Name: 형질전환 Aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 형질전환 Aedes aegypti 모기의 생식력, 날개 크기, 수명 등 적합도 매개변수를 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 유전자 변형 모기의 생태학적 영향을 평가하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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저자들은 이 프로토콜에 대한 지원을 해준 미주리 대학의 Bill Reid 박사와 Alexander Franz 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자들은 또한 R 분석을 지원해 준 NIH/NIAID의 Benjamin Krajacich 박사에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 NIH, 보조금 번호 R01 AI130085(KEO) 및 NIH/NIAID 교내 연구 프로그램 AI001246(EC)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Dawkins, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawkins%2C+R+%22The+Selfish+Gene.+New+edition%22">The Selfish Gene. New edition</a>. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).</li>
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<li>Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+fitness+costs+for+transgenic+Aedes+aegypti+expressing+the+GFP+marker+and+transposase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).</li>
<li>Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+of+anopheline+mosquitoes+expressing+transgenes+that+inhibit+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development.</a> Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).</li>
<li>Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+transgenesis+on+mosquito+fitness%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review.</a> Frontiers in Insect Science. 38, (2022).</li>
<li>Hammond, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+creation+and+selection+of+mutations+resistant+to+a+gene+drive+over+multiple+generations+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito.</a> PLOS Genetics. 13 (10), (2017).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+single-locus+CRISPR%2FCas9-based+gene+drive+variants+in+the+mosquito+Aedes+aegypti+via+single-generation+crosses+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling.</a> 3 (12), (2022).</li>
<li>Wu, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MGDrivE+2%3A+A+simulation+framework+for+gene+drive+systems+incorporating+seasonality+and+epidemiological+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).</li>
<li>Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+drive+and+resilience+through+renewal+with+next+generation+Cleave+and+Rescue+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).</li>
<li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Champer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+homing+gene+drive+targeting+a+haplolethal+gene+removes+resistance+alleles+and+successfully+spreads+through+a+cage+population%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).</li>
<li>Champer, S. E. 15, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+and+experimental+performance+of+CRISPR+homing+gene+drive+strategies+with+multiplexed+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs.</a> Science Advances. 6 (10), (2020).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.+eLife%5BTitle%5D)+AND+%229%22%5BJournal%5D)">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife.</a> 9. 51701, (2020).</li>
<li>Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+homing+suppression+drive+candidates+exhibit+unexpected+performance+differences+in+simulations+with+spatial+structure%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure.</a> eLife. 11, 79121(2022).</li>
<li>Petersen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+correlation+between+wing+size+and+body+weight+in+captive+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+da+Sociedade+Brasileira+de+Medicina+Tropical%22%5BJournal%5D)">Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus.</a> Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).</li>
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<li>Fecundity Briegel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((metabolism%2C+and+body+size+in+Anopheles+%28Diptera%3A+Culicidae%29%2C+vectors+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria.</a> Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).</li>
<li>Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bloodfeeding%2C+fecundity+and+infection+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Today%22%5BJournal%5D)">Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes.</a> Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
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<li>Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+and+genetic+modification+on+Aedes+aegypti+larval+competition+and+adult+energy+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves.</a> Parasites and Vectors. 3, (2010).</li>
<li>Rezende, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+desiccation+resistance+in+Aedes+aegypti%3A+presumptive+role+of+the+chitinized+serosal+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle.</a> BMC Developmental Biology. 8, (2008).</li>
<li>Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Darker+eggs+of+mosquitoes+resist+more+to+dry+conditions%3A+Melanin+enhances+serosal+cuticle+contribution+in+egg+resistance+to+desiccation+in+Aedes%2C+Anopheles+and+Culex+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).</li>
<li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+pornoscopy%3A+Observation+and+interruption+of+Aedes+aegypti+copulation+to+determine+female+polyandric+event+and+mixed+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny.</a> PLoS ONE. 13 (3), (2018).</li>
<li>Helinski, M. E., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+history+and+body+size+influence+female+fecundity+and+longevity+of+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).</li>
<li>Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+sexual+history+influences+female+fertility+and+re-mating+incidence+in+the+mosquito+vector+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).</li>
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저자는 밝힐 것이 없습니다.

