Name: 인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 배우세요 인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포를 분리하고 배양하는 최적화된 방법을. 이 프로토콜은 켈로이드 연구를 위한 순수하고 활력 있는 섬유아세포를 안정적으로 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81903189 및 82073418)과 광저우 과학 기술 재단 (보조금 번호 202102020025)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 Southern Medical University(2020081)의 Dermatology Hospital의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 개인으로부터 조직을 수집하기 전에 정보에 입각한 환자 동의를 얻었습니다.
1. 준비
알림: 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛 아래의 무균 환경에서 수행해야 합니다.
<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액(PSA)을 고혈당 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에 첨가하여 완전한 배양 배지를 준비합니다.</li>
	<li>1x PBS에 1% PSA를 첨가하여 PSA로 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 1x PBS에 1% FBS를 추가하여 FBS로 PBS를 준비합니다.</li>
	<li>고압 증기 멸균으로 멸균 된 가위, 집게 및 메스를 여러 개 준비하십시오.</li>
</ol>2. 제거된 조직 얻기
<ol><li>수술을 통해 켈로이드 환자로부터 조직을 얻습니다. 멸균 포장 백 또는 멸균 원심 분리기 튜브에 신선한 켈로이드 조직을 수집하고 가능한 한 빨리 실험실의 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 참고: 이 프로토콜에서 획득한 켈로이드 조직의 크기는 약 ~20 x 20 x 10mm3이며 크기는 수술에 따라 다를 수 있습니다.</li>
</ol>3. 격리
<ol><li>멸균 핀셋을 사용하여 켈로이드 조직을 꺼내 1% PSA가 함유된 PBS 10-25mL가 들어 있는 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 10분 동안 넣습니다. 그런 다음 6-웰 플레이트를 준비하고 1% PSA가 보충된 PBS 4mL를 각 웰에 추가합니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 티슈를 꺼내고 1 % PSA가 보충 된 PBS로 두 번 씻으십시오. 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.</li>
	<li>수술용 가위나 수술용 메스를 사용하여 지방층과 표피층을 제거하고 진피층은 그대로 둡니다. 진피층을 가위로 3-5mm2 개로 다듬고 해부한 후 멸균 집게를 사용하여 이 조각을 다음 우물로 옮기고 PBS에서 1% PSA 용액으로 다시 세척합니다.</li>
</ol>4. 문화
<ol><li>멸균 된 집게를 사용하여 페트리 접시에 진피 조직 조각을 놓습니다. 조각 수가 10에서 30 사이이고 각 조각 사이의 거리가 >5mm인지 확인하십시오. 페트리 접시를 5 ° C의 2 %CO2 인큐베이터에 37-30 분 동안 거꾸로 놓고 조직 조각이 약간 마르고 페트리 접시에 달라 붙을 때까지 놓습니다. 이어서, 10% FBS 및 1% PSA로 보충된 DMEM을 첨가하고, 페트리 접시를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 조심스럽게 넣는다. 참고: 섬유아세포는 형태학적으로나 기능적으로 이질적인 세포 집단입니다. 이러한 복잡성을 고려하여 분리 및 배양 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 켈로이드 진피 조직 조각을 고르게 선택하고 이 조각을 잘 섞은 후 페트리 접시에 넣습니다.</li>
	<li>3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 2-3 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 매일 40x 배율로 현미경으로 섬유아세포를 관찰합니다. 알림: 모든 단계는 부드럽게 수행해야 합니다. 티슈 조각이 페트리 접시에 달라붙는 데 시간이 걸리므로 분리 후 2일 동안은 페트리 접시를 움직이지 마십시오.</li>
	<li>조직 조각 주위에서 자라는 섬유아세포가 대략 90% 밀도에 도달하면, 조직 조각 및 배양 배지를 제거한다. 멸균 1x PBS로 섬유아세포를 세척하고 멸균 1x 트립신-EDTA 용액 2mL를 플레이트에 추가합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 약 ~3-5분 동안 세포를 배양합니다. 배양 접시를 가볍게 두드리고 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 플레이트에서 분리되면 2mL의 완전 배지를 추가하여 소화 과정을 종료합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 실온에서 3분 동안 300× g 에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁합니다. 섬유아세포를 9 cm 세포 배양 접시에 시딩하고, 가습된 5%CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다.</li>
