Name: 인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 SHAPE 복합체를 활용한 임베디드 3D 프린팅으로 인간 신경 줄기세포를 정밀하게 패턴화하는 방법을. 이 기술은 퇴행성 신경질환에서 신경 발달 및 소통을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 주로 Marie Skłodowska-Curie 초기 교육 네트워크 및 보조금 계약 번호 676408에 따라 BrainMatTrain European Union Horizon 2020 프로그램(No. H2020-MSCA-ITN-2015)에서 자금을 지원받았습니다. C.R.과 J.U.L.은 룬드벡 재단(R250-2017-1425)과 덴마크 독립 연구 기금(8048-00050)의 지원에 감사드립니다. OpenMIND를 101047177 HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 프로젝트에 대한 자금 지원에 감사드립니다.

1. 완충액 및 시약의 제조
<ol><li>30mM 포도당, 5μM HEPES, 0.5% w/v 지질이 풍부한 소 혈청 알부민, 40μM L-알라닌, 40μM L-아스파라긴 일수화물, 40μM L-아스파라긴산, 40μM L-글루탐산, 40μM L-프롤린, 1% N2 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 각각 20ng/L. LAF(층류 공기 흐름) 벤치에서 다음 단계를 수행합니다.</li>
	<li>60°C에서 4시간 동안 격렬하게 교반하여 초순수에 1% w/v 알긴산염 용액을 준비합니다. LAF 벤치에서 0.45μm 기공 크기 필터로 용해된 고온 알지네이트 용액을 멸균 필터합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 알림: 알긴산 용액의 온도가 60°C 미만이면 필터를 통과할 수 없습니다.</li>
	<li>초순수에서 37g/L NaHCO3 용액을 준비합니다. NaOH를 사용하여 용액의 pH를 9.5로 조정하고 LAF 벤치에서 필터 멸균합니다. 용액을 4°C에서 보관한다.</li>
</ol>2. SHAPE 복합 재료 준비
<ol><li>알지네이트 미립자 생성<ol><li>멸균 비커의 초순수에 2mg/mLCaCO3 용액을 준비합니다. 알긴산 용액과 1:1로 혼합하고 마그네틱 교반기를 사용하여 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>아세트산을 1:500 비율로 첨가하고 650rpm에서 밤새 저어줍니다. 알림: 알긴산 용액은 즉시 겔화를 시작합니다. 성형 젤의 최적이고 균일한 교반을 보장하기 위해 사용된 유리 제품의 직경과 동일한 길이의 교반 자석을 사용해야 합니다. 다음날, 겔화 동안 교반을 통해 생성된 용액은 점성이 나타날 것입니다(그림 2A).</li>
		<li>겔화된 알지네이트 용액을 LAF 벤치에 놓인 균질화기로 15,000rpm에서 10분 동안 균질화하여 미립자로 기계적으로 단편화합니다(그림 2B).</li>
		<li>실온에서 18,500× g 의 속도로 20분 동안 미립자를 원심분리합니다(그림 2C).</li>
		<li>LAF 벤치 내부의 상층액을 조심스럽게 버리고 2mM NaOH 및 1% P/S를 포함하는 DMEM에 입자를 재현탁하고 4°C에서 밤새 배양합니다(그림 2D). 알림: 서스펜션의 색상이 빨간색으로 돌아가야 합니다. 현탁액이 노란색으로 유지되면 NaOH를 적가하고 빨간색으로 변할 때까지 혼합합니다(그림 2E).</li>
		<li>입자를 15,000rpm에서 3분 동안 균질화하고 실온에서 18,500× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>펠릿(그림 2F)을 관찰하고 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 참고: 단단히 포장된 알지네이트 미립자의 펠릿은 추가 사용이 있을 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 알긴산 용액이 필터 멸균되지 않은 경우 미립자는 1주일 이내에 모두 사용해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SHAPE 복합 제형<ol><li>인쇄 전날, 알긴산 미세입자 펠릿을 LAF 벤치에서 4% HEPES(1M 스톡) 및 4% NaHCO3 용액을 함유하는 성장 배지 부피의 2배에 재현탁하고, 실온에서 밤새 배양한다.</li>
		<li>마이크로겔 현탁액을 18,500 × g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
		<li>알지네이트 미립자와 혼합되는 콜라겐을 LAF 벤치에서 중화시킨다. 콜라겐 원액을 희석하여 최종 농도 1mg/mL에 도달하고 4% HEPES와 4% NaHCO3를 첨가하여 중화합니다. 예를 들어, SHAPE 복합체 3mL의 경우 알지네이트 미립자 2mL와 중화 콜라겐 1mL(HEPES 0.12mL,NaHCO3 0.12mL, 성장 배지 0.16mL 및 콜라겐 0.6mL)를 혼합합니다. 알림: 콜라겐과 혼합되는 모든 물질은 콜라겐 중합을 피하기 위해 얼음 위에서 다루어야 합니다. 콜라겐이 중화되자마자 중합이 천천히 시작됩니다.</li>
		<li>알긴산 미세 입자 펠릿과 희석 및 중화된 콜라겐을 2:1 비율로 혼합하여 SHAPE 복합체를 생성합니다. LAF 벤치에서 얼음 위에서 천천히 위아래로 피펫팅하여 젤을 완전히 섞습니다. 알림: 지지 재료에 기포가 생길 수 있으므로 소용돌이치지 마십시오.</li>
		<li>LAF 벤치에서 생성된 복합 재료를 냉각된 마이크로웰 플레이트 또는 적절한 인쇄 용기로 옮기고 30분 이내에 사용합니다(그림 3E, F).</li>
	</ol></li>
</ol>3. hNSC 배양 및 바이오잉크 준비
<ol><li>성장 배지에서 기저막 추출물이 코팅된 T75 플라스크에서 세포를 배양합니다. 3D 프린팅 실험에 사용하기 전에 해동 후 세포를 최소 2회 계대배양합니다.</li>
	<li>인쇄하기 전에, 37°C에서 5분 동안 0.025% 트립신 용액을 사용하여 세포를 효소적으로 해리시키고, 트립신을 성장 배지로 중화시키고, 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 400 × g 에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 2-3 mL의 성장 배지에 재현탁시킨다.</li>
	<li>세포 계수를 수행하고, 400 × g에서 세포를 원심분리하고, 0.1% 잔탄검(세포가 침전되는 것을 방지하기 위해)이 보충된 성장 배지에 펠릿을 9 ×10 6 cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다.</li>
