 분석 EECM-BMEC 유사 세포에서 내피 부착 분자의 세포 표면 발현에 대한 대표적인 결과가 도 7에 나와 있다. TNF-α 및 INF-γ와 같은 전염증성 사이토카인을 사용한 자극은 ICAM-1, VCAM-1 및 P-셀렉틴을 포함한 여러 접착 분자의 세포 표면 발현을 상향 조절했습니다. SMLC 조건 배지로 EECM-BMEC 유사 세포를 배양하면 내피 VCAM-1 세포 표면 발현이 향상되었습니다. VCAM-1 세포 표면 발현 유도의 효과는 SMLC-조건화된 배지의 배치에 따라 달라질 수 있다. 어떤 배치가 VCAM-1의 적절한 발현을 유도하는지 확인하기 위해 SMLC를 구별할 때 동일한 hiPSC 소스에서 파생된 SMLC에서 수확된 컨디셔닝 배지의 여러 배치를 저장하는 것이 좋습니다.
정적 조건에서의 면역세포 부착 분석 부착된 면역 세포의 수는 EECM-BMEC 유사 세포의 표면에서 기능적 접착 분자의 발현 수준과 상관관계가 있습니다. 염증성 사이토카인을 사용한 자극은 내피 부착 분자의 발현을 상향 조절하고 EECM-BMEC 유사 세포 단층에 부착하는 면역 세포의 수를 증가시켰습니다(그림 8). 현재의 실험은 EECM-BMEC 유사 세포에 대한 접착 분자의 기능을 입증하여 이 모델을 면역 세포-EC 상호작용을 연구하는 데 적합하게 만들었습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig02.jpg"> 그림 2: CD31+ EC의 정제. MACS 전(단계 1.4.7) 및 후(단계 1.4.14)의 세포 집단의 EC의 산란 게이팅 및 FITC 표지된 CD31 염색으로부터의 대표적인 유세포 분석 데이터의 도트 플롯. MACS는 모집단에서 CD31+ EPC의 순도를 향상시킵니다. 약어: SSC = 측면 산란; FSC = 순방향 산란; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; MACS = 자기 활성화 세포 분류. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig03.jpg"> 그림 3: 소듐 플루오레세인의 원시 형광 강도에서 계산된 EECM-BMEC 단층 투과성(10-3cm/min). 클리어런스 부피의 선형 기울기는 각 필터에 대한 선형 회귀를 사용하여 계산됩니다(그림 3A). 불화나트륨의 투과성은 두 가지 공식을 사용하여 계산됩니다(그림 3B). (A) 시간 대비 클리어런스 부피의 선형 기울기는 필터 1(mc1) 및 블랭크 필터(mf)에 대한 선형 회귀를 사용하여 계산되었습니다. mc1 및mf는 각각Xc1 및Xf의 계수이다. (B) mc 및 mf를 사용하여 플루오레세인 투과율(Pe)을 계산하는 공식(화학식 1). Pe 단위는 필터의 표면적을 이용하여 환산하였다(화학식 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig04.jpg"> 그림 4: EECM-BMEC 유사 세포는 성숙한 세포 접합부를 나타냅니다. 삽입 필터의 막에서 성장한 EECM-BMEC 유사 세포에서 claudin-5, occludin 또는 VE-cadherin(빨간색)에 대한 면역형광 염색. 핵은 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(청색)을 사용하여 염색하였다. 투과성 분석에 사용된 것과 정확히 동일한 필터 삽입물 상에서 염색을 수행하였다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig05.jpg"> 그림 5: EECM-BMEC 유사 세포에 의한 내피 접착 분자의 발현. 면역형광 염색은 SMLC 유래 CM의 존재 하에 필터 삽입물의 막에서 성장한 EECM-BMEC-유사 세포에 대해 수행하였다. ICAM-1 또는 VCAM-1(빨간색)에 대한 면역염색은 비자극 및 1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ 자극된 EECM-BMEC-유사 세포에 대해 나타내었다. 핵은 DAPI(청색)로 염색하였다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig06.jpg"> 그림 6: SMLC의 특성화. 챔버 슬라이드에서 성장한 SMLC에 대한 α-평활근 액틴(SMA), 칼포닌 또는 평활근 단백질 22-알파(SM22a)(빨간색)의 면역세포화학이 표시됩니다. 핵은 DAPI(청색)로 염색하였다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig07.jpg"> 그림 7: EECM-BMEC 유사 세포에서 부착 분자의 내피 세포 표면 발현. EECM-BMEC-유사 세포에 대한 EC 표면 부착 분자 발현의 유세포 분석 결과가 나타나 있다. EECM-BMEC-유사 세포는 SMLC-유래 조건화 배지를 사용하여 배양하였다. 히스토그램 오버레이의 파란색, 빨간색 및 회색 선은 각각 비자극(NS) 조건, 1ng/mL TNF-α + 20IU/mL IFN-γ 자극 조건 및 이소타입 대조군을 보여줍니다. 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), ICAM-2, 혈관 세포 접착 분자 1(VCAM-1), P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD99 및 혈소판 내피 세포 접착 분자-1(PECAM-1)을 포함하는 내피 접착 분자의 세포 표면 발현을 평가하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig08.jpg"> 그림 8: EECM-BMEC 유사 세포에 대한 면역 세포의 부착. (A) 비자극(NS) 및 0.1ng/mL TNF-α + 2IU/mL IFN-γ 자극(TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC 유사 세포 단층에 형광 표지된 부착 면역 세포의 이미지. 이미지는 우물의 중심에 해당합니다. 스케일 바 = 50 μm. (B) NS 및 TNF-α + IFN-γ-자극 EECM-BMEC-유사 세포의 단층에서 형광 표지된 면역 세포의 수. 부착 면역 세포/시야(FOV)는 FIJI 소프트웨어를 사용하여 자동으로 계산되었습니다. 점은 부착된 T 세포의 수를 나타낸다. 막대는 평균값을 나타내고 오차 막대는 8개 시행의 표준 편차(SD)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 분석을 위한 특정 시약의 세부 사항. 각 특정 시약의 이름과 정확한 성분 양이 설명되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table1_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: Pe 계산을 위한 형광 플레이트 리더의 원시 데이터 예. 굵은 글씨체로 표시된 숫자는 플레이트 리더로 측정한 소듐 플루오레세인의 원시 형광 강도입니다. 데이터를 정확하게 분석하려면 원시 값에서 배경 신호를 제거하고 하단 챔버 샘플링으로 인한 신호 손실을 고려한 다음 신호를 수정해야 합니다. 예를 들어, 배경을 뺀 후 15분 샘플은 100 상대 형광 단위(RFU)의 신호를 나타내고 30분 샘플은 150 RFU의 신호를 나타냅니다. 30분에 보정된 신호는 (150 RFU + 15분에서의 결측값[100 RFU x 150 μL/1,500 μL])이며, 이는 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU입니다. 클리어런스 부피 = (1,500 x [SB,t])/(ST,60분), 여기서 1,500은 하단 챔버의 부피(1,500μL), SB,t는 시간 t에서 보정된 신호,ST,60분은 60분에서 상단 챔버의 신호입니다<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table2_RE.xlsx" target="_blank">. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 만능 줄기 세포를 뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC) 유사 세포로 분화할 수 있는 프로토콜인 확장된 내피 세포 배양 방법(EECM)에 대해 설명합니다. 이들 세포는 내피 세포 부착 분자 발현을 보여주므로 시험관 내에서 면역 세포 상호작용을 연구하기에 적합한 인간 혈액-뇌 장벽 모델입니다.

