Name: In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 포유류 아연 수송체의 기능적 특성을 In Vitro Zinc Transport Assay로 분석하는 방법을. HEK293T 세포와 형광 현미경을 활용하여 ZnT-1 단백질의 아연 수송 역할을 실시간으로 측정하고 조절 메커니즘을 규명합니다.

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Raz Zarivach는 이스라엘 과학 재단(보조금 번호 163/22)의 지원을 받습니다. 토머 엘리 벤 요세프(Tomer Eli Ben Yosef)와 아리 모란(Arie Moran)은 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation, 보조금 번호 2047/20)의 지원을 받고 있습니다. 벤구리온 대학교의 Daniel Gitler와 그의 그룹의 협력, 지원 및 전문 지식에 감사드립니다.

1. 세포 transfection
<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 세포를 37°C/5%CO2 의 가습 인큐베이터에서 10cm 플레이트(8.8 x 10 총6 개 세포)에 합류할 때까지 HEK293T배양합니다.</li>
	<li>13웰 플레이트의 각 웰에 12mm 커버슬립을 하나씩 놓습니다. 1.1단계의 0.44 x 106 트립신 세포를 12mL의 완전한 DMEM에 희석합니다. 피펫팅을 3-5회 위아래로 하여 잘 섞습니다. 각 웰에 1mL의 혼합 용액을 채웁니다. 37 °C / 5 % CO2 의 가습 인큐베이터에서 밤새 성장합니다.</li>
	<li>각 웰의 전체 DMEM을 각 웰의 1mL의 무혈청 DMEM( 재료 표 참조)으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.</li>
	<li>각 transfection well에 대해 mCherry 형광 단백질(보충 파일 1)로 태그된 관심 단백질을 포함하는 pAAV2 플라스미드 1μg을 1.5mL 튜브에 있는 100μL의 무혈청 DMEM에 희석합니다.</li>
	<li>transfection당 3μg의 폴리에틸렌이민(PEI, 재료 표 참조)을 100μL의 무혈청 DMEM에 추가하고, 각 transfection을 다른 1.5mL 튜브에 넣습니다. 플라스미드:PEI 비율은 1:3 (μg:μg)이어야 합니다.</li>
	<li>1.4단계와 1.5단계에서 두 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 5분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>1.4단계의 DNA 용액 1부(웰당 100μL)와 1.5단계의 PEI 용액 1부(웰당 100μL)를 혼합합니다. 최종 용액을 10초 동안 소용돌이치고 실온에서 최소 20분, 최대 6시간 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 12웰 플레이트를 꺼냅니다. 1.7 단계의 최종 용액을 소용돌이 치고, 1.3 단계의 12 웰 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가합니다. 12웰 플레이트를 가습 인큐베이터로 되돌립니다(1.1단계).</li>
	<li>3시간 후 각 웰의 배지를 1mL의 완전한 DMEM으로 교체합니다. 12웰 플레이트를 1.1단계와 같이 가습 인큐베이터로 되돌립니다.</li>
	<li>2일 후 37°C/5%CO2 인큐베이터에서 형질주입된 세포 배양을 10배 배율로 도립 형광 현미경에 놓습니다.</li>
	<li>현미경 초점 휠을 사용하여 명시야광을 사용하면서 세포에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>형광 mCherry 여기(587nm) 및 방출(610nm) 파장으로 전환하고 명시야광을 끕니다. ZnT1 mCherry의 발현을 확인하기 위해 세포의 형광을 확인합니다.</li>
	<li>염료 로딩 용액을 준비합니다.<ol><li>−20 °C 냉동고에 보관된 차광 스톡에서 DMSO(1 μg/μL)에 용해된 아세톡시메틸(AM) 에스테르 형태의 아연 특이적 형광 염료 4μL( 재료 표 참조)의 부분 표본을 채취합니다. 이 형태는 염료가 단순 확산을 통해 원형질막을 통해 세포로 들어갈 수 있도록 합니다.</li>