	<li>21G의 뭉툭한 금속 바늘을 사용하여 단단히 채워진 알지네이트 미립자 100μL를 주사기에 넣습니다(그림 3A). 참고: 알지네이트 미립자로 플러그를 만드는 것은 두 가지 목적을 제공합니다: 인쇄 중 압출 안정성을 유지하는 데 도움이 되고 로드된 셀룰러 잉크(데드 볼륨 없음)의 완전한 압출을 허용합니다.</li>
	<li>동일한 바늘을 사용하여 준비된 세포 현탁액을 주사기에 넣습니다(그림 3B). 알림: 주사기 로딩 단계에서 기포가 유입되지 않도록 각별히 주의하십시오. 기포는 인쇄하는 동안 불안정을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>로딩 바늘을 인쇄에 사용할 27G 무딘 금속 바늘로 교체합니다(그림 3C).</li>
</ol>4. 임베디드 3D 프린팅
<ol><li>참조된 소프트웨어를 사용하여 인쇄할 구조를 설계합니다( 재료 표 참조). 알림: 인쇄된 구조의 초기 높이를 SHAPE 복합 지지대의 깊이 내로 조정해야 합니다. 디자인 제안은 그림 4A (나선형 및 목재 파일 디자인)에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>생성을 클릭하여 G-Code를 생성합니다.</li>
	<li>세포가 함유된 유리 주사기를 압출 기반 바이오프린터의 체적 압출 헤드에 삽입합니다(그림 3D).</li>
	<li>Needle Length Measurement(바늘 길이 측정)를 클릭하여 세포가 함유된 유리 주사기의 바늘 길이를 측정합니다.</li>
	<li>SHAPE 컴포지트가 들어 있는 마이크로웰 플레이트 또는 용기를 프린터에 놓습니다. 알림: 지지대의 조기 가교를 방지하기 위해 인쇄할 때까지 셀 플레이트 또는 용기를 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>SHM(표면 높이 측정)을 클릭하여 SHAPE 젤이 로드된 동일한 마이크로웰 플레이트 또는 용기 내에서 빈 웰의 표면 높이를 측정합니다. 알림: 또는 바늘로 우물의 높이를 측정하여 표면 높이를 수동으로 결정하십시오.</li>
	<li>압출 속도를 3.6μL/min으로, 이송 속도를 0.3mm/s로 설정합니다. 참고: 인쇄하기 전에 압출을 테스트해야 합니다. 셀 침전은 노즐 막힘을 유발할 수 있으며 실제 내장 인쇄 전에 작은 부피를 미리 압출하거나 부피 주사기에 수축 부피를 추가하여 방지할 수 있습니다. 경우에 따라 바늘이 SHAPE 젤에 삽입되거나 나올 때 잉크가 끌리지 않도록 이송 속도를 0.5mm/s 미만 으로 유지해야 합니다.</li>
	<li>G 코드를 프린터의 사용자 인터페이스에 로드합니다. 알림: 설계된 구조가 변경될 때마다 새로운 G-Code를 생성해야 합니다.</li>
	<li>실행(Run)을 클릭하여 인쇄 절차를 시작합니다(그림 3G).</li>
	<li>인쇄 직후, SHAPE 겔을 37°C에서 30분 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣고 어닐링한다.</li>
	<li>어닐링된 SHAPE 젤 지지대 위에 성장 배지를 부드럽게 추가합니다.</li>
	<li>다음날, 성장 배지를 다음과 같이 제형화된 분화 배지로 교체하십시오: DMEM/F12 30mM 포도당, 5μM HEPES, 0.5% w/v 지질이 풍부한 소 혈청 알부민, 40μM L-알라닌, 40μM L-아스파라긴 일수화물, 40μM L-아스파라긴산, 40μM L-글루탐산, 40μM L-프롤린, 1% N2 보충제, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 100μM 디부티릴-사이클릭 아데노신 모노포스페이트(디부티릴-cAMP), 및 2ng/mL 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF). 알림: 배지 교체 중에 하이드로겔이 손상되지 않도록 하십시오. 접시를 기울이고 오래된 매체를 부드럽게 제거합니다. 젤 위에 직접 위가 아닌 젤이 들어있는 웰의 벽에 신선한 배지를 적가합니다. 배지를 제거하기 위해 흡열기를 사용하지 마십시오.</li>
	<li>실험 종점까지 2일마다 분화 배지를 새로 고칩니다.</li>
</ol>5. 생세포 형광 이미징
<ol><li>젤에서 과도한 배지를 제거합니다.</li>
	<li>동일한 부피의 20μM Calcein AM(원액에서 분화 배지로 희석됨)을 지지 겔의 부피에 추가합니다.</li>
	<li>37°C에서 40분 동안 배양합니다.</li>
	<li>Calcein AM 용액을 제거하고 적절한 양의 신선한 분화 배지를 추가합니다.</li>
	<li>이미징을 위해 플레이트를 현미경으로 옮깁니다.</li>
</ol>6. 면역세포화학
<ol><li>젤에서 과잉 배지를 제거합니다.</li>
	<li>작은 주걱을 사용하여 젤을 DPBS가 들어 있는 더 큰 용기로 옮깁니다.</li>
	<li>DPBS로 매번 20분 동안 세 번 세척하고 플레이트를 흄 후드로 옮깁니다.</li>
	<li>DPBS를 제거하고 겔을 덮을 만큼 충분한 4% 포름알데히드 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>매번 20분 동안 DPBS로 세 번 세척하십시오.</li>
	<li>DPBS에 당나귀 혈청 5%, 세제 0.25%, 아지드화나트륨 0.02%로 구성된 블로킹 용액을 준비합니다. 알림: 젤을 덮는 데 필요한 부피의 3배를 준비합니다. 이는 나중에 1차 및 2차 항체 용액의 기초로 사용될 것입니다.</li>
	<li>DPBS로 세척한 후 블로킹 용액을 겔에 첨가하고 불특정 결합을 방지하기 위해 실온에서 6시간 동안 배양합니다. 접시를 부드럽게 흔든다.</li>
	<li>TUBB3 항체를 블로킹 용액에 1:1,000의 비율로 희석하여 1차 항체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>겔로부터 블로킹 용액을 제거하고, 1차 항체 용액을 첨가하고, 4°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 접시를 부드럽게 흔든다.</li>
	<li>매번 20분 동안 DPBS로 세 번 세척하십시오.</li>
	<li>4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, 1:1,000)과 2차 항체(1:200)를 블로킹 용액에 희석하여 2차 항체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>DPBS로 세척한 후, 4°C에서 24시간 동안 2차 항체 용액에서 겔을 인큐베이션한다. 접시를 부드럽게 흔든다.</li>
	<li>매번 20분 동안 DPBS로 3회 세척하고 이미징될 때까지 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>이미징하기 전에 주걱으로 염색 된 젤을 이미징 바닥이 얇은 접시 또는 웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
</ol>