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

이것은 인간 유도 만능 줄기 세포를 우수한 장벽 특성, 성숙한 밀착 접합 및 중앙 초보자 시스템으로의 면역 세포 이동을 매개하는 내피 세포 부착 분자의 발현을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포로 분화할 수 있는 최초의 프로토콜입니다. EECM-BMEC 유사 세포는 완전 자가 방식으로 환자로부터 파생된 혈액 뇌 장벽 모델을 사용하여 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 면역 세포 이동을 연구할 수 있습니다. 다발성 경화증 환자에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 EECM-BMEC 유사 세포로 분화함으로써 다발성 경화증 환자의 이러한 시험관 내 모델에서 내재적 장벽 결함을 식별할 수 있었습니다.따라서 이 문화적 방법을 통해 우리는 미래에 이러한 손상된 장벽 특성의 기초가 되는 분자 경로를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법은 혈청 형태 및 CNS로의 면역 세포 침윤이 이러한 발병기전, 예를 들어 뇌졸중 또는 신경감염에 중요한 광범위한 질병에 적용될 수 있습니다. 이 기술을 처음 시도 할 때 동일한 양의 셀 재료를 사용하십시오.시드 밀도는 이 프로토콜의 성공의 열쇠이며 사용된 클론에 따라 조정해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 조교수 인 Kinya Matsuo가 될 것입니다. 내피 전구 세포 배양의 5일째에, 웰로부터 배지를 흡인하고, 각 웰에 1밀리리터의 해리 시약을 첨가한다.섭씨 37도에서 6-8분 동안 플레이트를 배양합니다. 마이크로피펫을 사용하여 세포를 해리하고 특이화합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 통과시켜 10밀리리터의 DMEM/F-12 10 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브로 여과합니다.소화 반응을 멈추려면 DM DMEM/F-12 10 배지를 최대 50밀리리터 표시까지 추가합니다. 철저하게 피펫을 만들고 세포 수를 계산하기 위해 10 마이크로 리터를 예약하십시오. 50 밀리리터 튜브를 200 g에서 섭씨 20 내지 25도에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠릿화한다.원심분리 후 상층액을 제거하고 10밀리리터의 DMEM/F-12 10 배지로 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 섭씨 20 내지 25도에서 5분 동안 200g에서 원심분리하여 세포를 다시 펠렛화하였다.그런 다음 세포 펠릿을 유동 완충액 1에 다시 현탁합니다. 다음으로, FCR 차단 시약을 1 대 100 비율로 첨가하고 5 분 동안 배양한다. 이어서, 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC 표지된 CD31 항체를 200 비율로 첨가한다.섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 어둠 속에서 30 분 동안 현탁액을 배양하십시오. 배양이 끝나면 10 밀리리터의 유동 완충액 1을 샘플에 첨가하고 CD31 양성 세포의 분획을 결정하기 위해 유세포 분석을 위해 10 마이크로 리터의 현탁액을 예약합니다. 세포를 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 5분 동안 200g에서 원심분리한다.원심분리 후 세포를 유동 완충용액 1개로 재현탁한다. 다음으로, 세포 현탁액 100 마이크로리터당 FITC 선택 칵테일 5 마이크로리터를 첨가한다. 피펫팅으로 용액을 완전히 혼합하고 섭씨 20도에서 25도 사이의 온도에서 15분 동안 어둠 속에서 배양합니다.다음으로, 세포 현탁액 100 마이크로 리터 당 5 마이크로 리터의 자성 나노 입자를 첨가한다. 혼합물을 잘 피펫팅하고 섭씨 20-25도에서 10분 동안 암실에서 배양합니다. 세포 현탁액을 5 밀리리터 유세포 분석 튜브로 옮기고 유동 완충액 1을 첨가하여 총 부피 2.5 밀리리터를 얻는다.