Ae. aegypti 피트니스 연구는 이 원고에서 논의된 바와 같이 형질전환 화물(예: 유전자 구동 요소) 또는 유전자 녹아웃과 관련된 피트니스 비용을 평가하기 위해 실험실에서 종종 수행됩니다. 그러나, 이러한 연구는 다양한 목적으로 수행될 수 있으며, Wolbachia-infected 30,31, insecticide resistant32,33 또는 arbovirus-infected 34와 같은 Ae. aegypti 그룹의 건강을 평가하는 것을 목표로 한다. 따라서 이러한 실험은 다양한 목적으로 사용될 수 있기 때문에 프로토콜은 간단하고 효율적이며 재현 가능하도록 의도되었습니다.
<p class="jove_...

적자생존(survival of the fittest)은 환경에 가장 잘 적응된 유전자를 가진 개체가 그 유전자를 다음 세대에 물려준다는 다윈의 생각이다1. 이것은 그들의 유전자가 생존할 것인지를 결정하는 것이 적합성이라는 것을 의미한다. 150년 이상 된 이 개념은 아마도 형질전환 모기에서 성공적인 유전자 드라이브를 엔지니어링하는 데 있어 가장 중요한 결정 요인일 것입니다. 유전자 드라이브(gene drives) 또는 이기적인 유전 요소가 개체군을 통해 퍼질 수 있도록 하는 슈퍼 멘델 유전 패턴(super-Mendelian inheritance pattern)2이 유전적 해충 관리를 위해 연구되고 있다3. 매개체 통제의 맥락에서 이 전략은 야생형(WT) 절지동물을 병원체에 내성이 있는 절지동물로 대체하거나(개체군 수정) 모두 제거(개체군 억제)하는 것을 목표로 합니다(개체군 억제)4. 그러나 형질전환 모기는 WT 모기에 비해 적합성 비용(유전적 부하라고도 함)을 보이는 경우가 많으며, 이는 형질전환 유전자가 그들을 능가할 수 있는 개체군에서 손실될 것임을 의미합니다. 따라서 전이유전자를 유전자 구동 시스템과 결합하는 것은 적응 비용을 상쇄하고 전형적인 멘델 유전에서 기대되는 것보다 더 높은 수준으로 전이유전자를 집단을 통해 밀어내기 위해 필요하다4.
모기 매개체 종에 대한 실험실 연구는 전이 유전자가 종종 적합성 비용 5,6,7을 표시한다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, Irvin et al. Drosophila actin 5C 또는 합성 3XP3 프로모터에서 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 또는 transposase 유전자를 발현하도록 조작된 Aedes(Ae.) aegypti에서 다양한 생명 매개변수를 측정하고 이를 야생형 Orlando 균주(파생된 것과 동일한 유전적 배경)와 비교했습니다5. 가장 주목할 만한 것은, 모든 유전자 변형 균주가 생식 적합성을 현저히 감소시킨다는 것을 발견했다5. 전이유전자에 따라, Plasmodium 기생충 발달을 억제하는 전이유전자를 발현하는 일부 Anopheles (An.) 모기도 적합성 비용을 나타냈다6. 구체적으로, 구성적 또는 혈액 가루 유발 프로모터에서 봉독 포스포리파아제(PLA2)를 발현하는 An. stephensi는 대조군에 비해 현저히 적은 수의 난자를 낳았다6. 저자들은 또한 다른 전이유전자인 SM1 도데카펩타이드 테트라머를 발현하는 형질전환 아노펠레스(transgenic Anopheles)가 적합성 비용을 나타내지 않는다는 것을 발견했으며, 이로 인해 형질전환유전자가 부여하는 적합성 비용이 적어도 부분적으로는 생성된 형질전환 단백질의 효과에 의존한다는 결론을 내렸습니다6. 실제로, 적합성 비용은 전이유전자 산물, 위치 효과, off-target 효과, 삽입 돌연변이 유발 또는 실험실 사육 균주에서의 근친 교배 효과에 기인할 수 있다7. 따라서 유전자 드라이브는 이러한 유전자 변형으로 인한 적합성 비용을 상쇄할 수 있을 만큼 충분히 견고해야 하며, 드라이브 자체를 차단하는 삽입 및 삭제(indel)의 발생을 방지해야 합니다.