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<li>Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+slurry+as+a+support+medium+for+bioprinting+and+culturing+freestanding+cell-laden+hydrogel+constructs%5BTitle%5D)+AND+%223D+Printing+and+Additive+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs.</a> 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

SHAPE 복합 재료 접근 방식은 셀룰러 잉크의 임베디드 3D 프린팅을 위한 어닐링 및 생체 기능성 지지 수조의 제형을 위한 다양한 경로를 제공합니다. 이 프로토콜은 신경 구조의 3D 프린팅의 예를 제공하지만 SHAPE 도구 상자는 다양한 표적 조직 유형의 정밀 엔지니어링을 위해 다른 세포 소스와의 생체 가공에 쉽게 적용할 수 있습니다. 인쇄 접근 방식은 또한 여러 세포 유형의 정확한 패터닝을 통해 상호 작용을 연구하거나 세포 구획(예: 뉴런 및 신경교 세포)의 정의된 공간 배열로 조직을 조작할 수 있습니다. 기존의 과립형 겔과 달리 SHAPE 복합재는 확장된 틈새 공간(이 프로토콜에 제시된 제형에 대해 ~30% 부피 분율)을 포함합니다. 입상 구성 요소는 고해상도 임베디드 인쇄에 유리한 재료 특성을 복합재에 제공하는 유변학적 개질제 역할을 합니다. 이것은 동일한 세분화 된 구성 요소를 유지하면서 연속 구성 요소의 제형을 변경함으로써 세포 미세 환경의 합리적인 설계를 향한 길을 열어줍니다. 예를 들어, 다른 기능적 ECM 분자(예: 히알루론산, 라미닌, 피브로넥틴)를 지지 배스에 도입하거나 다른 가교 메커니즘(예: 효소, 광 기반)을 활용할 수 있습니다13. 또한, 과립 성분의 알긴산염은 다른 하이드로겔 재료(예: 젤라틴 8, 폴리에틸렌 글리콜14,15, 아가로스 16)의 미세 입자로 대체되거나 다양한 조직 공학 또는 질병 모델링 응용 분야의 요구에 따라 다양한 크기와 모양으로 만들어질 수 있습니다. 입상 위상과 연속 위상 간의 비율은 개별 3D 프린팅 프로젝트의 필요에 따라 조정할 수 있지만 연속 위상을 30% 이상으로 늘리면 프린팅 충실도와 해상도가 저하될 수 있습니다.
마이크로겔 생산 단계 동안, 아세트산을 첨가한 후 알긴산염 용액의 교반이 겔화 용액의 부피 전체에 걸쳐 효과적이라는 것이 중요하다. 교반 속도가 너무 낮거나 자기 교반기가 너무 작으면 교반이 용액의 상부 층에 도달하지 못할 수 있으며, 이는 많은 양의 가교 벌크 하이드로겔로 변하는 반면 하부 층은 전단됩니다. 일관되지 않게 전단된 알지네이트 하이드로겔의 균질화는 3D 프린팅 응용 분야에 최적이 아닌 알지네이트 미세 입자를 생성합니다. 또한, 알긴산 미립자는 콜라겐 용액과 완전히 혼합되어야 하는데, 이는 비균질한 혼합물이 콜라겐이 결여된 지지 물질의 패치를 초래하기 때문입니다. 이러한 패치는 어닐링되지 않으므로 세포 상호 작용 기능이 부족합니다. 알지네이트 미립자가 부족하여 인쇄를 지원하지 않는 패치도 있을 수 있습니다. 따라서 불균일하게 혼합 된 인쇄 지원은 고화질 인쇄를 지원할 수 없으며 볼륨 전체에 걸쳐 어닐링되지 않기 때문에 구조적으로 손상됩니다. 기포는 세포에 해로울 수 있기 때문이 아니라 공기 주머니가 인쇄 중에 변형을 일으키고 구조물의 이미징을 방해할 수 있기 때문에 피해야 합니다. 기포의 두 가지 일반적인 원인은 와류(37°C에서 지지체 어닐링 중에 팽창하는 저온 지지체의 미세 기포)와 격렬한 피펫팅입니다.
이 작업에서 SHAPE 복합 지지체는 인쇄 후 제거되는 희생 재료가 아니라 줄기 세포 분화와 신경 성장 및 기능적 성숙을 위한 장기적인 생체 기능 지지체로 공식화되었습니다. 인쇄 후 어닐링되지 않은 과립 겔과 비교하여, 어닐링된 SHAPE 복합 재료의 구조적 안정성 및 투명성은 고정 및 면역 표지 과정에서 섬세한 신경 특징에 대한 보호 환경을 제공하며, 따라서 이 재료는 항원의 시각화를 통해 형태학적 특성화를 용이하게 합니다. 형광 리포터는 또한 시간 경과에 따른 세포 형태의 변화를 추적하고 어닐링된 인쇄 지지대 내에서 세포 증식 및 이동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 칼슘 이미징 접근법은 자발적인 세포 활동(예: 뉴런의 활동 전위 발화 또는 동기식 뉴런 네트워크 활동)에 대한 정보를 제공하는 데 사용될 수 있습니다. 그러나 조작된 세포 구조의 화학적 자극(예: KCl을 사용한 신경 자극)은 세포를 둘러싸고 있는 하이드로겔 층으로 인해 어려울 수 있으며, 이는 확산을 늦추고 세포 미세 환경의 즉각적인 조절을 방지합니다. 광유전학적 자극은 SHAPE 하이드로겔이 세포에 대한 광학적 접근을 방해하지 않기 때문에 세포 활동 제어를 위한 더 나은 옵션을 제공합니다.
산소에 민감한 비드는 바이오잉크 또는 지지체 재료에 통합될 수 있으며(복합 준비 중 직접 인쇄 또는 분산을 통해 ) 인쇄된 구조물 내부 및 주변의 산소 장력 수준을 고감도로 실시간 공간 및 시간 매핑할 수 있습니다(13). 인광 수명 측정을 기반으로 하는 이 비침습적 3D 산소 매핑 접근 방식은 개선된 산소 공급과 개선된 영양소 공급으로 조직 구조를 엔지니어링하는 경로를 제공합니다. 산소 공급이 불량하면 인쇄된 구조물 내에 괴사 영역이 형성되고 줄기 세포 분화를 방해하며 신경 대사에 영향을 미칠 수 있습니다. 산소 매핑은 구조물 전체에 걸쳐 균일한 산소 공급, 생리학적 조건에 맞게 산소 수준을 미세 조정하거나 산소 구배를 생성하기 위해 3D 프린팅 설계를 변경할 수 있는 판독값을 제공합니다.
엔지니어링 된 채널은 저온 지지 수조 내부에서 응고되지만 37°C에서 쉽게 배출될 수 있는 젤라틴과 같은 희생 잉크를 인쇄하여 어닐링 가능한 인쇄 지지대 내부에 통합될 수도 있습니다 4,13. 채널은 설계 기반 산소 장력 조작 접근 방식의 기능을 초과하는 높은 세포 밀도 또는 치수를 가진 조직 구조에 영양분과 산소를 공급하는 데 필요합니다. 또한, 혈관 유사 채널을 활용하여 세포 정체성의 패터닝을 유도하거나, 세포 활동을 조절하거나, 화학주성을 안내하는 소분자의 구배를 생성할 수 있습니다.
요약하면, SHAPE 복합재 내부에 내장된 3D 프린팅은 쉽게 적응할 수 있고 기계적으로 민감한 조직의 기능 모델링을 위한 다재다능한 잠재력을 가진 모듈식 재료 플랫폼을 제공합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 서포트 재료를 생성하고 고충실도로 셀룰러 잉크를 인쇄하는 데 필요한 단계와 기본 원칙에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 접근 방식은 저렴한 재료와 접근 가능한 장비를 활용하는 동시에 개별 연구자의 요구와 응용 분야에 대한 접근 방식을 개인화할 수 있는 여지를 제공합니다.

