Name: FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT and RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 배우세요 마우스 위성 세포의 FACS 분리 및 CUT&RUN 분석 프로토콜을 통해 골격근 전사 조절 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 근육 줄기세포의 유전자 발현과 핵 수용체 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Anastasia Bannwarth에게 감사드립니다. IGBMC 동물 사육 시설, 세포 배양, Mouse Clinical Institute(ICS, Illkirch, France), 이미징, 전자 현미경, 유세포 분석 및 'France Génomique' 컨소시엄(ANR-10-INBS-0009)의 회원인 GenomEast 플랫폼에 감사드립니다.
스트라스부르 대학교, CNRS 및 Inserm의 ITI 2021-2028 프로그램의 일환으로 학제 간 주제 연구소 IMCBio의 이 작업은 IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)와 SFRI-STRAT'US 프로젝트(ANR 20-SFRI-0012) 및 EUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon 전략 프로그램 24376 (D.D.), INSERM 젊은 연구자 보조금 (D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT 및 프레임 프로그램 Investissements d' Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02)에 따라 ANR이 관리하는 프랑스 국가 기금에 의해 전달되었습니다. J.R.은 Université franco-allemande 및 Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation의 프로그램 CDFA-07-22와 Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI)의 K.G.의 지원을 받았습니다.

Satellite Cell from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis (마우스 사지 근육에서 위성 세포 분리 및 유세포 분석)

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
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<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
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<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
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<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
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<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

본 연구는 마우스 위성 세포의 분리 및 배양을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법과 CUT&RUN 방법에 의한 전사 조절 평가를 보고합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 근육 파괴와 섬유질 소화를 통해 많은 수의 세포를 수집할 수 있도록 하는 것입니다. 효소 농도가 증가했음에도 불구하고, 프로토콜 1을 사용한 것보다 더 많은 살아있는 세포를 얻었다. 위성 세포는 다양한 막 단백질의 특정 패턴을 발현합니다. 분류의 엄격성을 높이기 위해, 앞서 설명한 음성(CD31, TER119, CD45 및 CD11b) 및 양성(CD34, ITGA7 및 CXCR4) 위성 셀 마커(30,31)의 조합을 사용했습니다. 이 전략을 사용하여 살아있는 추정 위성 세포의 평균 1%를 얻었습니다. 이 결과는 위성 세포가 생쥐<sup class="xref"...

골격근은 평균 인체 전체 체중의 40%를 차지한다1. 근섬유는 손상 시 현저한 재생 능력을 나타내는데, 이는 새로 형성된 근세포의 융합과 손상된 근섬유를 대체하는 새로운 근섬유의 생성으로 설명된다2. 1961년, 알렉산더 마우로(Alexander Mauro)는 위성 세포(satellite cell)라고 명명한 단핵 세포(mononuclear cell)의 집단을 보고했다.3 이들 줄기세포는 전사인자 쌍을 이루는 상자7(PAX7)을 발현하며, 근섬유의 기저층(basal lamina)과 근섬유(sarcolemma) 사이에위치한다4. 이들은 분화 클러스터 34(CD34, 조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포 마커), 인테그린 알파 7(ITGA7, 부드러운 심장 및 골격근 마커) 및 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4, 림프구, 조혈 및 위성 세포 마커)5를 발현하는 것으로 보고되었습니다. 기초 조건에서, 위성 세포는 정지 상태를 유지하는 특정 미세환경에 상주한다6. 근육이 손상되면 근육이 활성화되고 증식하며 근육 형성을 겪는다7. 그러나 전체 근육 세포 수의 극히 일부에만 기여하기 때문에 게놈 전체 분석은 특히 생리학적 환경(전체 세포의 <1%)에서 특히 까다롭습니다.
위성 세포로부터 염색질 분리를 위한 다양한 방법이 설명되었는데, 이는 염색질 면역침전 후 대규모 병렬 염기서열분석(ChIP-seq) 또는 표적 및 태깅 하에서의 절단(CUT&Tag) 실험을 포함합니다. 그럼에도 불구하고 이 두 가지 기술에는 도전하지 않은 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 실제로, ChIP-seq는 충분한 염색질을 생성하기 위해 많은 양의 출발 물질을 필요로하며, 그 중 상당 부분은 초음파 처리 단계에서 손실됩니다. CUT&Tag는 낮은 세포 수에 더 적합하지만 Tn5 전이효소 활성으로 인해 ChIP-seq보다 더 많은 off-target 절단 부위를 생성합니다. 또한, 이 효소는 개방 염색질 영역에 대한 친화력이 높기 때문에 침묵된 헤테로크로마틴 8,9 대신 게놈의 능동적으로 전사된 영역과 관련된 히스톤 변형 또는 전사 인자를 분석하기 위해 CUT&Tag 접근법을 우선적으로 사용할 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 뉴클레아제(CUT&RUN)10,11 분석을 사용하여 표적 아래 절단 및 방출을 위해 FACS에 의해 마우스 사지 근육 위성 세포를 분리할 수 있는 자세한 프로토콜입니다. 다양한 단계에는 조직의 기계적 파괴, 세포 분류 및 핵 분리가 포함됩니다. 생존 가능한 세포 현탁액의 제조와 관련하여이 방법의 효율성은 공유 히스톤 변형 및 전사 인자에 대한 CUT &RUN 분석을 수행하여 입증되었습니다. 분리된 세포의 품질은 기술된 방법을 본래의 게놈 점유 상태를 충실하게 포착하는 염색질 제조에 특히 매력적으로 만들고, 특이적 유전자좌(4C-seq) 또는 게놈 전체 수준(Hi-C)에서 고처리량 시퀀싱과 함께 염색체 형태를 포착하는 데 적합할 가능성이 높다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 마이크로튜브</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 튜브</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>항-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>항-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>항-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>항-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>항-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>항-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>항-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>항-H3K27ac</td><td>활성 모티프</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>항-H3K4me2</td><td>활성 모티프</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>항-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>항-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>항-TER119</td><td>BD Pharmingen TM553673</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>구슬</td><td>폴리사이언스</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; 플러스 Concanavalin A</td></tr><tr><td>세포 스트레이너 100 & micro; m</td><td>코닝&reg; &nbsp;</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 40 & 마이크로; m</td><td>코닝&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 70 & 마이크로; m</td><td>코닝&reg; &nbsp;</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>원심분리기 5415 R</td></tr><tr><td>원심분리기 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>원심분리기 5804 R</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드 시스템&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>시스템 및 무덤; 나 Nunc&trade; Lab-Tek&무역; 챔버 슬라이드</td></tr><tr><td>세척제</td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>콜라게나제, 유형 I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>디스페이스&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>고정 가능한 생존율 염색</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD FACSAria&trade; 융합 유세포 분석기</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td>게놈 브라우저<td>가 포함된 형광 마운트 G</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>글리세롤&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>하이드로겔</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>이미지 J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>실험실 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>프로필 갈레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>시퀀서&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>흔들리는 수조</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

