Name: 지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 학습하세요 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 활용하여 지카 바이러스 감염과 항바이러스제 효능을 실시간으로 평가하는 방법을. A549 세포에서 바이러스 감염 동역학을 비침습적으로 분석하고 IC50 값을 산출하여 항바이러스 화합물의 효과를 정량적으로 검증할 수 있습니다.

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저자는 원고를 교정해 준 Clément Heymann과 Gorrit Lootsma에게 감사를 표합니다. 이 연구는 바이러스 및 화학 요법 연구소 (Rega Institute, KU Leuven)의 내부 보조금으로 지원되었습니다.

설명된 모든 단계는 생물 안전 레벨 2 실험실의 층류 캐비닛에서 무균 조건에서 수행됩니다. 사용된 모든 바이러스는 벨기에 기관 검토 위원회(Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, 프로토콜 SBB 219 2011/0011) 및 KU Leuven의 생물안전 위원회의 규칙에 따라 승인된 대로 획득 및 사용되었습니다.
1. 세포 배양 유지
참고: 이 프로토콜은 다양한 세포주를 선택하여 수행되지만 물론 모든 부착 세포주에 적용할 수 있으며 세포 파종 밀도 최적화만 필요합니다.
<ol><li>A549 인간 폐 선암 세포주, U87 인간 악성 교모세포종 세포주, 및 HEL 299 인간 배아 폐 섬유아세포를 T75 배양 플라스크에서 37°C 및 5%CO2 가습 인큐베이터에서 성장시켰다.</li>
	<li>80%-95% 밀도로 세포를 계대 배양합니다. 모든 시약은 세포를 배양하기 전에 실온(RT)에 있어야 합니다.</li>
	<li>세포로부터 컨디셔닝된 배양 배지를 제거한다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL를 사용하여 세포 단층을 한 번 세척합니다.</li>
	<li>0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 세포 단층 위에 골고루 분배합니다. 그런 다음 세포가 분리되기 시작할 때까지 37°C에서 최대 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>9mL의 신선하고 완전한 성장 배지를 추가합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 피펫을 부드럽게 위아래로 움직여 세포를 다시 정지시킵니다.</li>
	<li>원하는 부피의 세포 현탁액을 새로운 T75 배양 플라스크에 옮기고 적절한 부피의 신선한 성장 배지를 첨가하여 총 부피 15mL를 얻습니다. 참고: 이 프로토콜에 사용된 시험관 내 세포주는 이상적인 성장 조건을 허용하기 위해 특정 세포주에 따라 1:4에서 1:10 희석으로 계대 배양됩니다. 계대 배양은 3-4 일마다 수행되므로 원하는 세포 현탁액의 양은 배양 일수에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>2. CEI 플레이트의 제조
<ol><li>interdigitated 전극이 있는 96웰 플레이트( 재료 표 참조)를 취하고 모든 웰에 100μL의 성장 배양 배지를 채웁니다.</li>
	<li>우물 사이의 공간을 DPBS로 채 웁니다. 참고: 이는 96웰 플레이트에서 세포를 배양할 때 관찰되는 증발로 인한 가장자리 효과를 줄이기 위해 수행됩니다.</li>
	<li>플레이트를 5%CO2가 있는 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.</li>
</ol>3. 세포의 파종
<ol><li>섹션 1에 설명된 대로 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 50mL 튜브의 신선한 성장 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>선택한 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산하십시오. 참고: A549 세포의 경우 생존율은 일반적으로 ~100%에 이릅니다. 세포 수를 결정하기 위해 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색을 기반으로 하는 자동 세포 분석 시스템을 사용합니다( 재료 표 참조). 다른 세포 계수 방법도 똑같이 잘 작동합니다.</li>
	<li>원하는 세포 밀도를 얻기 위해 신선한 성장 배지에서 세포를 재현탁합니다. 이 연구에서 최적의 A549 세포 밀도는 0.15 × 106 (생존) 세포/mL입니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 interdigitated 전극이있는 96 웰 플레이트를 꺼내고 다중 채널 피펫으로 배지를 제거합니다.</li>
	<li>96-웰 플레이트에 웰 당 100 μL의 세포 현탁액(이 경우 15 ×10 3 세포에 해당)을 분주한다.</li>
	<li>세포를 CEI 장치에 넣기 전에 실온에서 15분 동안 평형을 이루도록 합니다.</li>
</ol>4. CEI 분석 설정 및 실행
<ol><li>CEI 장치 플레이트 홀더가 있는 인큐베이터를 37°C 및 5%CO2에 놓습니다.</li>
	<li>장치에 96웰 플레이트를 놓습니다.</li>