시험관 내에서 연조직을 모방하는 세포 함유 하이드로겔 구조의 정밀하고 프로그래밍 가능한 3D 프린팅은 큰 도전 과제입니다. 예를 들어, 연질 하이드로겔의 직접 압출을 기반으로 한 시도는 생체 내 미세 환경을 재현하는 데 필요한 열악한 기계적 특성으로 인해 구조적 무결성이 부족하거나 사전 정의된 특징이 변형되거나 제작된 구조가 완전히 붕괴되기 때문에 본질적으로 문제가 있습니다. 이 문제에 대한 기존의 해결 방법은 최종 구조가 모양을 유지할 수 있도록 더 단단한 생체 적합성 재료로 지지 스캐폴드를 인쇄하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 설계 가능성을 크게 제한하고 인접 잉크의 신중한 유변학적 미세 조정이 필요합니다.
전통적인 층별 압출 기반 3D 프린팅의 한계를 극복하기 위해 임베디드 3D 프린팅은 최근 몇 년 동안 연질 재료 및 조직 제작의 강력한 대안으로 등장했습니다 1,2,3,4,5,6. 표면 상단의 주변 공기에서 잉크를 압출하는 대신, 잉크는 정지 상태에서는 고체와 같지만 움직이는 바늘 끝 주위를 가역적으로 유동화하여 연질 셀 함유 재료를 정밀하게 증착할 수 있도록 하는 지지 수조 내부의 주사기 바늘을 통해 직접 증착됩니다. 증착된 물질은 바늘의 여파로 지지체가 다시 응고될 때 제자리에 유지됩니다. 따라서 임베디드 3D 프린팅은 확장된 설계 가능성을 가진 부드러운 생체 재료로 복잡한 구조의 고해상도 자유형 제작을 가능하게 합니다 7,8.
입상 겔은 낮은 항복 응력 9,10,11에서 매끄럽고 국소적이며 가역적인 고체-액체 전이를 나타내도록 공식화될 수 있기 때문에 임베디드 3D 프린팅을 위한 지지 수조 재료로 광범위하게 연구되었습니다. 고해상도 인쇄를 위한 우수한 유변학적 특성을 보여주지만, 과립형 겔은 소수의 생체 재료에 국한되어 있다12. 벌크 하이드로겔 제형에 사용할 수 있는 광범위한 바이오 재료를 고려할 때 특히 분명한 과립형 겔 제형의 다양성 부족은 간단한 화학 물질을 사용하여 많은 수의 마이크로겔을 비용 효율적으로 생성해야 하기 때문에 발생합니다. 과립형 겔 지지체의 제한된 생체 재료 환경으로 인해 인쇄 지지체가 제공하는 세포외 미세 환경의 조정은 현장에서 도전 과제를 제시합니다.
최근에, 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 매트릭스(SHAPE) 복합재(self-healing annealable particle-extracellular matrix, SHAPE) 복합체(composites13)라고 하는 임베디드 3D 프린팅 지지체의 생성을 위한 모듈식 접근법이 개발되었다. 이 접근법은 과립형 겔의 뚜렷한 유변학적 특성과 벌크 하이드로겔 제형의 생체 기능적 다양성을 결합합니다. 제시된 SHAPE 복합 지지체는 점성 콜라겐 기반 ECM 프리겔 용액(연속상, ~30% 부피 분율)으로 채워진 증가된 틈새 공간과 함께 충전된 알지네이트 미립자(과립상, ~70% 부피 분율)로 구성됩니다. 또한 SHAPE 지지체는 인간 신경 줄기 세포(hNSC)의 고해상도 증착을 용이하게 하며, 지지체의 어닐링 후 뉴런으로 분화되고 기능적 성숙에 도달하기 위해 몇 주 동안 유지될 수 있는 것으로 나타났습니다. SHAPE 지지대 내부에 내장된 3D 프린팅은 신경 조직 생체 제조를 위한 기존 기술과 관련된 주요 한계 중 일부를 극복하는 동시에 다목적 플랫폼을 제공합니다.
이 작업은 SHAPE 지지대 내부에 hNSC를 내장한 3D 프린팅 단계와 이후 기능적 뉴런으로 분화하는 단계를 자세히 설명합니다(그림 1). 첫째, 알지네이트 미립자는 내부 겔화 동안 전단을 통해 생성됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 특수 장비 및 세포독성 시약 없이 대량의 미립자를 쉽게 생성할 수 있습니다. 또한, 알지네이트는 다양한 세포 유형에 대한 생체적합성 하이드로겔 기질의 형성을 위한 널리 이용 가능하고 경제적인 재료 공급원입니다. 생성된 알지네이트 미립자는 콜라겐 용액과 결합하여 SHAPE 복합 지지체 물질을 형성합니다. 그런 다음 hNSC를 수확하여 3D 프린팅을 위한 세포 바이오잉크로 주사기에 로드합니다. 3D 바이오 프린터는 SHAPE 복합재 내부의 hNSC의 압출 기반 임베디드 인쇄에 사용됩니다. 3D 프린팅 된 세포는 뉴런으로 분화되어 공간적으로 정의되고 기능적인 인간 신경 구조를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 생성된 조직 구성물이 생세포 이미징 및 면역세포화학을 사용하여 특성화될 수 있는 방법을 설명합니다. 또한 최적화 및 문제 해결을 위한 팁이 제공됩니다. 특히, 과립상 및 연속상의 구성 요소는 신경 응용 분야를 넘어 다른 세포 및 조직 유형에서 요구하는 대로 다양한 생체 기능성 부분, 기계적 특성 및 가교 메커니즘을 수용하기 위해 다른 하이드로겔 제형과 교환될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 가스 밀폐 주사기 1001 TLL</td><td>해밀턴</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>3DDiscovery 3D 바이오프린터</td><td>레겐후</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마-올드리치</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>알부맥스</td><td>서모피셔</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>알렉사 플루오 488 2차 항체</td><td>서모피셔</td><td>A-11001</td><td>염소 안티마우스</td></tr><tr><td>둔한 바늘, 스테리칸 (21 G)</td><td>브라운</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>둔한 바늘 (27 G)</td><td>셀링크</td><td>NZ5270505001</td><td></td></tr><tr><td>BioCAD 소프트웨어</td><td>솔리드웍스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>칼세인 AM</td><td>서모피셔</td><td>65-0853-39</td><td></td></tr><tr><td>탄산칼슘</td><td>시그마-올드리치</td><td>C5929</td><td></td></tr><tr><td>디부티릴-cAMP 나트륨염</td><td>시그마-올드리치</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>컬트렉스 랫 콜라겐 I (5 mg/mL)</td><td>R& D 시스템즈</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>다피</td><td>서모피셔</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 글루타맥스</td><td>서모피셔</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>시그마-올드리치</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>서모피셔</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D 시스템즈</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>R& D 시스템즈</td><td>3718-FB</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 4%, 완충, pH 6.9</td><td>시그마-올드리치</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R& D 시스템즈</td><td>212-GD</td><td></td></tr><tr><td>겔트렉스</td><td>서모피셔</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-올드리치</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 (1 m)</td><td>서모피셔</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌</td><td>시그마-올드리치</td><td>5129</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파라진 모노하이드레이트</td><td>시그마-올드리치</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>시그마-올드리치</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>시그마-올드리치</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>시그마-올드리치</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>자기 교반자 RET 기본</td><td>이카</td><td>3622000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충</td><td>서모피셔</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>서모피셔</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>S25N-10G 분산 도구</td><td>이카</td><td>4447100</td><td></td></tr><tr><td>알지네이트 나트륨 (80-120 cP)</td><td>후지필름 와코</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>아자이드나트륨</td><td>시그마-올드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-올드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-올드리치</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>T18 디지털 ULTRA-TURAX 균질화 장치</td><td>이카</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-올드리치</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 솔루션</td><td>서모피셔</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>TUBB3 항체</td><td>바이오레전드</td><td>801213</td><td>마우스</td></tr><tr><td>잔탄검 &nbsp;</td><td>시그마-올드리치</td><td>G1253</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 신경 구조물의 임베디드 3d 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