		<li>4 μL의 10% 플루론산(또는 2μL의 20% 플루론산, 재료 표 참조)을 단계 1.13.1의 부분 표본에 추가합니다. 피펫팅을 위아래로 세 번 하여 용액을 잘 섞은 다음 8μL를 모두 1.5mL 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>1.13.2단계에서 1mg/mL(~0.1%)의 소 혈청 알부민이 보충된 750μL의 링거 용액(사내 준비, 조성은 재료 표 참조)을 튜브에 넣고 세게 소용돌이칩니다. 동일한 용액 750 μL를 더 추가하고 다시 와류하여 최대 혼합을 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1.13.3단계의 최종 용액 750μL를 새로운 6웰 배양 플레이트의 두 웰에 추가합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 알림: 표백을 방지하기 위해 6웰 플레이트는 항상 이 단계에서 알루미늄 호일로 덮여 있습니다.</li>
	<li>미세한 핀셋을 사용하여 transfection된 세포 배양 플레이트에서 최대 4개의 복제 커버슬립을 가져와서 1.14단계에서 새로운 6웰 플레이트의 첫 번째 채워진 웰(웰당 최대 4개의 슬라이드)에 놓습니다. 두 번째로 채워진 웰에 대해 이 과정을 반복합니다. 알림: 동일한 충전 우물의 모든 커버슬립은 동일한 상태여야 합니다. 그러나 각 우물에는 서로 다른 조건이 포함될 수 있습니다.</li>
	<li>알루미늄 호일로 덮고 15-20분 동안 부드럽게 흔듭니다.</li>
	<li>염료 로딩 용액을 제거하고 1.13.3단계에서 사용한 대로 Ringer's plus 알부민의 새 세척 용액으로 교체합니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오. 20분 동안 다시 흔들어 줍니다. 이것은 세포 내 에스테라아제에 의한 AM 에스테르의 절단을 허용합니다.</li>
</ol>2. 현미경 준비
<ol><li>GFP 및 mCherry 형광단을 검출할 수 있는 도립 형광 현미경, 최소 두 개의 용액 사이를 전환할 수 있는 관류 시스템, 흡입 시스템 및 관류 챔버 등 필요한 도구( 재료 표 참조)를 준비합니다.</li>
	<li>현미경, 현미경 광원 및 카메라를 켭니다. 흡입 시스템을 켭니다.</li>
	<li>관류 시스템을 세척하십시오. 첫 번째 챔버를 Ringer 용액으로 세척하고 두 번째 챔버를 7μM 피리티온(아연 이온단, 재료 표 참조)이 보충된 7μM 아연 용액을 포함하는 Ringer 용액으로 세척합니다. 기포나 틈을 방지하려면 각 챔버에 약간의 액체를 남겨 두십시오. 알림: 두 용기 모두 관류 챔버에 연결된 동일한 튜브에 연결되어 있으므로 항상 공유 세그먼트가 Ringer 용액으로 세척되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>탭을 닫고 2.3단계에서와 같이 적절한 챔버를 Ringer의 용액과 Ringer의 아연 용액으로 채웁니다.</li>
</ol>3. 샘플 준비
<ol><li>관류 챔버를 가져 와서 홈의 좁은면이 위를 향하도록 놓습니다. 알림: 홈은 관류 챔버 중간에 있는 구멍입니다. 관류액이 세포에 접근할 수 있습니다. 홈의 한쪽은 좁고 반대쪽은 넓습니다.</li>
	<li>홈 주위에 밀봉 실리콘( 재료 표 참조)을 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 홈에서 밀봉 실리콘을 청소합니다. 알림: 홈 주위에 22mm 커버슬립을 밀봉하기에 충분한 실리콘 씰이 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>미세한 핀셋을 사용하여 세척액에서 커버슬립을 꺼내 셀이 아래를 향하도록 홈 위에 놓습니다. 이렇게 하면 세포가 실험 중에 홈을 관류하는 용액에 노출됩니다.</li>
	<li>22mm 커버슬립 위에 13mm 커버슬립을 놓고 핀셋을 사용하여 조입니다. 커버슬립이 깨지지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>챔버를 뒤집고 눌러 현재의 모든 액체를 방출합니다. 홈에 100μL의 링거 세척액을 채우고 누출이 없도록 다시 누릅니다. 알림: 누출이 감지되면 누출 부위에 밀봉제를 도포하고 다시 테스트하십시오.</li>
	<li>관류 챔버를 플랫폼에 장착하고 고정합니다. 관류 및 흡입 튜브를 배치하여 홈의 세포 위에 관류를 허용합니다.</li>
	<li>관류 속도를 약 2mL/분으로 변경하고 링거 용액의 관류를 켭니다. 관류 시스템이 누출이나 유출 없이 작동하는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 측정 준비
<ol><li>아이콘을 두 번 클릭하여 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 엽니다. 관련 자격 증명으로 로그인합니다. 부착된 카메라를 선택하고 OK를 누릅니다.</li>