	<li>기기의 소프트웨어를 열고 데이터 수집 패널에서 설정을 클릭하여 새 실험을 설정합니다. 랩톱이 ECIS 장치에 연결될 때까지 기다렸다가 웰의 임피던스를 확인하여 플레이트를 구성합니다. 녹색으로 표시된 대로 모든 웰이 올바르게 구성되었는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 모든 웰이 녹색이 될 때까지 4.2단계를 반복합니다.</li>
	<li>Well Configuration 창에서 사용된 Culture Ware에 따라 배열 유형을 선택합니다.</li>
	<li>다중 주파수/시간 모드를 선택합니다. 알림: 이 모드에서 장치는 주파수 범위에서 임피던스 변화를 측정합니다.</li>
	<li>시작을 클릭하여 측정을 시작합니다. 알림: 실시간 임피던스는 소프트웨어 인터페이스에서 모니터링할 수 있습니다. 표시할 주파수 를 선택합니다. 이 예에서는 16kHz가 선택됩니다.</li>
</ol>5. 화합물 준비 및 배양
참고: 항바이러스 화합물의 예로 labyrinthopeptin A1이 사용됩니다( 재료 표 참조). 이 프로토콜은 잠재적인 항바이러스 활성이 있는 모든 화합물에 일반화될 수 있기 때문에 이를 '화합물'이라고 합니다.
<ol><li>소 태아 혈청(FBS)('분석 완충액'이라고 함)을 첨가하지 않은 완전한 세포 배양 배지가 RT에서 평형을 이루도록 합니다.</li>
	<li>화합물을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>5mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 각 화합물의 10배 농축 희석액을 준비합니다.</li>
	<li>5mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 화합물을 연속적으로 희석하여 원하는 10x 농도를 얻습니다.</li>
	<li>데이터 수집 설정 분할창에서 일시정지를 클릭하여 CEI 장치를 일시정지하십시오. 현재 시점이 완료될 때까지 기다렸다가 96웰 플레이트를 꺼냅니다.</li>
	<li>광학 현미경으로 세포의 부착 및 단층 형성을 확인합니다.</li>
	<li>멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 20 μL를 제거합니다.</li>
	<li>20 μL의 화합물 용액 또는 비히클을 원하는 웰에 첨가한다. 적절한 피펫팅을 위한 특정 조건으로 레이아웃을 준비하십시오.</li>
	<li>플레이트를 5%CO2와 함께 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 참고: 이 배양 단계에는 CEI 장치 대신 일반 세포 배양기가 사용됩니다. 세포 대조군 (CC) 웰은 비히클-처리된 웰이다.</li>
</ol>6. 바이러스 준비 및 감염
<ol><li>바이러스 스톡이 담긴 바이알을 해동합니다. 이 예에서는 ZIKV MR766 및 ZIKV PRVABC59가 사용됩니다.</li>
	<li>원하는 MOI에서 바이러스 희석액 또는 15mL 폴리프로필렌 튜브의 분석 배지에서 희석액을 준비합니다. 참고: 이 대표적인 예에서는 MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 및 0.00005가 사용됩니다.</li>
	<li>100 μL의 바이러스 희석액을 96 웰 플레이트의 지정된 웰에 추가합니다. 분석 배지를 CC 웰에 추가합니다.</li>
	<li>사용된 바이러스 용기의 오염을 제거합니다.</li>
	<li>플레이트를 CEI 장치에 다시 넣고 실험 재개를 클릭하여 연속 6일 동안 측정을 계속합니다. 참고: 바이러스 대조군(VC) 웰은 비히클 처리된 감염된 세포인 반면, CC 웰에서는 바이러스 희석 대신 분석 배지가 추가됩니다. 화합물의 세포 독성이 평가되는 경우 바이러스 희석 대신 100μL의 분석 버퍼를 추가합니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>마침을 클릭하여 실험을 종료하고 나타나는 창에 특정 실험 조건에 대한 정보와 같은 선택적 요약 설명을 추가합니다. 데이터 수집이 완료되면 확인을 클릭합니다.</li>
	<li>실험이 끝날 때 CC와 VC 간의 가장 큰 임피던스 차이가 측정되는 그래프 창에서 원하는 주파수를 선택합니다.<ol><li>최적의 주파수를 결정하려면 감염되지 않은 세포와 감염된 세포에 대한 파일럿 실험을 실행하고 감염된 세포의 임피던스가 기준선 수준으로 떨어진 시점에서 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 간에 관찰된 임피던스 차이가 가장 큰 빈도를 선택합니다. ZIKV에 감염된 A549 세포의 경우 16kHz입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모든 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보내려면 웰 구성 분할창에서 모든 웰 이 선택되어 있는지 확인하고 파일 | 데이터 내보내기 | 그래프 데이터.</li>
	<li>모든 데이터 포인트에서 실험 종료 시 측정된 평균 VC 임피던스 값을 빼고 이를 감염 전에 측정된 마지막 시점의 평균 CC 임피던스 값으로 나누어 데이터를 정규화합니다.</li>
	<li>정규화된 데이터를 시간 함수로 플로팅하여 CEI 프로파일 그래프를 얻습니다.</li>
	<li>각 조건의 정규화된 곡선 아래 면적(AUCn)을 계산하여 50% 억제 농도(IC50)와 같은 파라미터를 결정합니다.</li>
	<li>예를 들어 다양한 바이러스 균주의 감염성을 비교하기 위해 CIT50과 같은 다른 유용한 매개 변수를 계산합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 확인합니다.