발달 또는 생식 적합성 비용은 실험실 또는 케이지 연구에서 측정할 수 있으며7 현장에서 알려지지 않은 요인도 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 통제된 적합성 연구는 유전자 드라이브 프로그램과 같은 유전자 변형 모기 방출을 계획하거나 평가할 때 형질전환 계통이 다음 세대에 걸쳐 지속되는지 여부를 결정하기 위한 중요한 첫 번째 단계입니다. 예를 들어, Hammond et al. 여성의 생식력에 필요한 유전자를 파괴하기 위한 감비아 CRISPR/Cas9 기반 유전자 드라이브 평가8. 적어도 25세대에 걸쳐 유지된 케이지 연구를 통해, 저자들은 모기가 CRISPR 표적 분열을 차단하고 암컷의 생식력을 회복시키는 유전자 구동 저항성 대립유전자를 발생시킨다는 것을 발견했다8. 그들의 모델링 노력은 유전자 드라이브에 대한 이형접합 암컷의 생식력이 시뮬레이션된 조건에서 유전자 드라이브 고정에 가장 극적인 영향을 미친다는 것을 시사했다8. 이와 같은 맥락에서, 서로 다른 프로모터 또는 다른 유전자 간 유전자좌에서 자율 유전자 구동 카세트를 발현하도록 설계된 Ae. aegypti(Higgs' White Eye strain, HWE)는 시뮬레이션된 집단에서 서로 다른 유전자 구동 고정률을 나타냈다9. 저자들은 MGDrivE 모델링10을 사용하여 측정된 indel 형성 속도, 모성 효과 및 실험실에서 수집한 생명 매개변수 데이터와 결합하여 모기의 적합성이 시뮬레이션된 조건에서 유전자 드라이브의 지속성에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 발견했습니다9. 유전자 드라이브 효율성을 손상시킬 가능성이 가장 높은 적합성 비용은 내재적 드라이브 자체보다는 체세포 Cas9(과잉) 발현 또는 표적화된 유전자, 특히 이형접합체에서 기인합니다 11,12,13,14,15,16,17.
그 중요성을 감안할 때, 적합성은 형질전환 계통이 다음 세대에 걸쳐 지속될 수 있는 능력에 대한 중요한 요소이며, 전이 유전자와 관련된 모든 생리학적 효과에 대한 지표로 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 오프 타겟 효과는 피트니스 비용과 관련이 있을 수 있습니다. 이 경우, 여러 세대에 걸쳐 형질전환 계통을 역교배하는 것이 권장됩니다. 더욱이, 현장 집단을 반영하는 것과 형질전환 선을 교차하는 것은 형질전환 집단이 실제 세계에서 얼마나 잘 경쟁할 수 있는지 조사하기 위해 필요할 수도 있습니다. 적합성 비용을 정량화하여 비교할 수 있도록 하기 위해 이 원고는 Ae. Aegypti 모기의 일반적인 생활사 특성을 측정하기 위한 간단한 프로토콜을 제공하며, 특히 형질전환 유전자와 관련된 적합성 비용에 중점을 두어 이러한 연구를 보다 쉽게 재현할 수 있습니다. 프로토콜에는 생식력, 출산력, 성비, 생존 가능성, 발달 시간, 남성 기여도 및 성인 수명이 포함됩니다. 날개 길이와 면적을 측정하는 것은 흉부 길이18,19 및 신체 크기 측정과 관련이 있기 때문에 체력 측정으로 선택되었으며, 이는 혈중 크기, 생식력 및 면역20,21과 직접적인 관련이 있습니다. 체력을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 이러한 매개변수는 생식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다.