	<li>현미경 왼쪽에 있는 버튼을 사용하여 현미경 배율을 10배로 설정합니다.</li>
	<li>라이브 뷰를 선택하고 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 이동하여 홈의 셀에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>관류가 켜져 있는 동안 조명을 끄고 인터페이스의 전용 버튼을 눌러 파장을 mCherry로 변경합니다. 현미경 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다.</li>
	<li>현미경이 세포에 초점을 맞추면 조이스틱을 사용하여 플랫폼을 움직여 적절한 세포 패치를 선택할 수 있습니다. 참고: 적합한 영역은 ROI를 위한 최소 10개의 셀과 배경을 위한 빈 영역이 있는 영역으로 간주됩니다.</li>
	<li>ROI 켜기/끄기(Turn ROIs On/Off) 드롭다운 메뉴를 선택하고 순환 ROI 그리기(Draw Circular ROIs)를 선택합니다.</li>
	<li>mCherry 발현 세포를 사용하여 세포 클러스터의 ROI를 그립니다(ZnT1의 발현을 나타냄).</li>
	<li>4.6단계와 동일한 도구 모음에서 배경 ROI 켜기/끄기 버튼을 클릭하고 배경 ROI 의 위치와 크기를 셀이 전혀 없는 영역으로 조정합니다.<ol><li>mCherry 및 EGFP 파장을 확인하여 선택한 배경 ROI에 세포가 없는지 확인합니다. 참고: mCherry는 520nm의 여기 파장과 610nm의 방출 파장을 사용하고 EGFP는 470nm의 여기 파장과 520nm의 방출 파장을 사용하도록 파장을 조정했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>파장(λ) 하위 탭을 선택합니다. 확인란을 선택하고 GFP 파장이 있고 확인란이 표시되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 추가하고 표시하십시오.</li>
	<li>기간 하위 탭을 선택합니다. 측정 구간을 5초마다로 정의하고, 실험 기간에 맞게 구간 수를 변경합니다.</li>
	<li>접안렌즈 아래 현미경 패널의 초점 섹션에서 켜기 버튼을 클릭하여 완벽한 초점 시스템(PFS)을 활성화합니다.</li>
	<li>PFS 초점 휠을 사용하여 초점을 조정합니다. 소프트웨어 인터페이스의 ND Acquisition( ND 획득)에서 PFS on(PFS 켜기) 이 선택되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>Run now(지금 실행)를 클릭합니다.</li>
</ol>5. 실험 절차
<ol><li>Ringer의 용액 관류를 사용하여 90초 기준 주기 측정으로 시작합니다.</li>
	<li>기준선 기간이 끝나면 Ringer's solution perfusion을 끈 다음 Ringer's zinc solution perfusion을 켭니다. 기본 인터페이스 패널의 오른쪽 하단에 있는 빨간색 플래그를 클릭하여 솔루션 전환을 표시합니다. 형광의 상승이 나타날 것으로 예상됩니다.</li>
	<li>형광 상승이 포화되기 시작하면 Ringer의 용액을 사용하여 관류로 다시 변경합니다. Ringer의 아연 용액 관류를 끈 다음 Ringer의 용액 관류를 켭니다.</li>
	<li>실험 시간이 만료될 때까지 기다립니다. ZnT1이 제대로 작동하는 경우 형광이 눈에 띄지만 꾸준히 감소할 것으로 예상됩니다.</li>
</ol>6. 데이터 내보내기
<ol><li>기준선 빼기로 데이터를 내보내려면 기준선 빼기 버튼을 누르고 "ND 획득 창"에서 변경 사항을 확인합니다.</li>
	<li>"ND acquisition window"의 소프트웨어 인터페이스에서 Export 버튼을 클릭합니다. Excel 데이터시트가 열립니다. 원하는 위치에 저장합니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>각 ROI에 대해 처음 90-100초의 평균 기준 형광을 생성합니다.</li>
	<li>각 ROI에 대해 계산된 형광을 해당 ROI에 대한 배경의 백분율로 표현합니다.</li>
	<li>모든 ROI의 행 평균을 만들고 결과를 선 그래프로 플로팅합니다. 이렇게 하면 모든 ROI의 평균이 시간 함수로 생성됩니다.</li>
	<li>선형 맞춤 기능을 사용하여 Ringer의 용액으로 세척한 후 형광 감소에 대한 초기 속도를 선택합니다. 방정식의 기울기 값은 전송 속도와 상관 관계가 있습니다.</li>
</ol>