이 기사에서는 ZIKV 항바이러스 연구에서 CEI 분석의 사용에 대해 설명합니다. 이 분석은 실시간 모니터링의 이점이 있으므로 선택적 화합물을 사용한 ZIKV 감염 및 항바이러스 억제의 동역학을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법으로 얻은 데이터를 통해 바이러스 유발 CPE와 잠재적인 항바이러스 화합물의 효능을 객관적이고 시각적으로 관찰할 수 있습니다.
CEI는 매우 민감한 방법이기 때문에 이 세포 분석을 수행할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 가능한 한 피펫팅 변동을 피하기 위해 정밀한 피펫팅을 수행하는 것이 중요합니다. 또한 세포 수 및 사용된 바이러스 스톡과 같이 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 요소는 실험 반복 사이에 일정하게 유지되어야 합니다. 이는 세포 성장 및 감염의 동역학에 큰 영향을 미치므로 계산된 CIT50 값 및/또는 기타 매개변수의 변동으로 이어질 수 있는 요인입니다.
(잠재적) 항 바이러스 화합물의 존재 하에서 CEI 분석을 수행 할 때, 바이러스가없는 상태에서 세포의 임피던스에 영향을 미치는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 기술은 매우 민감하여 임피던스 변화가 화합물의 세포독성 농도보다 훨씬 낮게 측정될 수 있다19.
이 기사에는 ZIKV 데이터만 나와 있지만, 최적의 CEI 모니터링 빈도 결정과 같은 최소한의 최적화 노력만으로 다른 세포병원성(플라비) 바이러스에 분석을 쉽게 적용할 수 있습니다. CEI 분석의 적응은 다양한 인간 및 동물 바이러스, 예컨대 치쿤구니야, 인플루엔자 A, 및 인간 및 말 헤르페스 바이러스25,26,27,28에 사용되었다. 여기서, 바이러스 역가의 정량화 또는 항 바이러스 화합물의 식별을위한 간단한 방법으로도 사용됩니다. 이 연구에서는 대체 CEI 방법인 실시간 세포 분석을 사용했습니다.
CEI 기술의 사용은 부착 세포 유형으로 제한되는데, 이는 분석의 원리가 전극에 내장된 웰 전체에 퍼지는 부착 세포의 특성에 의존하기 때문입니다. 피브로넥틴과 같은 우물 표면 코팅은 세포 부착을 개선하는데 사용될 수 있다29. 이 방법론에는 몇 가지 다른 단점이 있는데, 첫 번째는 비용과 관련이 있습니다. CEI 모니터링 장치와 함께 제공되는 하드 및 소프트웨어에 대한 투자 외에도 소모품도 다소 비쌉니다. 또한, 프로토콜은 며칠 동안 바이러스 감염을 모니터링해야하기 때문에 주당 하나의 96 웰 플레이트를 평가할 수 있습니다. 높은 비용과 함께 이는 처리량이 낮거나 중간 정도인 설정으로 사용을 제한합니다.
이러한 처리량 문제로 인해 이 기술은 항바이러스 스크리닝 설정에 적합하지 않습니다. 그러나 특정 질병 관련 환경에서 ZIKV 감염 연구를 위한 세포 감수성을 평가할 때와 같은 초기 실험 단계에서 매우 매력적입니다. 이 기술은 또한 예를 들어 특정 진입 수용체의 존재 또는 부재 하에서 감염 동역학의 변화를 쉽게 관찰하기 위해 형질주입 또는 녹아웃 세포주에 유용합니다. 이것은 ZIKV 감염에서 세포 인자의 관여를 조사할 때 흥미롭습니다. 또한, 이후 전임상 단계에서 특정 선도 후보가 선택되면 CEI 분석을 사용하여 선택된 화합물의 심층 특성 분석을 수행할 수 있습니다. CEI 바이오센서는 또한 바이러스의 검출을 위해 바이러스-특이적 항체와 같은 특정 생체인식 요소를 고정시킴으로써 변형될 수 있다(18). 전체적으로, 이것은 바이러스학 환경에서 CEI의 다양한 사용을 강조합니다.