과립 지지 배지 내부에 세포를 내장한 3D 프린팅은 지난 10년 동안 연조직 구조의 자유형 생체 제조를 위한 강력한 접근 방식으로 등장했습니다. 그러나, 과립형 겔 제형은 다량의 하이드로겔 미세입자의 비용 효율적인 생성을 가능하게 하는 제한된 수의 바이오 물질로 제한되어 왔다. 따라서 과립형 겔 지지 배지는 일반적으로 천연 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 세포 접착 및 세포 지시 기능이 부족합니다.
이를 해결하기 위해 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질(SHAPE) 복합체를 생성하기 위한 방법론이 개발되었습니다. SHAPE 복합재는 과립상(마이크로겔)과 연속상(점성 ECM 용액)으로 구성되며, 이를 통해 프로그래밍 가능한 고화질 인쇄와 조정 가능한 생체 기능성 세포외 환경을 모두 허용합니다. 이 연구는 개발된 방법론이 인간 신경 구조의 정확한 생체 제작에 어떻게 활용될 수 있는지 설명합니다.
먼저, SHAPE 복합체에서 입상 성분 역할을 하는 알지네이트 미세입자를 제조하여 콜라겐 기반의 연속 성분과 결합합니다. 그런 다음 인간 신경 줄기 세포를 지지체 내부에 인쇄한 다음 지지체를 어닐링합니다. 인쇄된 구축물은 인쇄된 세포가 뉴런으로 분화될 수 있도록 수주 동안 유지될 수 있다. 동시에, 콜라겐 연속기는 축삭 성장과 영역의 상호 연결을 허용합니다. 마지막으로, 이 연구는 3D 프린팅된 인간 신경 구조를 특성화하기 위해 생세포 형광 이미징 및 면역세포화학을 수행하는 방법에 대한 정보를 제공합니다.