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay(FluoZin-3 분석을 통한 포유류 세포의 아연 수송 메커니즘 조사)

<ol><li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li>
<li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron%2C+zinc%2C+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li>
<li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Biochemistry%3A+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li>
<li>Kimura, T., Kambe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+metallothionein+and+ZIP+and+ZnT+transporters%3A+An+overview+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336(2016).</li>
<li>Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+ZIP+and+ZnT+zinc+transporters+in+human+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).</li>
<li>Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological%2C+biochemical%2C+and+molecular+roles+of+zinc+transporters+in+zinc+homeostasis+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).</li>
<li>Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+transporters+as+potential+therapeutic+targets%3A+An+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).</li>
<li>Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+transporters+and+their+functional+integration+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100320(2021).</li>
<li>Huang, L., Tepaamorndech, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC30+family+of+zinc+transporters+-+A+review+of+current+understanding+of+their+biological+and+pathophysiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).</li>
<li>Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+zinc+transporter+protein-1+%28ZnT-1%29+in+the+brain+of+subjects+with+mild+cognitive+impairment%2C+early%2C+and+late-stage+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease.</a> Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).</li>
<li>Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+zinc+transporter+proteins+ZnT-1%2C+ZnT-4+and+ZnT-6+in+preclinical+Alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain.</a> Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).</li>
<li>Tsuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+zinc+transporter+gene%2C+ZnT-1%2C+is+induced+after+transient+forebrain+ischemia+in+the+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).</li>
<li>Palmiter, R. d, Findley, S. d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+characterization+of+a+mammalian+zinc+transporter+that+confers+resistance+to+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc.</a> The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).</li>
<li>Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+overview+of+the+zinc+transporters+in+the+cation+diffusion+facilitator+family%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).</li>
<li>Shapiro, S. S., Wilk, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+variance+test+for+normality+%28complete+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrika%22%5BJournal%5D)">An analysis of variance test for normality (complete samples).</a> Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).</li>
<li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+a+test+of+whether+one+of+two+random+variables+is+stochastically+larger+than+the+other%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li>
<li>Darling, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov%2C+Cramer-von+Mises+tests%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Mathematical+Statistics%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests.</a> The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+zinc+in+living+cells.%3A+A+new+generation+of+sensitive+and+selective+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes.</a> Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).</li>
<li>Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+fluorescent+zinc+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial fluorescent zinc sensor.</a> Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).</li>
<li>Hessels, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eZinCh-2%3A+A+versatile%2C+genetically+encoded+FRET+sensor+for+cytosolic+and+intraorganelle+Zn2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging.</a> ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).</li>
<li>Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsphere-based+real-time+calcium+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microsphere-based real-time calcium sensing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).</li>
<li>Namdarghanbari, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+the+zinc+sensor+FluoZin-3+with+Zn7-metallothionein%3A+Inquiry+into+the+existence+of+a+proposed+weak+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).</li>
<li>Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+intracellular+free+calcium+and+zinc+using+fura-2FF+and+FluoZin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3.</a> Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

