Name: 힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 고속 자기 핀셋을 이용한 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체의 나노 역학 측정 방법을. 1.2kHz 측정 속도로 생체 분자의 역학적 변화를 실시간 모니터링하여 역학생물학적 메커니즘을 규명합니다.

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이 연구는 한국 정부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 및 NRF-2021R1A6A1A10042944)의 지원을 받았습니다. S.-H.R. NRF 보조금(2021R1C1C2009717)의 지원을 받았습니다.

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 연구에서 우리는 높은 시공간 정밀도에서 생체 분자의 구조적 변화를 관찰할 수 있는 단일 분자 힘 분광법 설정을 도입했습니다. 사용된 고속 CMOS 카메라는 1,280 x 1,024 해상도에서 1,200 프레임 s-1 을 획득하여 1.2kHz 비드 트래킹을 가능하게 합니다. 그러나 측정 속도는 현재 비드 추적 소프트웨어에 의해 제한되므로 고속 측정에서 ROI는 일반적으로 더 작은 영역으로 감소합니다. SLD의 고출력은 최대 몇 kHz 대역폭의 빠른 비드 이미징에 중요한 밝은 조명을 제공합니다. 또한 빔의 공간적 일관성은 비드 주위에 고대비 동심원 회절 링을 생성하여(그림 1A, 삽입) 대칭을 기반으로 비드 위치를 정밀하게 결정할 수 있습니다.
비드-테더 구조체에 가해지는 자기력은 테더링된 비드(35,37,38</...

세포는 기계적 자극을 능동적으로 감지하고 반응합니다. 그렇게 함으로써 많은 생체 분자는 역동적인 구조적 변화를 가능하게 하는 힘 의존적 특성을 나타냅니다. 잘 알려진 예로는 세포에 주변 환경의 주요 기계적 정보를 제공하는 기계에 민감한 이온 채널과 세포골격 요소가 있습니다.
또한, 독특한 힘을 지닌 성질을 나타내는 분자는 더 넓은 의미에서 기계에 민감한 것으로 간주 될 수 있습니다. 예를 들어, 핵산 이중가닥의 국소 형성 및 용융뿐만 아니라 G-사중가닥과 같은 고차 구조는 복제, 전사, 재조합, 그리고 최근에는 게놈 편집에서 중요한 역할을 합니다. 또한, 시냅스 통신에 관여하는 일부 신경 단백질은 일반적인 분자간 상호 작용 수준을 초과하는 물리적 힘을 생성하여 기능을 수행합니다. 어떤 예를 연구하든, 높은 시공간 정밀도로 관련된 생체 분자의 나노 역학을 조사하는 것은 관련 기계 생물학적 과정 1,2,3의 분자 메커니즘을 밝히는 데 매우 유용하다는 것을 증명할 것입니다.
단일분자 힘 분광법은 생체분자 2,4,5,6의 기계적 성질을 조사하는 강력한 도구로 사용되어 왔다. 그들은 힘의 적용과 동시에 핵산과 단백질의 구조적 변화를 모니터링하여 힘 의존적 특성을 조사할 수 있습니다. 잘 알려진 두 가지 설정은 광학 핀셋과 자기 핀셋(MT)으로, 미크론 크기의 비드를 사용하여 분자 5,6,7,8을 조작합니다. 이러한 플랫폼에서 폴리스티렌(광학 핀셋용) 또는 마그네틱 비드(MT용)는 일반적으로 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 짧은 단편으로 구성된 분자 "핸들"을 통해 표적 분자(예: 핵산 및 단백질)에 연결됩니다. 그런 다음 비드를 움직여 힘을 가하고 이미지를 작성하여 표적 분자의 구조적 변화를 보고하는 위치를 추적합니다. 광학 핀셋과 자기 핀셋은 응용 분야에서 크게 상호 교환할 수 있지만 힘을 제어하는 접근 방식에는 중요한 차이점이 있습니다. 광학 핀셋은 본질적으로 비드를 제자리에 가두는 위치 클램프 도구로, 대상 구조물이 모양 변화를 겪을 때 가해지는 힘이 변동하기 때문입니다. 펼침과 같은 확장 증가는 밧줄을 느슨하게 하고 장력을 감소시키며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 광학 핀셋의 힘을 제어하기 위해 능동 피드백을 구현할 수 있지만, MT는 환경 섭동에도 견딜 수 있는 영구 자석에 의한 안정적인 원거리 자기력을 활용하여 자연스럽게 힘 클램프 장치로 작동합니다.
오랜 역사와 단순한 설계에도 불구하고 MT는 고속 비드 추적의 기술적 문제로 인해 고정밀 측정에 대한 응용 분야에서 광학 핀셋에 비해 뒤쳐져 있습니다. 그러나 최근 여러 그룹이 공동으로 MT 기기 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19의 하드웨어와 소프트웨어의 다각적인 개선을 주도하고 있습니다 . 이 연구에서는 1.2kHz에서 실행되는 이러한 설정의 예를 소개하고 이를 사용하여 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노역학적 측정을 수행하는 방법을 설명합니다. 모델 시스템으로서 우리는 DNA 헤어핀과 뉴런 SNARE 복합체를 사용하고 피코네톤 체계에서 빠르고 구조적인 변화를 조사합니다. DNA 헤어핀은 잘 정의된 힘 범위20,21에서 간단한 2-상태 전이를 나타내므로 핀셋 설정의 성능을 검증하기 위한 장난감 모델 역할을 합니다. SNARE 단백질이 막 융합을 구동하는 힘에 민감한 복합체로 조립됨에 따라(22), 이들은 또한 단분자 힘 분광법(single-molecule force spectroscopy)에 의해 광범위하게 연구되었다 14,23,24,25. 데이터를 분석하고 열역학 및 동역학에 대한 유용한 정보를 추출하는 표준 접근 방식이 제시됩니다. 우리는 이 기사가 기계생물학 연구에서 고정밀 MT의 채택을 촉진하고 독자들이 자신의 힘에 민감한 관심 시스템을 탐색하도록 동기를 부여할 수 있기를 바랍니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