그런 다음 유세포 분석 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다. 연속적인 동작으로 자석을 뒤집고 표지되지 않은 FITC CD31 항체가 포함된 세포 현탁액을 디캔팅합니다. 자석과 튜브를 거꾸로 된 위치에 2-3초 동안 유지한 다음 남은 액체를 제거합니다.튜브를 똑바로 세우기 전에 튜브 가장자리의 물방울을 흡인하십시오. 자석에서 유세포 분석 튜브를 회수하고 2.5 밀리리터의 유동 완충액을 첨가하여 나머지 CD31 양성 세포를 세척한다. 세포를 두세 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 다시 일시 중단합니다.그런 다음 유동 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다. 세척을 4회 이상 반복하여 FITC CD31 표지되지 않은 세포를 튜브로부터 제거하였다. 자석으로부터 유동 튜브를 제거하고, 정제된 CD31 양성 세포를 원하는 양의 적절한 배지로 재현탁한다.현탁액의 10마이크로리터 분취량 2개를 예약하는데, 하나는 세포 계수용이고 다른 하나는 자성 활성화 후 세포 분류 샘플에서 CD31 양성 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 내피 및 비내피 세포 집단을 함유하는 6개의 웰 플레이트로부터 HECSR 배지를 제거한다. 그런 다음 각 웰에 1 밀리리터의 해리 시약을 첨가하십시오.현미경으로 세포 형태를주의 깊게 관찰하십시오. 내피 세포가 밝고 둥글게 보이면 보통 2-5분 이내에 판 가장자리를 두드려 분리합니다. 비내피 세포는 플레이트에 부착된 상태로 유지됩니다.마이크로피펫을 사용하여 비내피 세포를 방해하지 않고 분리된 내피 세포를 조심스럽게 수집하고 해리 시약 10밀리리터당 4밀리리터의 DMEM/F-12 10이 들어 있는 15밀리리터 또는 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 나머지 부착 된 비 내피 세포가 들어있는 웰에 HECSR 배지 2 밀리리터를 추가하여 세포 또는 SMLC와 같은 평활근을 만들고 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 내피 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다.철저히 혼합하고 세포 계수를 위해 현탁액 10 마이크로 리터를 예약하십시오. 나머지 세포를 200g에서 섭씨 20-25도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 HECSR 배지 2 밀리리터를 추가하십시오.다음에, 미리 제조된 콜라겐 코딩된 6웰 플레이트로부터 용액용 콜라겐을 제거하고, 2밀리리터의 내피 세포 현탁액을 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 플레이트를 배양합니다. claudin-5, occludin 및 VE-cadherin을 포함하는 EECM-BMEC 유사 세포 접합 분자의 면역형광 염색을 사용하여 세포 형태와 연속적이고 성숙한 접합부의 존재를 평가했습니다.SMLC 유래 조건 배지에 희석된 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마와 같은 전염증성 사이토카인으로 챔버 슬라이드에 시딩된 EECM-BMEC 유사 세포의 자극은 ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 접착 분자의 발현을 상향 조절했습니다. 알파 평활근 액틴, 칼포닌 및 평활근 단백질 22 알파를 포함하는 평활근 세포 마커의 대표 이미지가 여기에 표시됩니다. 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마와 같은 전염증성 사이토카인을 사용한 EECM-BMEC 유사 세포의 자극은 ICAM-1, VCAM-1 및 P-셀렉틴을 포함한 여러 접착 분자의 세포 표면 발현을 상향 조절했습니다.또한, 염증성 사이토카인을 이용한 자극은 내피 부착 분자의 발현을 상향 조절하고 EECM-BMEC 유사 세포 단층에 부착하는 면역 세포의 수 증가를 촉진합니다. EECM-BMEC 유사 세포는 혈액-뇌장벽 수준에서 병태생리학적 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 혈액-뇌장벽 안정화를 위한 새로운 치료 표적을 개발하는 데 유용한 도구로서 유망합니다.

differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells-to-brain

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포를 뇌 내피 세포로 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다.

유도 만능 줄기 세포에서 뇌 내피 세포 생성

이 비디오는 인간 만능 세포를 미세아교세포와 같은 세포로 분화하는 과정을 보여줍니다. 이 과정에는 배아체를 형성하고, 코팅된 우물로 옮기고, 특정 성장 인자를 사용하여 원시 대식세포 전구체로 분화를 유도하고, 최종적으로 미세아교세포와 같은 세포로 분화하는 것이 포함됩니다.

human-induced pluripotent stem cells into microglia-like cells (인간 유도 만능 줄기 세포를 Microglia-like cells로 분화)

이 동영상은 인간 iPSC를 뇌 미세혈관 내피 세포로 분화하는 다단계 과정을 보여줍니다. 이렇게 분화된 세포는 긴밀한 연접을 특징으로 하는 뇌 미세혈관 내피 세포를 밀접하게 모방하여 뇌 질환 연구에 이상적입니다.

Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Brain Microvascular Endothelial Cells

직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하여 얻은 뇌 미생물 내피 세포를 도출, 확장 및 냉동 보존하고, 전 생체 모델에서 혈액 뇌 장벽 특성을 연구하는 적응된 방법을 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포를 EECM 방법으로 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화하는 기술입니다. 이 방법은 혈관뇌장벽 특성과 성숙한 면역 표현형을 가진 세포를 생성하여 다발성 경화증 등 신경 질환 연구에 활용됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포를 성숙한 면역 표현형을 가진 뇌 미세혈관 내피 세포 유사 세포로 분화

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