</ol>5. 유지 및 보존
<ol><li>약 3-4일 후, 섬유아세포가 80% 밀도로 성장하면 4.2-4.4단계를 반복하고 섬유아세포를 1:3의 비율로 계대시킵니다. 추가 실험을 위해 계대배양된 섬유아세포를 사용하십시오. 참고: 섬유아세포 배양은 세포가 원래 세포에 비해 변화된 특성을 보이기 시작할 수 있으므로 10 계대 후에 중단해야 합니다.</li>
	<li>추가 사용을 위해 P1-P3의 계대배양 세포를 액체 질소에 냉동 보존합니다.<ol><li>4.2-4.3단계를 반복합니다. 세포 현탁액을 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 300 × g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 90% FBS와 10% DMSO를 함유한 세포 동결 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 세포 극저온 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>세포를 냉동 상자로 옮긴 다음 냉동 상자를 -80°C 냉동고에 넣습니다. 1 일 후, 장기 보존을 위해 세포를 액체 질소로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 면역형광염색에 의한 섬유아세포 동정
<ol><li>둥근 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 계대배양된 섬유아세포를 1 ×10 4 세포/웰의 농도로 배양합니다. 섬유아세포가 60% 밀도에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. 4% 파라포름알데히드 1mL를 넣어 섬유아세포를 실온에서 20분간 고정시킨 후 PBS로 매번 1분간 3회 세척한다. 알림: 현미경 또는 자동 세포 계수기에서 혈구계 슬라이드를 사용하여 세포 수를 계산합니다.</li>
	<li>PBS를 제거하고, 세포막의 투과화를 위해 0.5% Triton X-100과 함께 20분 동안 배양한 다음, 매번 PBS로 1분 동안 3x 세척하였다. PBS에 0.5% 소 혈청 알부민을 넣고 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 제거하고 항체 희석액에 희석한 PDGFR-α/vimentin 항체를 1:1,000으로 첨가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음날, 1차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3분 동안 3x 세척하고, 항체 희석제로 희석한 2차 항체 Alexa Fluor-555 염소 항-토끼 IgG를 1:200에서 1시간 동안 담가두었다.</li>
	<li>2차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3x 세척하였다. 집게를 사용하여 둥근 커버슬립을 꺼내 유리 슬라이드에 놓고 5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액 50μL를 추가하여 세포핵을 염색합니다. 샘플을 젖은 어두운 상자에 보관하고 레이저 컨포칼 형광 현미경으로 관찰합니다. 참고: 1차 항체는 없지만 2차 항체가 있는 음성 대조군을 추가하여 비특이적 염색을 배제합니다.</li>
</ol>7. 유세포 분석에 의한 섬유아세포 동정
<ol><li>세포 펠릿을 1.5mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집하고 1% FBS가 포함된 PBS 50μL로 재현탁합니다. 암실에서 30분 동안 항-CD90과 함께 배양하고 항-IgG 이소타입 대조군을 대조군에 추가합니다. 이어서, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가하고, 튜브를 4°C에서 300 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 제거하고, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가한다. 현탁액을 다시 중단하고 셀 스트레이너(70메쉬)를 통해 여과합니다. 여과액에 1:100의 DAPI 원액 5μg/mL를 첨가한 후 유세포 분석으로 결과를 얻습니다. 전방 산란(FSC)을 가로축으로, 측면 산란(SSC)을 세로좌표로 설정하고 주 세포 집단에 원을 그립니다. 세포 집단을 선택하고 분석을 위해 phycoerythrin을 가로좌표로 설정하고 count를 세로좌표로 설정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
<li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keloid+disorder%3A+Genetic+basis%2C+gene+expression+profiles%2C+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).</li>
<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
<li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring%3A+Human+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li>
<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
<li>Künzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+explants+culture+method%3A+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