내부 겔화 동안 전단 박화를 통한 알지네이트 마이크로겔 제조에 이어 기계적 단편화는 그림 2G에서 볼 수 있듯이 크기가 다분산되고 플레이크와 같은 모양을 갖는 알지네이트 마이크로겔을 생성합니다. 이러한 불규칙한 입자의 크기는 직경이 1μm 미만에서 약 40μm입니다. 촘촘하게 포장된 미세 입자는 해당 세포 배양 배지보다 약간 더 불투명한 투명한 벌크 물질을 형성합니다(그림 2F). 서포트 재료의 투명도는 배양 기간 동안 인쇄된 구조를 시각화할 수 있을 뿐만 아니라 생세포 염료 및 면역세포화학을 통해 표지된 구조물의 고해상도 컨포칼 현미경을 가능하게 하기 때문에 플랫폼의 중요한 측면입니다. 완충된 세포 배양 배지에 담갔을 때, 생성된 pH-조절된 겔은 생리학적 조건을 나타내는 붉은색을 띠어야 한다(도 2F). 알긴산 미립자의 pH를 중화하는 것은 두 가지 이유로 중요하다. 산성 미립자는 세포에 직접적인 해를 끼칠 수 있습니다. 또한, 산성 환경은 콜라겐 중합을 방해할 수 있으므로 SHAPE 복합 지지체의 성공적인 어닐링을 방해합니다.
위에서 설명한 매개 변수를 사용하여 hNSC 잉크를 인쇄하면 직경이 ~ 200 μm 인 셀 필라멘트가 생성됩니다 (그림 4A). 프로그래밍된 형상은 한 평면에서 인쇄할 때와 구조를 서로 위에 인쇄할 때 모두 보존됩니다. 다층 인쇄의 경우, 인쇄 구조는 200 μm의 최소 층간 거리로 온전하게 유지된다13. 세포의 생존력은 잉크 준비 및 압출 중에 크게 영향을 받지 않아야 합니다. 인쇄된 가닥은 둥근 형태를 가진 살아있는 세포가 풍부합니다(그림 4B, 왼쪽). 인쇄된 가닥의 간격은 인쇄된 구조물이 인쇄 직후 변형을 나타내지 않더라도 인쇄 다음날에 나타날 수 있습니다. 이것은 지지체의 불균일 한 혼합의 결과 일 가능성이 큽니다. 세포는 알긴산 미세 입자와 상호 작용하지 않기 때문에 알긴산이 풍부한 영역에서 콜라겐 및 세포가 풍부한 영역으로 이동하여 인쇄 된 가닥이 파손됩니다. 또한 SHAPE 지지대는 공기 주머니가 인쇄 충실도를 방해할 수 있으므로 기포가 없어야 합니다.
hNSC의 성공적인 분화는 인쇄 후 30일 후에 뉴런이 풍부한 구조를 생성해야 하며, 세포는 작은 세포체와 길고 얇은 과정을 가진 뉴런 형태를 나타내야 합니다(그림 4B, 오른쪽). 또한, 직사각형 세포 시트와 같이 조밀한 패턴이 인쇄되는 경우 분화 중에 눈에 띄는 틈이나 응집체가 형성되지 않아야 하며 오히려 연속적인 세포 층이 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다(그림 4C). 이 프로토콜에서는 3D 프린팅 샘플의 형광 면역세포화학 절차가 설명됩니다. 세포질 뉴런 마커인 TUBB3에 대한 염색을 통해 생성된 뉴런 네트워크를 직접 시각화할 수 있습니다. 차별화된 인쇄물의 형광 현미경은 TUBB3가 풍부하고 기하학적 구조가 유지되는 구조를 나타내야 합니다(그림 4D, 왼쪽). 분화 과정 동안, 세포는 DAPI로 세포핵을 염색하여 관찰할 수 있는 것처럼 인쇄된 가닥 밖으로 이동하지 않습니다(그림 4D, 가운데). 그 결과, 인쇄된 기하학의 경계 내에서 뉴런체가 관찰되며, 축삭 돌출부는 구조물을 둘러싼 SHAPE 지지체로 수백 마이크로미터를 방출합니다. 주변 부피의 축삭 탐색은 SHAPE 지지체가 축삭 경로 찾기를 허용하는 생체 기능적 단서를 제공한다는 것을 나타냅니다. 보다 성숙한 뉴런 마커 또는 아형 특이적 마커는 생성된 뉴런 집단을 추가로 특성화하기 위해 면역세포화학에 사용될 수 있습니다. 또한, 인쇄된 뉴런 구조체는 RT-qPCR 또는 전기생리학을 사용하여 특성화할 수 있습니다(13). 그러나 두 가지 접근 방식 모두 하이드로겔 층이 마이크로피펫으로 RNA 추출과 세포에 대한 물리적 접근을 모두 방해하기 때문에 콜라게나제를 사용하여 콜라겐을 제거해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65158/65158fig01v2.jpg"> 그림 1: SHAPE 임베디드 프린팅 접근 방식의 개념 그림. 콜라겐 용액을 알지네이트 미립자와 혼합하여 SHAPE 복합체를 형성하고; SHAPE 복합재는 어닐링된 지지체 내부의 뉴런으로 분화되는 hNSC의 임베디드 3D 프린팅을 위한 지지체 재료로 사용됩니다. SHAPE 복합체의 생체 기능적 특성으로 인해 뉴런은 돌출부를 확장하고 지지체의 빈 부분을 축삭 돌출부로 채울 수 있습니다. 이 수치는 Kajtez et al.13에서 수정되었습니다. 약어: SHAPE = 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질; hNSCs = 인간 신경 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65158/65158fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65158/65158fig02.jpg"> 그림 2: 알긴산 미립자의 제조. (a) 밤새 겔화시킨 후 알긴산 용액. (B) 균질화에 의해 생성된 알긴산 미립자. (C) 원심분리 후 입자 펠릿. (D) 펠렛을 pH 조정 전 및 pH 조정 후의 (E) DMEM에 재현탁시킨다. (f) 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후 미립자를 원심분리한다. (g) 제조된 알지네이트 미세입자의 명시야 이미지. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65158/65158fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65158/65158fig03.jpg"> 그림 3: 3D 프린팅 공정 준비 . (A) 슬러리 플러그(~100μL)를 주사기에 로드한 다음 (B) 셀룰러 바이오잉크(여기서는 시각화를 위해 컬러 비드로 보충됨)를 로드합니다. (C) 잉크 로딩에 사용되는 원추형 플라스틱 팁(21G)을 27G 무딘 금속 바늘 팁으로 교체합니다. (D) 주사기가 3D 프린팅 헤드에 삽입됩니다. (E,에프) SHAPE 복합재는 48웰 플레이트의 웰에 피펫팅됩니다. SHAPE 복합재가 있는 튜브는 취급하지 않을 때 얼음 위에 보관됩니다. (G) 인쇄 바늘 끝이 SHAPE 지지대에 삽입되고 컴퓨터 설계에 의해 정의 된 경로의 인쇄가 시작됩니다 (여기서는 나선형 인쇄가 표시됨). 약어: SHAPE = 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65158/65158fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65158/65158fig04.jpg"> 그림 4: SHAPE 복합 지지대 내부의 3D 프린팅 신경 구조 . (A) 지지체 하이드로겔 내부에 인쇄된 hNSC의 명시야 이미지. 나선형(왼쪽)과 장작더미(오른쪽) 구조물 설계가 표시됩니다. (B) 프린팅 다음날(왼쪽)과 뉴런 분화 후(오른쪽)에 3D 프린팅된 구조물의 라이브 셀 이미징. (C) 주걱으로 배양 우물에서 제거된 3D 프린팅된 정사각형 구조물은 구조적 무결성을 나타냅니다. (D) 3D 프린팅 구조물 내에서 hNSC의 성공적인 분화를 확인하는 뉴런 마커(TUBB3) 및 대조염색된 핵(DAPI)에 대해 면역표지된 동일한 정사각형 구조의 형광 공초점 이미지. 스케일 바 = 500 μm (A, 오른쪽); 100 μm (B, D). 이 그림의 패널 C 와 D 는 Kajtez et al.13에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65158/65158fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구는 자가 치유 어닐링 가능한 입자-세포외 기질 복합체 내부의 신경 줄기 세포의 자유형 임베디드 3D 프린팅을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 높은 충실도로 상호 연결된 인간 신경 조직 구조의 프로그래밍 가능한 패터닝을 가능하게 합니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