지카 바이러스(ZIKV) 발병은 소두증 및 길랭-바레 증후군과 같은 심각한 질병 합병증과 관련이 있다 1,2,3. 모기 매개체 분포 확산 및 도시화 증가와 같은 다양한 위험 요인으로 인해 미래의 전염병이 그럴듯하지만 현재까지 백신이나 항바이러스제가 아직 시장에 출시되지 않았습니다 3,4. 따라서 전통적인 ZIKV 연구 방법은 이 바이러스와 잠재적인 항바이러스 화합물을 연구하기 위한 새로운 도구로 보완되어야 합니다. 항바이러스 연구는 종종 표현형 분석을 기반으로 하며, 여기서 종점은 바이러스 유도 세포변성 효과(CPE)의 출현 또는 리포터 유전자 5,6,7에 의한 특정 바이러스 유도 단백질의 생산과 같은 특정 매개변수의 존재입니다. 그러나 이러한 방법에는 종말점 판독값이 있고 노동 집약적이며 복잡한 분석이 필요할 수 있습니다. 따라서 임피던스 기반 방법은 매력적인 대안을 제공합니다.
셀 기반 전기 임피던스(CEI)는 전극 함유 웰에 시드된 접착 세포층으로 인해 한 전극에서 다른 전극으로의 전류 흐름에 대한 저항으로 정의됩니다. 이 방법론에 사용된 확립된 CEI 기술은 원래 Giaever와 Keese 8,9가 개발한 ECIS(Electric Cell-substrate Impedance Sensing)입니다. 이것은 암 전이, 독성학 및 상처 치유와 같은 광범위한 생물학적 연구 영역에서 사용됩니다10,11,12. 그 원리는 주파수13 범위에 걸쳐 교류(AC) 전압의 연속적인 스위핑에 의해 생성되는 전기장에 의존한다. 세포는 이러한 비침습적 전기장에 노출되고, 미리 결정된 간격으로 세포 성장에 의한 임피던스 변화 또는 세포 부착 또는 형태의 변화를 측정한다14. 또한, 변화된 세포 생존율은 또한 임피던스 변화를 유도하여 이 기술을 세포병원성 바이러스 감염을 모니터링하는 유용한 도구로 만듭니다15,16,17. 세포층의 형태학적 변화가 나노 스케일 범위에서 감지되기 때문에 이 기술은 매우 민감한 검출 도구를 제공합니다. 이 기사에 설명된 CEI 분석은 시간 경과에 따른 세포층의 임피던스 변화를 측정하는 쉽고 비침습적이며 실시간이며 표지가 없는 방법입니다.
CEI는 ZIKV 감염 과정이나 잠재적인 항바이러스제를 평가하는 데 사용되지 않았지만 진단 도구로서의 사용은18세 이전에 조사되었습니다. 최근 연구에서, A549 세포에서 여러 ZIKV 억제제의 항바이러스 활성을 결정하기 위한 CEI 분석의 사용이 처음으로 검증되었다19. 이 방법 기사에서는 이 CEI 분석에 대해 자세히 설명하고 다양한 부착 세포주와 다양한 감염 다중도(MOI)에서 다양한 ZIKV 균주로 확장합니다. 이로써 플라비바이러스 항바이러스 연구에서 이 방법의 다양한 사용이 입증되었습니다. 이 방법은 중요한 감염 시점을 검출하고 잠재적인 항바이러스 화합물에 의한 동적 억제 활성을 가능하게 하는 실시간 세포 모니터링의 중요한 이점을 가지고 있습니다. 종합하면, CEI 기술은 현재의 항바이러스 방법론을 보완하는 강력하고 가치 있는 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>A549 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td>CCL-185</td><td>이 세포는 10% FBS, 2mM L-글루타민, 0.075% 중탄산나트륨이 보충된 MEM Rega-3에서 배양됩니다.</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Live/dead</td></tr><tr><td>stain Cellstar 폴리프로필렌 튜브, 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>1,88,271</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 폴리프로필렌 튜브, 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>2,27,261</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td>U87용 세포 배양 배지 및 HEL 299 세포</td></tr><tr><td>, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS),</td> <td>Gibco, Thermo Fisher Scientific,</td><td>14190-094</td><td></td></tr>, <tr><td>ECIS cultureware, 96W20idf</td>, <td>Applied BioPhysics</td>, <td>96W20idf</td>, <td>CEI 장치용 PET 분석 플레이트</td></tr>, <tr><td>전기 세포 기판 임피던스 감지(ECIS), Z 어레이 스테이션</td>, <td>Applied BioPhysics</td><td></td><td>96 좋은 역, 외부 제어 단위 및 통제, 취득 및 전시 소프트웨어를 가진 휴대용 퍼스널 컴퓨터를 포함하는 CEI 장치. 필요한 소프트웨어는 선적 전에 설치됩니다. 참고: 이 장치는 현재 생산이 중단되었으며 보다 발전된 ECIS Z-Theta 장치인</td></tr><tr><td>Falcon 폴리스티렌 튜브, 5mL</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SV30160.03</td><td>사용된 모든 세포에 대한 세포 배양 배지 첨가제</td></tr><tr><td>HEL 299 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-137</td><td>이 세포는 10% FBS 및 0.01M HEPES가 보충된 DMEM에서 배양됩니다.</td></tr><tr><td>HEPES 완충액, 1 M</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-056</td><td>U87 세포용 세포 배양 배지 첨가제</td></tr><tr><td>Labyrinthopeptin A1</td><td>Roderich S&uuml 교수로부터의 친절한 선물; ssmuth, Technische Universit&auml; t 독일</td><td></td> 베를린 <td>이 프로토콜에서 예시로 사용된 항바이러스 화합물. DMSO에 용해됩니다.</td></tr><tr><td>L-글루타민, 200 mM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>A549 세포용 세포 배양 배지 첨가제</td></tr><tr><td>Luna cell counting slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Luna-FL 이중 형광 세포 계수기</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>세포 생존도 계수기</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>19993013</td><td>A549 세포용 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>중탄산나트륨, 7.5%</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-060</td><td>A549 세포용 세포 배양 배지 첨가제</td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 T75</td><td>TPP</td><td>Y9076</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>해리 시약</td></tr><tr><td>U87 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td>이 세포는 10% FBS 및 0.01 M HEPES가 보충된 DMEM에서 배양됩니다.</td></tr><tr><td>&nbsp; Virkon Rely+On 정제</td><td>Lanxess</td><td>115-0020</td><td>소독제 용해성</td></tr><tr><td>지카 바이러스(ZIKV) MR766</td><td>ATCC</td><td>VR-84</td><td>ZIKV 프로토타입 균주, 1968년 우간다의 sentinel Rhesus 원숭이에서 분리</td></tr><tr><td>ZIKV PRVABC59</td><td>ATCC</td><td>VR-1843</td><td>2015년 푸에르토리코의 환자에서 분리된 ZIKV 균주</td></tr></tbody></table>

