인간 신경 구조물의 임베디드 3D 프린팅을 위한 마이크로겔-세포외 기질 복합체 지원

SHAPE 복합재에 내장된 3D 프린팅은 기존의 생체 제조 한계를 극복하여 천연 세포외 환경과 유사한 하이드로겔 내부의 기계적으로 민감한 조직의 정확한 패터닝을 가능하게 합니다. SHAPE 툴박스는 모듈식 생체 재료 설계에 의존하여 프린팅 서포트 배합을 쉽게 변경할 수 있습니다. 또한 다른 연구 그룹에서 간단하게 조정할 수 있도록 저렴한 재료와 접근 가능한 장비를 활용합니다.

이 접근법은 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환에서 신경 발달 및 의사 소통을 검사하기 위해 공간적으로 정의된 인간 신경 조직 모델을 만드는 데 적용할 수 있습니다. 초순수에 탄산칼슘 용액을 밀리리터당 2밀리그램 농도로 준비하는 것으로 시작합니다. 알긴산 용액과 동일한 비율로 혼합하고 실온에서 1 시간 동안 650RPM에서 자기 적으로 저어줍니다.

그런 다음 이 혼합물에 아세트산을 1:500의 비율로 넣고 밤새 다시 저어줍니다. 다음날, 균질기를 사용하여 15, 000 RPM에서 10 분 동안 젤리 알긴산 용액을 기계적으로 미세 입자로 단편화합니다. 그런 다음 원심분리하여 미립자를 얻습니다.

상층액을 조심스럽게 버리고 2밀리몰 수산화나트륨과 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 입자를 재현탁합니다. 서스펜션의 색상이 다시 빨간색으로 변경되어야 합니다. 섭씨 4도에서 밤새 현탁액을 배양합니다.

배양 후, 현탁액을 15, 000 RPM에서 3 분 동안 균질화하고 18, 500 G에서 10 분 동안 원심 분리한다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠릿이 단단히 포장된 알지네이트 미세입자를 관찰합니다. SHAPE 복합재를 생성하려면 알지네이트 미립자 펠릿을 희석 및 중화된 콜라겐과 2:1의 비율로 혼합하고 얼음 위에서 위아래로 피펫팅합니다.

생성된 복합 재료를 냉각된 24웰 플레이트로 옮깁니다. 인쇄하기 전에 섭씨 37도에서 5분 동안 0.025% 트립신 용액을 사용하여 이전에 배양된 인간 신경 줄기 세포 또는 hNSC를 해리합니다. 그 후 트립신을 성장 배지로 중화시키고 세포 현탁액을 400 G에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다.

상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 2 내지 3 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 21 게이지 무딘 금속 바늘을 사용하여 단단히 채워진 알긴산 미립자 100마이크로리터를 주사기에 넣습니다. 그런 다음 준비된 세포 현탁액을 주사기에 넣습니다.

인쇄하려면 로딩 바늘을 27게이지 무딘 금속 바늘로 교체하십시오. 참조된 소프트웨어를 사용하여 인쇄할 구조가 설계되면 G 코드 생성을 위해 생성을 클릭합니다. 압출 기반 바이오프린터의 체적 압출 헤드에 세포 로딩 주사기를 삽입하고 바늘 길이 측정 프로세스 시작을 클릭하여 바늘 길이를 기록합니다.

그런 다음 SHAPE 컴포지트가 로드된 24웰 플레이트를 프린터에 놓고 SHM을 클릭하여 빈 웰 표면 높이를 측정합니다. pH 2를 선택한 다음 렌치 기호를 선택합니다. 그런 다음 매개변수 세트에서 체적 유량을 초당 3.6마이크로리터로 변경하고 매개변수 적용을 누른 다음 저장 및 완료를 누릅니다.

G 코드 열기 아이콘을 클릭하여 프린터 사용자 인터페이스에 G 코드를 로드합니다. 실행 프로그램의 아이콘을 선택하여 인쇄 절차를 시작합니다. 인쇄 직후 SHAPE 젤을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 어닐링합니다.

그런 다음 어닐링된 SHAPE 겔 지지체에 성장 배지를 부드럽게 추가합니다. 면역염색을 위해, 겔로부터 과량의 배지를 제거하고, 스패튤라를 사용하여, 겔을 DPBS를 함유하는 용기로 옮긴다. 플레이트를 흄 후드에 넣으면 DPBS를 제거합니다.

겔을 4% 포름알데히드 용액으로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. DPBS로 세척 한 후 블로킹 용액을 젤에 첨가하십시오. 플레이트를 부드럽게 흔들고 불특정 결합을 방지하기 위해 실온에서 6시간 동안 배양합니다.

차단 용액이 제거되면 1차 항체를 젤에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. DPBS 세척 후, 유사하게 겔을 24시간 동안 2차 항체 용액으로 처리한다.

이미징하기 전에 주걱으로 염색된 젤을 이미징 바닥이 얇은 웰 플레이트에 놓습니다. 본 연구에서, hNSC 잉크는 약 200 마이크로미터의 직경을 갖는 세포의 필라멘트를 인쇄하였다. 인쇄된 가닥은 주변에 형태가 있는 생존 가능한 세포가 풍부했습니다.

인쇄 30일 후, 세포는 작은 세포체와 길고 얇은 과정을 가진 신경 형태를 나타내었으며, 이는 hNSC의 성공적인 분화를 나타냅니다. 튜불린 베타 3으로 염색하면 기하학이 유지된 생성된 신경망을 시각화할 수 있었습니다. 그리고 분화 과정에서 세포는 인쇄된 가닥 밖으로 이동하지 않았습니다.

SHAPE 합성물은 셀 대신 희생 잉크를 인쇄하여 관류 가능한 채널을 생산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 지지체에는 시간과 공간에 따른 3D 프린팅 구조물의 산소 장력을 모니터링하기 위한 산소 민감성 비드가 포함될 수 있습니다.