<table><tbody><tr><td>1 oz. 반투명 플라스틱 수플레 컵</td><td>WebstaurantStore</td><td>301100PC</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. 반투명 폴리스티렌 수플레 컵</td><td>WebstaurantStore</td><td>760P200N</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 플라스틱 피펫&nbsp;</td><td>Cornin</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>어떤 브랜드</td><td></td><td></td>든</tr><tr><td>64 oz. 흰색 더블 폴리코팅 종이 식품 컵</td><td>WebstaurantStore</td><td>999SOUP64WB</td><td>모기 봉쇄용</td></tr><tr><td>65 mm 렌즈&nbsp;</td><td>Canon</td><td>MP-E 65mm f/2.8 1-5x 매크로 사진</td><td>Canon 매크로 포토 MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; 줌=1, 200, 6.3, ISO=100; 날개나 달걀 종이를 촬영하기 위해, 비록 다른 카메라로도 충분할 것 같지만,</td></tr><tr><td>Aedes aegypti&nbsp; 모기</td><td>BEI</td><td>알과 같은 여러 균주를 사용할 수 있습니다</td><td></td></tr><tr><td>인공 멤브레인 피더</td><td>https://lillieglassblowers.com/</td> <td>Meduim 멤브레인 피더, 맞춤 제작, 33mm</td><td>Chemglass도 제공하지만 크기는 우리에게 잘못되었습니다. 우리 것은 약 3cm입니까?</td></tr><tr><td>ATP</td><td>MP Biomedical</td><td>ICN15026605</td><td>어떤 좋은 품질의 ATP, -20에서 10mM 필터 멸균 분취</td></tr>액 <tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>는 물을 살균하기 위한</td></tr><tr><td>캐논 EOS 7D 카메라를</td> 위한 것입니다.<td>Canon</td><td>3814B004</td>는 <td>날개나 달걀 종이를 촬영하기 위한 것이지만, 다른 카메라로는</td></tr><tr><td>충분히 탈피린 양의 피일 가능성이 높습니다&nbsp;</td><td>콜로라도 세럼 Co.</td><td>60ml, 2주마다</td><td>https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated</td></tr><tr><td>듀얼 구즈넥 현미경 조명기</td><td>Dolan Jenner Fiber-Lite 180</td><td>181-1 시스템</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Dumont</td><td>5SF</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td>omnisorb ii</td><td>4" 부직포 스폰지</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시, 100 &times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-546</td> 얼음 돼지의 내장<td>에 모기를 마취/조작하기 위한</td></tr><tr><td></td><td>모든 델리는</td><td></td><td>대량으로 구매하고, 분할하고, 세척하고, ~4X12"의 작은 분량수에 보관합니다. -20 인치 50ml 원뿔형</td></tr><tr><td>얼음</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Leica GZ4 StereoZoom 현미경</td><td></td><td></td><td>, 유전자 변형 모기를 선별하기 위한 현미경 (해당되는 경우)</td></tr><tr><td>페인트브러시</td><td>AIT 합성 브러시&nbsp;</td><td>애벌레/번데기 조작을 위한</td> <td>사이즈 10-0</td> (아마존)</tr><tr><td>팬티 호스</td><td>Walmart</td><td>L'eggs Everyday</td><td>&nbsp; 여성용 나일론 Plus Knee Highs Sheer Toe, 16 쌍 (plus fits the carton)연필</td></tr> <tr><td></td><td>어떤 브랜드</td><td></td><td></td>의</tr><tr><td>플라스틱 용기든지 2도; 상자 저장을 위한</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 58 Qt 보관 상자 투명 베이스 흰색 뚜껑 8개 세트</td></tr><tr><td>성장하는 애벌레를 위한 플라스틱 용기</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 28 Qt. 보관 상자 플라스틱, 흰색,</td></tr><tr><td>애벌레 부화용 플라스틱 용기</td> 10개 세트 <td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 6 Qt. 보관 상자 플라스틱, 흰색</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 투명 델리 용기&nbsp;</td><td>웹스타우란트스토어</td><td>&nbsp; 127DM12BULK</td><td>12 oz 또는 더 큰 (127RD16BULK)에 필요한 경우 16 oz</td></tr> <tr><td>고무 밴드</td><td>Office Max</td><td>&nbsp;#100736/#909606 /#3777415</td><td>12", #64 및 #10</td></tr><tr><td>고무 스토퍼</td><td>VWR</td><td>217-0515</td><td>모기 봉쇄용</td></tr><tr><td>설탕 공급원 테</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트라민 플레이크 식품</td><td>Tetramin</td><td>16106</td><td></td></tr><tr><td>tpsDig</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>tpsUtil</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td> 온라인에서 배포되는 <td>무료 형태 이미지 처리 소프트웨어 https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>White organza fabric 8" &times; 8"</td><td>FabricWholesale.com&nbsp;</td><td>4491676</td><td>Joann Casa Collection Organza Fabric by Casa Collection&nbsp;</td></tr><tr><td>Whitman 등급 1 정성적 필터 용지&nbsp;</td><td>Whitman</td><td>1001-824</td><td>계란 논문. 흰색은 검은 알을 더 쉽게 볼 수 있도록 합니다.</td></tr></tbody></table>