상술한 방법은 높은 시간적 분해능으로 세포내 아연 농도를 직접 측정할 수 있게 한다. 다른 방법과 비교하여, 세포 내Zn2+의 변화를 모니터링하는 이 방법은 배경 소음을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 또한, 아연에 대한 염료의 선택성은 다른 금속 양이온과의 잠재적인 교차 상호작용을 제거한다(18,19). 마지막으로, 즉각적인 세포 독성이 없기 때문에 살아있는 세포 과정의 테스트를 가능하게합니다 19.
그러나 이 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 방법에 사용된 염료는 세포에 갇히도록 설계되었지만 영역이나 특정 프로세스로 유도할 수 없기 때문에 이 프로토콜을 사용하면 세포 내 역학을 검출하는 것이 상대적으로 더 어려울 수 있습니다. 다른 형광 염료는 세포 내의 특정 영역으로 유도될 수 있지만, 불행히도 ...

아연은 세포 환경에서 필수적인 미량 원소입니다. 그것은 모든 단백질의 1/3을 포함하며 촉매작용 1, 전사2 및 구조 모티프3와 같은 다양한 세포 과정에 관여합니다. 그러나 산화 환원 불활성임에도 불구하고 높은 아연 농도는 세포에 독성이 있기 때문에 아연 항상성을 조절하는 메커니즘이 없으면 포유류 유기체가 생존하지 못했습니다. 포유류에서는 세 가지 메커니즘이 이 과정을 담당합니다: (1) 높은 친화력으로 아연과 결합하여 과도한 유리 세포질 아연을 방지하는 세포질 시스테인이 풍부한 단백질인 메탈로티오닌4; (2) Zrt/Irt 유사 단백질(ZIP)은 원형질막 또는 세포 내 소기관을 통해 세포질로 아연 유입을 담당하는 아연 수송체입니다 4,5,6,7,8; (3) ZnT는 유비쿼터스 양이온 확산 촉진제(CDF) 계열의 포유류 하위 집합이며 세포질에서 원형질막을 가로질러 또는 세포 내 소기관으로 아연을 압출할 때 아연 수송체입니다(4,5,6,7,8,9). 세포 대사에 대한 아연의 중요성으로 인해 세포 아연의 역학을 이해하는 것이 중요합니다.
아연 역학을 평가하는 이전 방법은 고정 조직 또는 세포의 세포 아연 측정과 상관 관계를 맺어 다양한 아연 조건에서 mRNA의 발현 수준을 평가하는 데 의존했습니다10,11,12. 이러한 방법에는 화학적 검출 및 면역조직화학 염색이 포함됩니다. 그러나 이러한 방법은 간접적인 측정만 수행하므로 세포 내 아연 농도와 아연 수송체의 발현 사이의 오프라인 상관관계만 결정합니다. 따라서 이러한 방법은 높은 시간 분해능이 필요한 매개 변수를 유추할 수 없습니다.
Zn2+ 수송에 대한 보다 직접적인 측정은 아연13의 방사성 동위원소를 사용합니다. 이 방법은 아연 수송 및 그 반응 속도를 모니터링하기 위해 방사성 표지된 Zn2+ 의 측정에 의존합니다. 그러나 세포 항상성에 대한 아연의 중요성으로 인해 여러 세포 과정이 세포 내 아연 농도를 조절합니다. 이 중에는 세포 외 결합과 세포 내 Zn2+ 수준의 엄격한 제어를 유지하기 위해 함께 작동하는 여러 수송 시스템이 있습니다. 이러한 공정의 조합은 상당한 배경 소음을 발생시켜 개별 아연 관련 수송 기능을 테스트하기 어렵게 만듭니다.
이 기사에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 사용하여 세포 내 유리 아연 농도를 측정하여 아연 수송 속도를 직접 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 염료는 Zn2+ 에 대한 특이성이 높고 칼슘과 같은 다른 2가 양이온의 간섭이 거의 없습니다. 또한 에스테르 형태에서는 비이온성 확산에 의해 세포에 들어간 다음 세포 내 디에스테라아제의 활성으로 인해 갇히게 됩니다. 따라서 형광은 주로 유리 세포질 아연 농도와 관련이 있습니다. 이 실험은 ZnT 계열의 구성원인 아연 수송체 1(ZnT1)의 구조-기능 관계를 연구하기 위해 수행되었습니다.