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

Cell-Based Electrical Impedance Platform to Evaluate Zika Virus Inhibitors in Real Time

세포 기반 전기 임피던스(CEI) 기술은 전극이 내장된 배양 플레이트 웰에서 부착 세포 단층이 성장하거나 조작되어 발생하는 임피던스 변화를 측정합니다. 이 기술은 지카 바이러스(ZIKV) 감염 및 부착 세포 복제의 결과를 실시간으로 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨이나 침습적 방법을 사용할 필요가 없고 실시간 데이터를 제공하는 이점이 있는 간단한 분석입니다. ZIKV 감염의 동역학은 사용된 세포주, 바이러스 균주 및 감염 다중도(MOI)에 크게 의존하며, 이는 기존의 종말점 분석으로는 쉽게 연구할 수 없습니다. 또한, CEI 분석은 항바이러스 화합물의 평가 및 특성화에도 사용할 수 있으며, 이는 또한 감염 과정에서 동적 억제 특성을 가질 수 있습니다. 이 방법 기사는 CEI 분석의 실제 실행과 ZIKV 연구 및 일반적으로 항바이러스 연구에서의 잠재적 응용에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

이 기사에서는 ZIKV 연구에서 CEI 분석의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 이 분석의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 우리는 원하는 세포 유형에서 ZIKV 감염의 실시간 모니터링과 항바이러스 화합물에 의한 감염 억제 평가의 편리함을 입증합니다. 항바이러스제로서, 우리는 잘 기술된 펩티드 라비린토펩틴 A1(Laby A1); 우리는 이것을 '화합물'이라고 부르는데, 그 구체적인 특성이 이 방법 기사의 범위를 벗어나고 다른 곳에서 논의되기 때문입니다20,21. 참고로, 이 방법의 재현성은 결과 섹션에서 논의되지 않는데, 이는 방법론을 사용하여 얻은 개별 임피던스 프로파일에 초점을 맞추기를 원하기 때문입니다. 그러나, 이것은 이전에19에서 설명되었다.
첫 번째 실험 세트에서 우리는 CEI 감염 분석을 수행할 때 세포 밀도 최적화의 중요성을 보여줍니다(그림 2). 너무 많은 세포가 시드되면 세포 단층이 완전히 성장하여 CEI 전극을 가로질러 더 이상 퍼질 수 없습니다. 이로 인해 CC와 VC의 차이가 작아지고 분해능이 낮아져 항바이러스 활성의 검출 창이 줄어듭니다. 이는 도 2E에 잘 예시되어 있다. U87 세포와 같은 특정 대형 세포 유형의 경우, 세포가 너무 조밀하게 파종되면 플레이트를 조작할 때 세포 단층이 완전히 분리될 수도 있습니다(그림 2F). 이것은 또한 현미경으로 관찰됩니다.
그림 2는 또한 분석이 세포 감수성 연구를 수행하는 데 매우 유용하다는 것을 보여줍니다. 그림 2A, B 에서 감염 동역학은 세포 유형에 크게 의존한다는 것이 분명합니다. 도 2C 는 U87 세포가 높은 MOI에서만 ZIKV 감염에 민감하다는 것을 보여준다.
두 번째 실험 세트에서는 다양한 MOI와 잘 설명된 항바이러스 화합물의 존재 하에서 다양한 ZIKV 균주를 사용하여 CEI 감염 분석의 다양한 사용이 강조됩니다(그림 3). 이러한 실험은 플라비바이러스 연구에서 일반적으로 사용되는 모델인 A549 세포로 수행됩니다22,23. 이 세포주는 CEI 분석에서 그 적합성을 입증한 다른 연구에서도 사용되었다24. 먼저, 아프리카 계통의 대표적인 ZIKV 계통인 MR766에 의한 감염 동역학을 아시아 계통 PRVABC59의 것과 비교한다. 그림 3A는 두 균주가 비슷한 CEI 패턴을 가지며 PRVABC59는 약간 느린 CPE 유도 특성을 가지고 있음을 보여줍니다. 이는 CIT50 값에도 반영됩니다(그림 3B). 이 흥미로운 매개변수는 Fang et al.16에 의해 처음 도입되었으며 CEI 측정의 동역학을 고려합니다. 셀 제어와 비교하여 임피던스를 50% 줄이는 데 필요한 시간으로 정의됩니다.