SHAPE 복합재에 내장된 3D 프린팅은 기존의 생체 제조 한계를 극복하여 천연 세포외 환경과 유사한 하이드로겔 내부의 기계적으로 민감한 조직의 정확한 패터닝을 가능하게 합니다. SHAPE 툴박스는 모듈식 생체 재료 설계에 의존하여 프린팅 서포트 배합을 쉽게 변경할 수 있습니다. 또한 다른 연구 그룹에서 간단하게 조정할 수 있도록 저렴한 재료와 접근 가능한 장비를 활용합니다.이 접근법은 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환에서 신경 발달 및 의사 소통을 검사하기 위해 공간적으로 정의된 인간 신경 조직 모델을 만드는 데 적용할 수 있습니다. 초순수에 탄산칼슘 용액을 밀리리터당 2밀리그램 농도로 준비하는 것으로 시작합니다. 알긴산 용액과 동일한 비율로 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 650RPM에서 자기 적으로 저어줍니다.그런 다음 이 혼합물에 아세트산을 1:500의 비율로 넣고 밤새 다시 저어줍니다. 다음날, 균질기를 사용하여 15, 000 RPM에서 10 분 동안 젤리 알긴산 용액을 기계적으로 미세 입자로 단편화합니다. 그런 다음 원심분리하여 미립자를 얻습니다.상층액을 조심스럽게 버리고 2밀리몰 수산화나트륨과 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 입자를 재현탁합니다. 서스펜션의 색상이 다시 빨간색으로 변경되어야 합니다. 섭씨 4도에서 밤새 현탁액을 배양합니다.배양 후, 현탁액을 15, 000 RPM에서 3 분 동안 균질화하고 18, 500 G에서 10 분 동안 원심 분리한다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠릿이 단단히 포장된 알지네이트 미세입자를 관찰합니다. SHAPE 복합재를 생성하려면 알지네이트 미립자 펠릿을 희석 및 중화된 콜라겐과 2:1의 비율로 혼합하고 얼음 위에서 위아래로 피펫팅합니다.생성된 복합 재료를 냉각된 24웰 플레이트로 옮깁니다. 인쇄하기 전에 섭씨 37도에서 5분 동안 0.025% 트립신 용액을 사용하여 이전에 배양된 인간 신경 줄기 세포 또는 hNSC를 해리합니다. 그 후 트립신을 성장 배지로 중화시키고 세포 현탁액을 400 G에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다.상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 2 내지 3 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 21 게이지 무딘 금속 바늘을 사용하여 단단히 채워진 알긴산 미립자 100마이크로리터를 주사기에 넣습니다. 그런 다음 준비된 세포 현탁액을 주사기에 넣습니다.인쇄하려면 로딩 바늘을 27게이지 무딘 금속 바늘로 교체하십시오. 참조된 소프트웨어를 사용하여 인쇄할 구조가 설계되면 G 코드 생성을 위해 생성을 클릭합니다. 압출 기반 바이오프린터의 체적 압출 헤드에 세포 로딩 주사기를 삽입하고 바늘 길이 측정 프로세스 시작을 클릭하여 바늘 길이를 기록합니다.그런 다음 SHAPE 컴포지트가 로드된 24웰 플레이트를 프린터에 놓고 SHM을 클릭하여 빈 웰 표면 높이를 측정합니다. pH 2를 선택한 다음 렌치 기호를 선택합니다. 그런 다음 매개변수 세트에서 체적 유량을 초당 3.6마이크로리터로 변경하고 매개변수 적용을 누른 다음 저장 및 완료를 누릅니다.G 코드 열기 아이콘을 클릭하여 프린터 사용자 인터페이스에 G 코드를 로드합니다. 실행 프로그램의 아이콘을 선택하여 인쇄 절차를 시작합니다. 인쇄 직후 SHAPE 젤을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 어닐링합니다.그런 다음 어닐링된 SHAPE 겔 지지체에 성장 배지를 부드럽게 추가합니다. 면역염색을 위해, 겔로부터 과량의 배지를 제거하고, 스패튤라를 사용하여, 겔을 DPBS를 함유하는 용기로 옮긴다. 플레이트를 흄 후드에 넣으면 DPBS를 제거합니다.겔을 4% 포름알데히드 용액으로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. DPBS로 세척 한 후 블로킹 용액을 젤에 첨가하십시오. 플레이트를 부드럽게 흔들고 불특정 결합을 방지하기 위해 실온에서 6시간 동안 배양합니다.차단 용액이 제거되면 1차 항체를 젤에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. DPBS 세척 후, 유사하게 겔을 24시간 동안 2차 항체 용액으로 처리한다.이미징하기 전에 주걱으로 염색된 젤을 이미징 바닥이 얇은 웰 플레이트에 놓습니다. 본 연구에서, hNSC 잉크는 약 200 마이크로미터의 직경을 갖는 세포의 필라멘트를 인쇄하였다. 인쇄된 가닥은 주변에 형태가 있는 생존 가능한 세포가 풍부했습니다.인쇄 30일 후, 세포는 작은 세포체와 길고 얇은 과정을 가진 신경 형태를 나타내었으며, 이는 hNSC의 성공적인 분화를 나타냅니다. 튜불린 베타 3으로 염색하면 기하학이 유지된 생성된 신경망을 시각화할 수 있었습니다. 그리고 분화 과정에서 세포는 인쇄된 가닥 밖으로 이동하지 않았습니다.SHAPE 합성물은 셀 대신 희생 잉크를 인쇄하여 관류 가능한 채널을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 지지체에는 시간과 공간에 따른 3D 프린팅 구조물의 산소 장력을 모니터링하기 위한 산소 민감성 비드가 포함될 수 있습니다.