단일 분자 자기 핀셋(MT)은 핵산 및 단백질과 같은 생체 분자를 강력하게 조사하는 강력한 도구 역할을 하므로 기계 생물학 분야에서 유용할 태세입니다. 이 방법은 일반적으로 마그네틱 비드의 이미지 기반 추적에 의존하기 때문에 이미지 기록 및 분석의 속도 제한과 비드의 열 변동으로 인해 표적 분자의 작고 빠른 구조적 변화를 관찰하는 데 오랫동안 적용이 방해를 받았습니다. 이 글에서는 생체 분자 및 그 복합체의 나노 단위, 밀리초 역학을 해결할 수 있는 고분해능 MT 설정의 구성 및 작동에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 응용 사례로서, DNA 헤어핀과 SNARE 복합체 (막 융합 기계)를 사용한 실험이 시연되며, 피코 네톤 규모의 힘이있을 때 일시적인 상태와 전이를 어떻게 감지 할 수 있는지에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 고속 MT가 세포에서 힘을 감지, 전송 및 생성하는 분자에 대한 고정밀 나노 역학 측정을 계속 가능하게 하여 기계 생물학에 대한 분자 수준의 이해를 심화할 것으로 기대합니다.

힘 교정 두 가지 힘 측정 방법(비드의 측면 변위 분산 및 전력 스펙트럼 분석)의 결과는 0-2pN 차이가 났습니다(그림 2G). 그림 2F의 결과에 따르면 일반 네오디뮴 자석으로 최대 30pN에 안정적으로 도달할 수 있습니다.
8bp DNA 헤어핀의 2상태 전이 우리는 먼저 짧은 DNA 헤어핀의 나노 역학을 조사했습니다 (그림 5). DNA 헤어핀은 기존의 단일 분자 힘 분광법에 의해 광범위하게 특성화되어 왔기 때문에 비교할 수 있는 방대한 참조 소스를 사용할 수 있습니다. 짧은 머리핀의 압축 해제는 일반적으로 되돌릴 수 있으므로 압축 해제가 발생하는 동일한 힘 범위에서도 재압축 이벤트가 관찰됩니다(그림 5A</...

여기에서는 최대 1.2kHz의 속도로 힘에 민감한 생체 분자에 대한 나노기계적 측정을 수행하는 고속 자기 핀셋 설정에 대해 설명합니다. 우리는 모델 시스템으로 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체에 대한 적용을 소개하지만 기계 생물학적 사건에 관여하는 다른 분자에도 적용 할 수 있습니다.