형질전환 aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

형질전환 모기는 야생형 모기에 비해 체력 단련 비용이 많이 드는 경우가 많습니다. 이와 관련하여, 적합성 비용 연구는 유전자 변형 모기로부터 생명 매개변수 데이터를 수집하고, 이를 동일한 유전적 배경에서 전이유전자가 없는 모기와 비교하는 것을 포함한다. 이 원고는 번식력, 날개 크기 및 모양, 생식력, 성비, 생존 가능성, 발달 시간, 수컷 기여도 및 성인 수명을 포함하여 모기 Aedes aegypti의 일반적인 생활사 특성을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이러한 매개변수는 번식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다. 대표적인 결과는 유전자 knock-out 또는 유전자 구동 요소의 단일 삽입과 관련된 적합성 비용을 정량화합니다. 생명 매개 변수 데이터 수집 방법을 표준화하는 것이 중요한데, 이러한 데이터는 여러 연구에서 생성된 형질전환 모기의 건강 상태를 비교하거나 시뮬레이션된 야생형 모기 개체군에서 전이유전자 고정률을 모델링하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 Aedes aegypti에 특이적이지만, 특정 생물학적 맥락에 따라 특별한 적응이 필요할 수 있다는 경고와 함께 다른 모기 종 또는 기타 실험적 치료 조건에도 사용될 수 있습니다.

위의 프로토콜에 따라 두 가지 모기 계통의 적합성을 평가했습니다: (1) CRISPR/Cas9 매개 knock out of the Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) salivary protein 및 (2) Ae. Aegypti lines 발현 자율적인 CRISPR/Cas9 매개 유전자 드라이브9. 전자의 경우, D7L1 유전자에 특이적인 sgRNA를 배아에 미세주입한 후 파쇄를 생성하기 위해 NHEJ(non-homologous end-joining pathway)를 이용하여 동형접합 D7L1 knock-out line을 구축했습니다. 이형접합 D7L1-KO 모기는 잠재적인 비표적 효과를 제거하기 위해 안정적인 동형접합 계통을 생성하기 전에 WT로 4세대 동안 역교배되었습니다. 후자의 경우, 나노 (AAEL012107) 또는 인넥신-4 (AAEL006726) 프로모터(이 프로토콜에서 각각 ...

본 프로토콜은 Aedes aegypti 모기의 생식력, 날개 크기, 생식력, 성비, 생존 능력, 발달 시간, 수컷 기여도 및 성체 수명을 포함한 일반적인 생명 매개 변수 데이터를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 측정은 유전자 변형 모기의 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