다음으로, 세포를 다양한 화합물 농도의 존재 또는 부재 하에 ZIKV MR766 또는 PRVABC59의 3개의 상이한 MOI로 감염시키고, 임피던스 프로파일을 모니터링하였다. 도 3C-H로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 특정 화합물 농도는 ZIKV 감염에 의해 야기된 임피던스 강하를 억제하거나 지연시킨다. 이는 AUC 값을 계산할 때도 반영됩니다. CEI 분석 결과는 또한 항바이러스 활성이 MOI 및 효능 평가 시점에 의존한다는 것을 시각적으로 입증합니다. AUCn 계산은 도 3I에 예시된 바와 같이,IC50 값을 결정하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 그림 3H는 CIT50 값을 사용하여 화합물 효능을 측정하고 비교할 수도 있음을 보여줍니다. 비활성 화합물 또는 화합물 농도는 VC의 그것들과 비슷한 CEI 프로파일, AUC, 및CIT50 값에 의해 특성화된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig01.jpg"> 그림 1: 분석 워크플로의 개략도. CEI 분석의 타임라인과 다양한 취급 및 배양 단계가 여기에 설명되어 있습니다. 약어: CEI = 셀 기반 전기 임피던스; ZIKV = 지카 바이러스; D = 일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig02.jpg"> 그림 2: 다양한 밀도에서 ZIKV 감염 세포의 정규화된 CEI 프로파일. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 또는 (C,F) U87 세포를 96웰 CEI 플레이트에서 웰당 (A-C) 15,000-20,000("최적") 또는 (D-F) 75,000("준최적") 세포에 시딩했습니다. 임피던스 모니터링의 24시간 후, 세포를 ZIKV MR766의 10배 MOI 희석액으로 감염시켰다. 임피던스는 연속 5일 동안 추가로 모니터링되었습니다. 대표적인 실험의 CEI 프로파일(두 기술 반복실험의 평균 ± 범위)이 표시됩니다. 약어: CEI = 셀 기반 전기 임피던스; MOI = 감염의 다중성; ZIKV = 지카 바이러스; Norm = 정규화됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65149/65149fig03.jpg"> 그림 3: 두 개의 ZIKV 균주에 감염되고 항바이러스 화합물에 의한 억제 후 A549 세포의 정규화된 CEI 프로파일. (A) 부착성 A549 세포는 ZIKV MR766 또는 ZIKV PRVABC59의 다양한 MOI에 감염되었고, 임피던스는 지속적으로 모니터링되었다. 대표적인 실험의 세 가지 기술 반복실험의 평균 ± SD가 표시됩니다. (B)CIT50 값은 A의 CEI 프로파일을 기반으로 계산하여 비교하였다. 수행된 세 번의 기술 반복실험의 평균 ± SD가 표시됩니다. (C-H) 부착성 A549 세포를 다양한 화합물 농도로 처리한 후 ZIKV MR766(C-E) 또는 ZIKV PRVABC59(F-H)의 특정 MOI로 감염시켰습니다. 임피던스는 지속적으로 모니터링되었습니다. 대표적인 실험의 두 기술 반복실험의 평균 ± 범위가 표시됩니다. (i) 상이한 ZIKV 균주 및 희석액에 대한 화합물 억제를 비교하기 위해, AUCn을 계산하고, 모든 조건을 CC AUCn으로 빼고 VCAUCn으로 나눔으로써 억제 백분율을 결정하였다. (J) C-H(C-H)에 제시된 실험 의CIT50 값을 계산하여 상이한 ZIKV 균주와 MOI를 비교하였다. 두 기술 반복실험의 평균 ± 범위가 표시됩니다. 약어: CEI = 셀 기반 전기 임피던스; MOI = 감염의 다중성; ZIKV = 지카 바이러스; Norm = 정규화됨; CIT 50 = 처리되지 않은 대조군에 비해 임피던스가50% 감소한 시간; AUC = 곡선 아래 면적; CC = 세포 제어; VC = 바이러스 제어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65149/65149fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 인간 세포에서 지카 바이러스 감염 및 복제를 실시간으로 연구하는 매우 쉽고 간단한 방법으로 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, CEI 분석은 항 바이러스 화합물의 평가에 유용합니다.