<table><tbody><tr><td>10cm 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>13mm 커버슬립</td><td>Superior Marienfeld</td><td>111530</td><td></td></tr><tr><td>22mm 커버 슬라이드</td><td>Superior Marienfeld</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>6웰 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>bioWorld</td><td>22070008</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 무수, 과립 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>C1016</td><td>Ringer 용액 농도 : 1 mM</td></tr><tr><td>D-(+) -포도당</td><td>Glentham Life Science</td><td>GC6947</td><td>Ringer 용액 농도 : 10 mM</td></tr><tr><td>Dubelco ' s 수정 이글 미디어(DMEM)&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>TI-DH</td><td>제품 생산 중단 Eclipse Ti2</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Fine Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0203-55-PS</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM</td><td>Invitrogen</td><td>F24195</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td><td>Cytiva</td><td>SV30010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LED 조명 시스템</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>생물학 산업</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Merck</td><td>1.05833</td><td>링거 용액 농도 : 0.8 mM</td></tr><tr><td>N [2-Hydroxyethyl] piperazine-N '- [2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td> <td>Formedium</td><td>HEPES10</td><td>Ringer 용액 농도 : 10 mM</td></tr><tr><td>Neo 5.5 sCMOS 카메라</td><td>ANDOR</td><td>DC-152Q-FI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-ELEMENTS 이미징 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid F-127</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td></td></tr><tr><td>Pottasium chloride</td><td>Bio-Lab Bio-Lab</td><td></td><td>Ringer 용액의 163823 농도: 5.4mM</td></tr><tr><td>Pyrithione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3261</td><td>Ringer 아연 용액 농도: 7 &뮤; M</td></tr><tr><td>실리콘 그리스 키트</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>W4 64-0378</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Bio-Lab</td><td>190305</td><td>Ringer 용액 내 농도: 120 mM</td></tr><tr><td>황산 아연</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31665</td><td>Ringer 아연 용액 농도: 7 &mu; 미디엄</td></tr></tbody></table>

in vitro zinc transport assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Zn2+ 이온과 같은 전이 금속은 세포 독성으로 인해 엄격하게 조절되어야 합니다. 이전에는, Zn2+ 수송체의 활성은Zn2+의 상이한 농도 하에서 수송체의 발현 수준을 결정함으로써 간접적으로 측정되었다. 이는 면역조직화학을 이용하거나, 조직 내 mRNA를 측정하거나, 세포 Zn2+ 수준을 측정하여 수행되었습니다. 세포 내 Zn 2+ 센서의 개발로 아연 수송체의 활성은 현재 형광 프로브를 사용하여 검출된 세포 내 Zn 2+의 변화와 Zn2+ 수송체의 발현을 연관시킴으로써 주로 결정됩니다. 그러나 오늘날에도 세포 내 Zn2+의 동적 변화를 모니터링하고 이를 사용하여 아연 수송체의 활성을 직접 측정하는 실험실은 소수에 불과합니다. 문제의 일부는 ZnT10(망간 수송)을 제외한 ZnT 계열의 10개 아연 수송체 중 아연 수송체 1(ZnT1)만 원형질막에 국한되어 있다는 것입니다. 따라서 수송 활성을 세포 내 Zn2+ 농도의 변화와 연결하는 것은 어렵습니다. 이 글에서는 아연 특이적 형광 염료인 FluoZin-3을 기반으로 하는 분석을 사용하여 아연 수송 역학을 측정하는 직접적인 방법을 설명합니다. 이 염료는 에스테르 형태로 포유류 세포에 로드된 다음 세포 디에스테라제 활성으로 인해 세포질에 갇히게 됩니다. 세포는 Zn 2+ ionophore pyrithione을 사용하여 Zn2+로 로드됩니다. ZnT1 활성은 세포 세척 후 형광 감소의 선형 부분에서 평가됩니다. 470nm의 여기와 520nm의 방출에서 측정된 형광은 유리 세포 내 Zn2+에 비례합니다. mCherry 형광단으로 태그된 ZnT1을 발현하는 세포를 선택하면 수송체를 발현하는 세포만 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법은 세포에서 과잉 아연을 압출하는 진핵 세포막 관통 단백질인 인간 ZnT1의 수송 메커니즘에 대한 ZnT1 단백질의 다양한 영역의 기여도를 조사하는 데 사용됩니다.