선언할 이해 상충이 없습니다.

켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 얻는 것은 추가 연구를 위한 중요한 기초입니다. 지금까지, 일차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있었다: 효소 소화 및 체외이식편 배양11,12,13,14. 그러나 두 가지 전통적인 방법 모두 오염에 대한 민감성, 다른 유형의 세포와의 혼합, 긴 배양 기간 및 낮은 성공률과 같은 한계가 있습니다15,16. 이 연구는 최적화된 방법을 설명하고 이러한 기존 문제를 해결하고 켈로이드 섬유아세포의 분리 및 배양에 대한 성공 가능성을 높이기 위한 명확한 지침을 제공했습니다.
미생물 오염의 가능성은 일차 섬유아세포를 얻...

섬유증식성 질환인 켈로이드는 플라크가 지속적으로 증식하여 자가제한 없이 정상 피부 주변을 침범하는 경우가 많으며, 환자에게 다양한 정도의 가려움증, 통증, 미용적, 심리적 부담을 유발한다1. 켈로이드에 관여하는 일차 세포인 섬유아세포는 과도한 증식, 중복 세포외 기질 생성, 무질서한 콜라겐을 통해 이 질병의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다 2,3. 그러나 근본적인 발병기전은 아직 불분명하며 켈로이드에 대한 효과적인 치료 방법은 여전히 부족합니다. 따라서 추가 연구가 시급히 필요합니다 4,5.
생체 내 켈로이드 연구를 위한 이상적인 동물 모델이 없기 때문에 6,7, 켈로이드 조직에서 1차 섬유아세포를 획득하여 시험관 내 모델을 구축하면 켈로이드 연구 2,6에 대한 타당성과 신뢰성을 제공할 수 있습니다. 일차 세포는 살아있는 조직에서 직접 유래한 세포이며, 이러한 세포는 세포주와 비교하여 여러 개체의 생리적 상태 및 유전적 배경과 더 유사할 수 있다는 것이 일반적으로 인식되고 있다 8,9. 일차 세포 배양은 세포의 성장과 대사뿐만 아니라 다른 세포 표현형을 연구하는 강력한 수단을 제공합니다.
현재, 1차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있다: 효소 소화 및 체외이식편 배양. 그러나, 다양한 박테리아 또는 곰팡이에 의한 오염의 위험성 , 쉽게 제거되지 않는 다른 유형의 세포와의 혼합, 배양 주기의 긴 기간, 원래 세포와 비교하여 세포 특성의 후속 변화 등과 같은 일차 섬유아세포를 얻는 데 몇 가지 장애물이 확인되었습니다9. 따라서 1차 섬유아세포를 얻기 위한 실현 가능하고 효과적인 공정을 개발하는 것이 추가 연구 및 적용을 위한 기초입니다. 이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 추출하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% 폴리포름알데히드</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>세포 고정</td></tr><tr><td>50 mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>켈로이드 조직 넣</td></tr>기 <tr><td>Alexa Fluor-555 염소 안티-토끼 IgG&nbsp;</td><td>앱캠</td><td>알렉사&nbsp; 형광&nbsp; 555년&nbsp;</td><td>Immunofluorescence Staining Assay를 위한 두 번째 항체</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>섬유아세포의 순도를 식별합니다.</td></tr> 항체 <tr><td>희석제</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전 캐비닛&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 시리즈 A2</td><td>세포 분리 및 배양 세포</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>알라딘</td><td>B265993</td><td>면역형광 염색 분석을 위한 차단</td></tr><tr><td>이산화탄소 인큐베이터</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>세포 배양에 사용</td></tr><tr><td>세포 극저관</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>저온</td></tr><tr><td>원심 기계에</td> 세포 보관 <td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>폐기 상등액&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>염색 세포 핵</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>세포 보존에 사용</td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지</td><td>Gibco C11995500BT</td><td></td><td>배양 배지 용액</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD</td><td>FACSCelesta</td><td>관찰 세포</td></tr><tr><td>냉동 상자의</td> 정체 <td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>레이저 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>면역 형광 염색 분석</td></tr><tr><td>관찰 PDGFR-&알파; 항체</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>면역 형광 염색 분석을 위한 첫 번째 항체</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-암 용액</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>오염 방지를 위해 배양 배지 용액 추가</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>배양 섬유아세포,</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 용액</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>배양 배지 용액</td></tr><tr><td>토끼(DAIE) mAB, IgG XR(R), 아이소튜지 제어(PE)</td><td>세포 신호 전달 기술</td>: <td>5742S</td><td>유세포 분석을 위한 제어 물질,</td></tr><tr><td>원형 커버슬립</td>, <td>Biosharp</td><td>801007</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>세포막의 펀치 홀</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>세포 통과에 사용</td></tr><tr><td>Vimentin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>면역형광 염색 분석을 위한 첫 번째 항체</td></tr></tbody></table>

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

켈로이드 조직의 주요 세포 유형인 섬유아세포는 켈로이드의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다. 켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드의 생물학적 기능 및 분자 메커니즘에 대한 추가 연구와 이를 치료하기 위한 새로운 치료 전략의 기초입니다. 1차 섬유아세포를 얻는 전통적인 방법은 열악한 세포 상태, 다른 유형의 세포와의 혼합 및 오염에 대한 감수성과 같은 한계가 있습니다. 이 논문은 섬유아세포를 얻을 때 발생할 수 있는 문제의 발생을 줄일 수 있는 최적화되고 쉽게 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서 섬유아세포는 분리 후 5일 후에 관찰할 수 있으며 배양 10일 후에 거의 80% 밀도에 도달할 수 있습니다. 이어서, 면역형광 분석을 위한 PDGFRα 및 비멘틴 항체 및 유세포 분석을 위한 CD90 항체를 사용하여 섬유아세포를 계대배양하고 검증한다. 결론적으로, 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 얻을 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