facs 분리 마우스 위성 세포의 cut&amp;run 분석을 위한 효율적인 프로토콜

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

작은 세포 집단을 사용한 게놈 전체 분석은 특히 줄기 세포 분야에서 연구의 주요 제약 조건입니다. 이 연구는 구조 단백질 함량이 높은 조직인 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 성인 마우스에서 절개된 사지 근육은 dispase 및 type I 콜라겐분해효소가 보충된 배지에서 다져서 기계적으로 파괴되었습니다. 분해 시, 균질액을 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 세포를 FACS 완충액에 현탁시켰다. 생존율은 고정 가능한 생존도 염색으로 측정하고, 면역염색된 위성 세포는 FACS로 분리했습니다. 세포를 Triton X-100으로 용해시키고 방출된 핵을 콘카나발린 A 자성 비드에 결합시켰습니다. 핵/비드 복합체는 전사 인자 또는 관심 히스톤 변형에 대한 항체와 함께 배양되었습니다. 세척 후, 핵/비드 복합체를 단백질 A-마이크로코커스 뉴클레아제로 배양하고, 염색질 절단은 CaCl2로 개시하였다. DNA 추출 후, 라이브러리를 생성하고 서열을 분석하고, 생물정보학 분석을 통해 게놈 전체 전사 인자 결합 및 공유 히스톤 변형에 대한 프로파일을 얻었다. 다양한 히스톤 마크에 대해 얻은 피크는 결합 이벤트가 위성 세포에 특이적임을 보여주었습니다. 또한, 알려진 모티프 분석은 전사 인자가 동족 반응 요소를 통해 염색질에 결합되어 있음을 밝혔습니다. 따라서 이 프로토콜은 성체 마우스 사지 근육 위성 세포의 유전자 조절을 연구하는 데 적합합니다.

마우스 골격근으로부터의 위성 세포는 Gunther et al.(이하, 프로토콜 1)12 및 Liu et al.23 (이하 프로토콜 2)의 프로토콜을 결합하여 분리하였다. 프로토콜 1에서 제안된 콜라겐분해효소 및 디스파아제의 농도를 사용할 때 소화되지 않은 근섬유가 소화 후에 관찰되었기 때문에, 단계 1.2.1 및 1.2.3에 기술된 바와 같이 근섬유 해리를 개선하기 위해 효소의 양을 증가시켰다. 프로토콜 2에 표시된 바와 같이, 샘플은 세포 생존력을 유지하기 위해 수조에서 부드러운 교반을 거쳤습니다. 프로토콜 1에서 언급한 바와 같이 세포 스트레이너를 통한 여과 및 적혈구 용해 완충액으로 배양을 수행했습니다(1.2.7-1.2.10단계 참조). 프로토콜 1에서는 세포를 30%/70%의 Percoll 밀도 구배로 로드하여 간기에서 단핵 세포를 분리했으며, 이는 관심 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 따라서 이 단계는 프로토콜 2에서 제안된 대로 ...