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

생체 분자는 종종 힘에 반응하여 작고 빠른 구조적 변화를 겪습니다. 고해상도 마그네틱 핀셋은 생리학적으로 관련된 힘 하에서 이러한 역학을 탐색할 수 있습니다. 이 방법은 밀리초 단위의 정밀도로 나노 스케일을 측정하기 때문에 핵산과 단백질의 미묘한 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.첫 번째 베어링 및 기계에 민감한 단백질의 오작동은 잠재적으로 심혈관 및 근골격계 질환을 유발할 수 있습니다. 마그네틱 핀셋은 이러한 단백질의 작동 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 좋은 해상도를 얻으려면 세트를 적절하게 정렬하고 보정해야 합니다.또한 측정을 위한 분자 구조를 준비하고 식별하는 동안 주의를 기울여야 합니다. 진동 방지 광학 테이블에 도립 현미경을 설치하는 것으로 시작합니다. 다음으로 고속 CMOS 카메라와 프레임 그래버를 설치합니다.이동 거리가 20mm 이상인 전동 리니어 스테이지를 수동 XY 스테이지에 수직으로 장착하여 3D로 자석 조작을 위한 변환 스테이지를 구축합니다. 다음으로 회전식 스테퍼 모터와 자석 회전용 벨트 및 풀리 시스템을 설치합니다. 동일한 평행 자석이 1mm 간격으로 배치된 아크릴 홀더에 자석을 장착합니다.병진 스테이지의 수직 위치를 조정하여 자석의 바닥면이 가장 낮은 s와 정렬되도록 samp가장 낮은 단계 위치. 저배율 대물 렌즈를 사용하여 자석을 시야의 중심에 맞춥니다. 자석 회전을 확인하여 자석 쌍 중심의 변위가 제한되는지 확인하십시오.비드 조명용 초발광 다이오드를 설치합니다. 빔이 틈새에 맞도록 적절하게 시준되고 조명이 자석에 의해 가려지지 않도록 자석 틈을 통해 빔을 통과시킵니다. 이제 노즈 피스에 피에조 렌즈 스캐너를 설치하고 비드 추적을 위해 100 개수 조리개가 있는 1.5X 오일 이멀젼 대물 렌즈를 장착합니다.비드 추적에서 잠재적인 아티팩트를 방지하기 위해 조명이 자석 움직임과 균일한지 확인합니다. 마지막으로 픽셀 채도 없이 조명을 최대 밝기로 조정합니다. 셀의 상단과 하단에 두 개의 유리 커버 슬립을 가져 와서 시작하십시오.커버슬립을 1몰 수산화칼륨에 30분 동안 초음파 처리하여 청소합니다. 그런 다음 커버슬립을 증류수로 헹구고 물에 담가 두십시오. 하단 커버슬립을 페일링하고 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.실험 당일, 페길화된 커버슬립을 질소 건으로 불어 건조시킵니다. 간단한 채널을 만들려면 약 2mm 너비의 양면 테이프 스트립을 준비하

high-speed-magnetic-tweezers-for-nanomechanical-measurements-on-force

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

마그네틱 핀셋, 강력한 단일 분자 조작 기술은 생물학적 거대 분자에 (자기 토크 핀셋 칭했다 구성을 사용하여) 및 토크 (자기 핀셋을 자유롭게 선회 불리는 구성을 사용하여) 꼬임의 직접적인 측정을 위해 구성 될 수있다. 이러한 측정을 수행하기위한 지침은 DNA 및 관련 nucleo 단백질 필라멘트의 연구에 응용 프로그램을 포함하여 제공됩니다.

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

단일 분자 자석 족집게 플랫폼 G-quadruplexes를 조작 하는 보고, G4 안정성과 규제의 연구에 대 한 수 있는 다양 한 단백질에 의해.

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

자기력 현미경(MFM)은 수직으로 자화된 원자력 현미경 프로브를 사용하여 나노 스케일 분해능으로 샘플 지형과 국부 자기장 강도를 측정합니다. MFM 공간 분해능과 감도를 최적화하려면 리프트 높이 감소와 드라이브(진동) 진폭 증가의 균형을 맞춰야 하며 불활성 분위기의 글로브박스에서 작동하는 이점을 누릴 수 있습니다.

자기력 현미경 분해능과 감도를 최적화하여 나노스케일 자기 도메인 시각화

이 프로토콜은 단일 분자 자기 핀셋을 사용하여 텔로미어 DNA 결합 단백질(텔로미어 반복 결합 인자 1[TRF1] 및 TRF2)과 인간 세포에서 추출한 긴 텔로미어 간의 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 텔로미어 및 텔로메릭 반복 결합 인자에 대한 준비 단계, 단일 분자 실험의 실행, 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 설명합니다.

Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

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여기 선물이 전체 셀 전기 화학 실험 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 복잡 한 외부 막 한다 통해 extracellular 전자 전송의 속도를 양성자 수송의 기여를 공부 하는 프로토콜.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

배우세요 고속 자기 핀셋을 이용한 DNA 헤어핀과 SNARE 복합체의 나노 역학 측정 방법을. 1.2kHz 측정 속도로 생체 분자의 역학적 변화를 실시간 모니터링하여 역학생물학적 메커니즘을 규명합니다.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

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