Cell-based electrical impedance (CEI)&#160;technology measures changes in impedance caused by a growing or manipulated adherent cell monolayer on culture ...

바이러스 감염은 매우 역동적이며 바이러스학의 전통적인 종점 분석은 선택한 종말점이 정보를 놓칠 수 있다는 한계가 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 세포 기반 전기 임피던스를 사용하여 바이러스 감염 및 항 바이러스 화합물의 활성을 실시간으로 추적 할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 실험실 기술자 인 Eef Meyen이 될 것입니다.시작하려면 interdigitated 전극 기반 96웰 플레이트를 사용하여 CEI 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 성장 배양 배지를 추가하고 웰 사이의 공간을 DPBS로 채웁니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 배양합니다.A549 세포를 시드하려면 원고에 설명된 대로 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 신선한 성장 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 생존 가능한 세포를 세고 신선한 성장 배지에 희석하여 원하는 세포 밀도를 얻습니다.배양 후, 96 웰 플레이트로부터 다채널 피펫으로 성장 배양 배지를 제거한다. 웰 당 100 마이크로 리터의 세포 현탁액을 분주하십시오. 세포가 평형을 이루면 플레이트를 CEI 장치에 넣어 CEI 분석을 설정하고 수행합니다.기기의 소프트웨어를 열고 데이터 수집 패널에서 설정을 클릭하여 새 실험을 설정합니다. 랩톱을 ECIS 장치에 연결합니다. 녹색으로 표시된 웰의 임피던스를 확인하여 플레이트를 구성합니다.Well Configuration 창에서 사용된 cultureware에 따라 배열 유형을 선택하고 Multiple Frequency time mode를 클릭합니다. 그런 다음 시작을 눌러 측정을 시작합니다. 화합물을 얼음 위에 보관하십시오.5밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 평형 분석 배지로 10배 농축 희석한 다음 화합물을 추가합니다. 데이터 콜렉션 설정 분할창에서 일시정지를 클릭하고 현재 시점을 완료한 후 96웰 플레이트를 꺼냅니다. 광학 현미경으로 세포의 부착 및 단층 형성을 관찰합니다.다음에, 다채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 20 마이크로리터의 배지를 흡인하고, 원하는 웰에 20 마이크로리터의 화합물 용액 또는 비히클을 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 15분 동안 배양합니다. 바이러스 용액을 준비하려면 바이러스 스톡이 담긴 바이알을 해동합니다.15밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 분석 배지로 원하는 MOI로 희석한 후 바이러스 스톡을 추가합니다. 할당된 웰에 바이러스 희석액이 추가되면 100마이크로리터의 분석 배지를 세포 대조군 웰에 추가합니다. 그런 다음 사용된 바이러스 용기의 오염을 제거합니다.플레이트를 CEI 장치에 다시 놓고 재개를 클릭하여 연속 6일 동안 측정을 계속합니다. 데이터를 분석하려면 마침을 클릭하여 실험을 종료하고 실험 요약 입력을 추가합니다. 데이터 수집이 완료되면 확인을 선택합니다. 그래프 창에서 원하는 주파수를 선택합니다.Well Configuration(웰 구성) 창에서 모든 웰이 선택되어 있는지 확인하고 File(파일), Export Data(데이터 내보내기), Graph Data(그래프 데이터)를 차례로 클릭하여 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보냅니다. CEI 분석은 감염 동역학이 세포 유형에 크게 의존하고 U87 세포가 높은 MOI에서만 지카 바이러스 감염에 취약하다는 것을 보여주었습니다. CEI 분석은 또한 높은 세포 파종에서 완전히 성장한 세포 단층을 입증했으며 CEI 전극 전체에 더 이상 퍼질 수 없어 세포 제어와 바이러스 제어 사이에 약간의 차이가 있습니다.더 큰 세포 유형인 U87의 경우 세포를 너무 조밀하게 파종하면 세포 단층이 완전히 분리될 수 있습니다. 아시아 계통 PRVABC59에서 아프리카 MR766의 대표적인 지카 바이러스 균주는 유사한 CEI 패턴을 나타내었다. 그러나 PRVABC59는 약간 느린 세포 변성 효과 유도 특성을 가지며 CIT50 값에도 반영됩니다.두 지카 바이러스 균주의 세 가지 다른 MOI의 임피던스 프로파일은 특정 화합물 농도가 지카 바이러스 감염으로 인한 임피던스 강하를 지연시킨다는 것을 입증했습니다. CEI 분석은 항바이러스 활성이 MOI 및 AUCN 계산에 따라 결정된 IC50 값에 의존적이라는 것을 밝혀냈습니다. 평가된 CIT50 값은 세포 성장 및 감염의 동역학에서 복합 효능을 입증했습니다.CEI는 지카 바이러스 복제에 대한 화합물을 실시간, 무표지 및 비침습적 방식으로 평가하고 특성화하는 강력한 기술입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 세포 임피던스 분석을 통해 부착 세포의 증식을 포함한 세포 이벤트를 실시간으로 모니터링하는 과정을 보여줍니다. 여기서 접착 셀은 절연체 역할을 하여 전극 사이의 전류 흐름을 제한하고 임피던스를 증가시킵니다.