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

20년 이상 동안 우리 연구실은 핵 수용체의 병태생리학적 역할에 관심을 가지고 있습니다. 생체 내 기능을 해독하기 위해 우리는 발현의 공간적, 시간적 제어를 허용하는 마우스 모델을 설계했습니다. 이와 동시에 쥐 조직에서 분자 기능을 조사하는 최첨단 기술을 개발했습니다.우리의 과학적인 관심은 최근 골격근을 포함한 다양한 조직에서 세코스테로이드 및 스테로이드 수용체 신호 전달을 결정하도록 이끌었습니다. 우리는 최근에 골격근의 세포를 분화하는 근섬유의 안드로겐 수용체가 수축 및 대사 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 입증했습니다. 우리의 최근 발견은 근육 관련 장애에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요한 골격근 병태생리학적 역학에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다.우리는 생체 내에서 근육 줄기 세포에 대한 시스트롬 분석을 수행할 수 있도록 이 프로토콜을 개발했습니다. 이전의 모든 프로토콜은 시험관 내 모달을 사용하여 전체 유기체 맥락에서 조사를 완전히 분리합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 시간 효율적일 뿐만 아니라 골격근 전구 세포에서 전사 인자 모집 및 염색질 환경을 연구하기 위한 효과적인 실험 환경을 제공합니다.이 프로토콜로 준비된 크로마틴은 위성 세포에서 AR 시스트롬의 첫 번째 게놈 전체 분석을 제공했으며 유전자 조절에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것입니다. 많은 것들 중에서, 우리의 미래 목표는 이러한 연구를 다른 옥소스테로이드 수용체로 확장하고 골격근의 재생 과정에 관여하는 다양한 세포 유형에서 특정 공동 조절자를 탐구하는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

마우스 모델을 사용하면 부정맥 발생의 주요 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이를 위해 패치 클램프 측정을 수행하기 위해 고품질 심근 세포가 필요합니다. 여기에서는 역행 효소 기반 Langendorff 관류를 통해 쥐 심방 및 심실 근세포를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 칼슘 과도 현상과 L형 칼슘 전류를 동시에 측정할 수 있습니다.

Ca2+ 과도 현상 및 L형 칼슘 전류의 동시 측정을 위한 고품질 쥐 심방 및 심실 근세포의 분리

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

CUT&amp;RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&amp;RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.

교란되지 않고 손상된 마우스 골격근에서 섬유 지방 형성 전구 세포 및 근육 줄기 세포의 FACS 분리 및 배양

후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&amp;Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&amp;Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&amp;Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&#38;Tagmentation) 분석 사용

이 프로토콜은 HEK-293T 세포에서 NHEJ 및 HR의 효율성을 정량화하기 위한 염색체 외 비상동 말단 결합(NHEJ) 분석 및 상동 재조합(HR) 분석을 설명합니다.

GFP 기반 리포터 시스템을 사용한 HEK-293T 세포의 비상동성 말단 접합 및 상동 재조합 효율 분석

scRNA-seq의 요구를 충족하는 마우스 뇌 피질 주리세포를 얻기 위해, CD13⁺/CD31⁻ 선택을 기반으로 한 비판적으로 최적화된 FACS 프로토콜을 제시합니다. 주요 개선점은 세포 생존력과 RNA 무결성을 크게 향상시켜 신뢰할 수 있는 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다.

FACS를 이용한 쥐 피질 조직에서 주리세포 분리 단세포 시퀀싱

이 프로토콜은 조직 해리, 순차적 여과, 사전 플레이트 및 정의된 배양 조건을 통해 성체 및 신생아 마우스 골격근에서 1차 근모세포를 분리하고 농축하는 표준화된 방법을 제공하여, 위성 세포 유래 근아세포 배양을 하위 실험 응용으로 구축하고 유지할 수 있게 합니다.

시험관 내 근형성 연구를 위한 골격근 위성 세포 분리

배우세요 마우스 위성 세포의 FACS 분리 및 CUT&RUN 분석 프로토콜을 통해 골격근 전사 조절 메커니즘을 연구하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 근육 줄기세포의 유전자 발현과 핵 수용체 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

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