microgel-extracellular-matrix-composite-support-for-embedded-3d

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

출처: Struzyna, LA 외, 신경계 재건, 변조 및 모델링을 위한 해부학적으로 영감을 받은 3차원 미세 조직 공학 신경망. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 세포외 기질 코어가 있는 하이드로겔 마이크로 컬럼을 사용하여 미세 조직 공학 신경망의 개발을 보여줍니다. 시드된 신경 응집체는 부착하고, 투영을 확장하며, 구조화된 신경망을 형성하여 신경 발달 및 신경치료 연구의 발전에 기여합니다.

하이드로겔 기반 마이크로컬럼을 이용한 미세조직 공학 신경망 개발

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

이 원고에서 우리는 말초 조직 공학에 사용하기 위해 그래핀을 함유하는 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 제조를 시연합니다. 이 3D 바이오 하이브리드 재료를 사용하여 줄기 세포의 신경 분화 프로토콜이 수행됩니다. 이것은 유사한 생체 재료를 클리닉에 가져 오는 중요한 단계가 될 수 있습니다.

말초 신경 공학을 위한 그래핀 기반 3D 바이오하이브리드 하이드로겔 바이오잉크의 준비 및 특성화

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 SHAPE 복합체를 활용한 임베디드 3D 프린팅으로 인간 신경 줄기세포를 정밀하게 패턴화하는 방법을. 이 기술은 퇴행성 신경질환에서 신경 발달 및 소통을 연구하는 데 활용됩니다.

인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

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