형질전환 Aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

이 프로토콜은 aedes aegypti 모기의 체력을 반영하는 표준 측정을 보여주며, 이러한 적합성 매개변수는 번식 성공을 반영하고 측정이 간단하며 일반적으로 문헌에 보고되기 때문에 선택되었습니다. 우선, 곤충류의 멸균 물에 계란 종이를 하룻밤 동안 넣어 형질 전환 및 야생형 모기를 부화시킵니다. 유충이 갈은 물고기 음식 슬러리를 몇 방울 떨어뜨려 즉시 먹이를 먹을 수 있도록 합니다.성체가 처녀인지 확인하려면 번데기가 나오면 성별에 따라 번데기를 분리하고 번데기를 유리 현미경 슬라이드로 옮기고 조직으로 과도한 물을 제거하여 번데기를 고정시킵니다. 끝이 가늘게 파인 붓을 사용하여 2배에서 4배까지 입체경으로 번데기의 얼굴을 위로 향하게 합니다. 그런 다음 생식기 모양의 차이를 찾기 위해 꼬리를 육안으로 분석합니다.수컷과 암컷 번데기를 적절한 격리 하에 별도의 물컵에 넣으십시오. 야생형 또는 형질전환 유전자 드라이브 1명 또는 유전자 드라이브 2명의 수컷을 처녀 야생형 암컷과 대량으로 교배하려면, 약 150마리의 모기가 들어있는 모기통에 5마리의 수컷과 1마리의 암컷의 비율로 마취된 모기를 추가합니다. 2-3일 후, 표준 사육 방법에 따라 암컷에게 먹이를 줄 수 있도록 케이지에 혈액 공급원을 제공하십시오.피를 먹인 암컷과 먹이를 먹지 않은 암컷을 구분하여 복부의 충혈 여부를 육안으로 검사하고 먹이를 주지 않은 암컷은 부분적으로, 먹이를 먹은 암컷, 수컷으로 버립니다. 충혈된 암컷을 각각의 우리에 다시 넣습니다. 2-3 일 후, 연필로 미리 라벨이 붙은 여과지로 안감을 댄 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 개별 암컷을 넣으십시오.모든 튜브에 5ml의 수돗물을 채웁니다. 건포도나 설탕에 적신 면봉을 각 원뿔형 튜브에 놓습니다. 암컷을 1-2일 동안 곤충 속에 두고 산란할 수 있도록 합니다.그런 다음 각 종이에 있는 난자의 수를 세고 각 종이에 세어진 난자의 수를 선별된 암컷의 수로 나눈 평균 생식력을 계산합니다. 달걀 종이를 말리려면 튜브에서 물을 빼내고 곤충에 다시 넣으십시오. 완료된 번식력 연구에서 피를 먹인 암컷을 얼리려면 모기장을 섭씨 영하 20도에서 약 15분 동안 놓습니다.각 모기의 왼쪽 날개를 절개하여 날개 관절과 흉부를 절제하고 날개 전체를 제거합니다. 집게를 사용하여 날개를 유리 슬라이드에 평평하게 놓은 다음 전사 피펫을 사용하여 슬라이드의 날개에 70% 에탄올과 주방 세제 1방울로 구성된 15밀리리터 원액

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서 우리는 함께 RNAi - 중재 유전자 입을를...

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

RIDL ®(지배적인 치명적인 곤충을 운반하는 곤충의 방출) 시스템을 사용하여 Aedes aegypti의 인구 억제를 달성하기 위해 많은 수컷 모기를 풀어야 합니다. 이를 위해서는 대량 사육 기술과 기술을 사용하여 고품질의 남성 모기의 최대 수를 얻기 위해 신뢰할 수 있는 시스템을 제공해야 합니다.

브라질에서 필드 릴리스에 대 한 유전자 변형 Aedes aegypti의 대량 생산

뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

Aedes aegypti 모기 Wolbachia 감염 arboviruses의 전송을 억제 하는 자연적인 인구에 발표 되는. 우리 실험실 적응 및 선택 최소화 하기 위해 예방 조치를 복용 실험 및 필드 릴리스, 후면 Ae aegypti Wolbachia 감염 실험실에서 하는 방법을 설명 합니다.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

무균 곤충 기술 (SIT)은 화학적 통제에 내성이있을 수있는 의학적으로 중요한 특정 모기 개체군을 통제하는 데 사용됩니다. 여기에서는 Aedes aegypti 모기를 표적으로 하는 운영 SIT 프로그램에서 방출하기 위해 무균 수컷 모기를 대량 사육하고 준비하는 방법을 설명합니다.

운영 멸균 곤충 기술 프로그램에서 방출하기 위해 조사되고 표시된 수컷 Aedes aegypti 모기 준비

여기서는 형광염을 마커로 사용하여 남성 Aedes aegypti의 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 여성 모기는 교화를 위해 표시되고 표시되지 않은 수컷 모두에 노출됩니다. 후 짝짓기, 그들의 정자는 그들의 짝짓기 파트너를 결정하기 위하여 형광 현미경의 밑에 검토됩니다.

형광염염을 사용하여 로다민 B, 남성 Aedes aegypti 모기에서 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위해

여기에서 보고된 프로토콜은 실험실에 포함된 작은 케이지 예심에서 벡터 통제를 위한 유전으로 조작된 모기의 성능을 평가하는 세 가지 대안을 보여줍니다. 각 프로토콜은 모기 균주 곰 (유전자 드라이브 또는 비 유전자 드라이브)과 측정 된 매개 변수의 유형을 특정 수정에 맞게 조정됩니다.

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여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

학습하세요 형질전환 Aedes aegypti 모기의 생식력, 날개 크기, 수명 등 적합도 매개변수를 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 유전자 변형 모기의 생태학적 영향을 평가하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

형질전환 Aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화

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