프로토콜의 타임라인은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 격리 프로세스의 일부 대표 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 표피층과 지방층을 조심스럽게 제거하고, 진피층을 3-4mm2의 작은 조각으로 분리하여 페트리 접시에 접종하였다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 조직 조각의 여러 섬유아세포 성장을 처리 5일 후에 현미경으로 관찰하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포는 높은 증식 속도를 나타내었고, 10일 후에 높은 수준의 밀도에 도달하였다. 이 섬유아세포는 길쭉한 방추형 세포체를 가지고 있었고 높은 수준의 밀도에 도달했을 때 다발로 정렬되었습니다. 이 프로토콜에 따라, 섬유아세포를 계대배양하고, 2-3주 이내에 원하는 양으로 확장시켰다...

이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드에 대한 추가 연구의 기초입니다. 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 획득할 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 1% PSA가 보충된 PBS 10-25밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 멸균 원심분리기 튜브에 켈로이드 조직을 넣는 것으로 시작합니다.한편, 4 밀리리터의 PBS PSA 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 이제 튜브에서 티슈를 꺼내고 PBS PSA 용액으로 두 번 씻으십시오. 한 쌍의 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.그런 다음 수술 용 가위로 지방층과 표피층을 제거하고 진피는 그대로 둡니다. 가위를 사용하여 손질 된 진피를 3-5 평방 밀리미터 조각으로 해부하고 한 쌍의 멸균 집게로 조각을 다음 우물로 옮깁니다. PBS PSA 용액으로 조각을 씻으십시오.멸균 된 집게를 사용하여 10-30 개의 진피 조직 조각을 페트리 접시에 5mm 미만의 간격으로 놓습니다. 조각이 마를 때까지 인큐베이터에 접시를 거꾸로 놓고 접시에 붙입니다. 다음으로, 10% FBS 및 1% PSA가 보충된 7밀리리터의 DMEM을 첨가하고, 이전과 같이 접시를 배양한다.3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 섬유아세포를 매일 40X 현미경 배율로 관찰합니다. 섬유아세포가 90% 밀도에 도달하면 배양 배지에서 조직 조각을 제거합니다.섬유아세포를 PBS로 세척하고 멸균 트립신 EDTA 용액 2밀리리터를 첨가한다. 가습 인큐베이터에서 세포를 배양한 후 배양 접시를 가볍게 두드려 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 분리되면 소화를 끝내기 위해 2 밀리리터의 완전한 배지를 추가하십시오.이제 세포 현탁액을 15 밀리리터 멸균 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 300G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁하십시오. 섬유아세포를 9cm 세포 배양 접시에 파종하고 가습 인큐베이터에서 배양합니다.둥근 커버슬립에서 섬유아세포를 배양하고 1차 및 2차 항체에서 배양한 후 면역형광 분석을 수행하려면 유리 슬라이드에 50마이크로리터의 DAPI 용액을 추가하여 세포핵을 염색합니다. 집게를 사용하여 세척 된 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 마지

isolation-culture-characterization-primary-dermal-fibroblasts-from

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

인간의 피부 펀치 생검에서 섬유 아세포의 절편 배양 프로토콜은 낮은 통로 번호로 만 15-20 세포 은행을위한 4-8 주 이내에 피부 세포를 유도하기 위해 기술적으로 강력하고 간단한 방법입니다.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

이 동영상은 인간 진피 조직에서 슈반 세포를 분리하고 배양하는 프로토콜을 보여줍니다. 인간의 진피에는 섬유아세포(fibroblast)와 슈반(Schwann) 세포 등 다양한 유형의 세포가 포함되어 있습니다. 분리 후, 세포는 증식하는 섬유아세포를 제거하기 위해 항유사분열제로 처리되어 슈반 세포의 순수한 배양이 이루어집니다.

Isolation and Culture of Primary Schwann cells from a Human Dermis(인간 진피로부터 일차 슈반세포의 분리 및 배양)

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

이 논문은 원발성, 환자 특이적 인간 대동맥 평활근 세포 및 진피 섬유아세포의 분리 및 배양을 위한 explant 배양 기반 방법을 기술한다. 또한, 세포 수축 및 후속 분석을 측정하기위한 새로운 방법이 제시되며, 이는 이들 세포의 환자 별 차이를 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

일차 환자 특이적 대동맥 평활근 세포 및 체외에서 반정량적 실시간 수축 측정의 분리

근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

배우세요 인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포를 분리하고 배양하는 최적화된 방법을. 이 프로토콜은 켈로이드 연구를 위한 순수하고 활력 있는 섬유아세포를 안정적으로 제공합니다.

인간 켈로이드 조직에서 일차 진피 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

더 많은 동영상 탐색