세포 과정을 실시간으로 모니터링하기 위한 세포 임피던스 기반 분석

이 비디오는 세포요법 효과를 유도하는 바이러스의 생존 역학을 연구하기 위한 세포 임피던스 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 식염수로 전처리된 바이러스에 감염된 부착 세포의 전기 임피던스를 측정합니다.

바이러스 생존을 평가하기 위한 세포 임피던스 기반 생존 역학 분석

이 비디오는 인간 병원체인 지카 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 숙주 세포 내에서 지카 바이러스는 내재화 시 증식을 거쳐 주변 세포를 감염시키고 뚜렷한 영역 또는 바이러스 플라크를 생성합니다. 항바이러스제 역할을 하는 I형 인터페론은 바이러스 증식을 방해하여 숙주 세포 단층에서 바이러스 플라크의 형성을 방지합니다.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

이 작품에서, 우리는 높은 처리량 선별 형식으로 Zika 바이러스 복제의 억제제를 선별하기 위하여 보충 기지를 둔 바이러스성 효소 기지를 둔 분석에서 이용된 프로토콜을 기술합니다.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

현재 연구는 실시간 세포 분석(RTCA) 시스템을 사용하여 바이러스 감염 중 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

임피던스 기반 실시간 세포 분석을 이용한 바이러스 감염 시 인간 제대 정맥 내피 세포의 변화 모니터링

여기서 보고된 TCID50 분석법은 라벨 없는 실시간 임피던스 측정과 시스템의 바이러스학 모듈을 활용하여 바이러스 유발 세포병리 효과(CPE)를 실시간으로 객관적으로 모니터링합니다. 이 간소화된 분석법은 직접 손을 대고 작업하는 시간을 크게 줄이면서 고처리량의 정량적 동역학 CPE 측정을 지원하고 자동화된 실시간 TCID50 계산을 가능하게 합니다.

임피던스를 이용한 자동화된 바이러스 역가 정량을 위한 간소화되고 라벨이 없는 실시간 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50) 분석법

학습하세요 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 활용하여 지카 바이러스 감염과 항바이러스제 효능을 실시간으로 평가하는 방법을. A549 세포에서 바이러스 감염 동역학을 비침습적으로 분석하고 IC50 값을 산출하여 항바이러스 화합물의 효과를 정량적으로 검증할 수 있습니다.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

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