ZnT1은 세포 원형질막(13) 상에 위치한 포유류 아연 수송체이다. 이는 세포질에서 세포외 밀리유(extracellular millieu)로 아연을 압출하는 양이온 확산 촉진제(cation diffusion facilitator, CDF) 단백질군의 일원이다14. ZnT1은 막을 가로질러 이온을 운반하는 막관통 도메인과 C-말단 도메인(14)의 두 가지 영역 아키텍처를 가지고 있습니다. 다른 알려진 CDF 단백질과 달리 ZnT1은 확장된 비구조화 C-말단 도메인(USCTD)을 가지고 있습니다. USCTD의 역할은 현재 알려져 있지 않습니다. 위의 프로토콜을 사용하여 ZnT1 WT를 USCTD 없이 ZnT1과 비교하여 아연 수송 활성에 대한 관여를 평가했습니다.
HEK 293T 세포는 구조화되지 않은 C-말단(ΔUSCTD) 없이 ZnT1 WT 또는 Zn...

아연 수송은 단백질 기능에 대한 인과 관계가 약하고 시간적 분해능이 낮기 때문에 측정하기 어려운 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 Zn 2+ 민감한 형광 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 높은 시간 분해능으로 Zn 2+ 압출을 모니터링하여 Zn2+ 유출을 직접 측정하는 방법을 설명합니다.

In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

저의 연구는 포유류 아연 수송체의 구조-기능 관계에 초점을 맞추고 있으며, 특히 조절 메커니즘에 중점을 두고 있습니다. 세포 기능에 대한 아연 이온의 중요성으로 인해 세포 아연 역학을 정확하게 측정하는 것은 어렵습니다. 당사의 프로토콜은 낮은 신호 대 잡음비와 아연 역학의 낮은 시간 분해능을 해결합니다.이 방법을 사용하면 세포막을 가로지르는 아연 유입을 테스트할 수 있으며, 높은 시간 분해능과 다른 2가 양이온에 의한 배경 노이즈 및 교차 상호 작용이 상당히 적습니다. 우리는 포유류 수송체 ZnT1 하나의 C-말단 도메인의 구조화되지 않은 확장이 아연 수송 기능에 관여하지 않는다는 것을 발견했습니다. 이를 통해 연구자들은 아연 수송 조절을 위한 ZnT1 단백질의 다른 영역에 집중할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, - galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

출처: Maurakis, S., et al. 금속 반응성 유전자의 특성화 및 숙주 리간드로부터의 금속 획득을 위한 Neisseria gonorrhoeae의 금속 제한 성장. J. Vis. 경험. (2020).이 비디오는 금속 반응 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석을 보여줍니다. 금속 고갈 배지에서 성장한 야생형 및 돌연변이 박테리아는 금속 리간드와 함께 배양되고 플레이트 리더를 사용하여 성장을 모니터링합니다. 금속이 고갈된 조건에서 야생형 박테리아는 금속 흡수와 성장을 가능하게 하는 표면 수용체를 발현하는 반면, 돌연변이체는 이 수용체가 부족하여 성장이 제한됩니다.

금속 반응성 유전자의 역할을 연구하기 위한 금속 제한 박테리아 성장 분석

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

기본 바인딩 파트너, 컨텍스트 및 x 선 형광 및 radiometal 통풍 관을 제시 하 여 기판 내용물의 생물 특성 periplasmic 전이 금속 보호자의 추출에 대 한 프로토콜.

그램 음성 박테리아에 필수 금속 통풍 관: 형광, Radioisotopes, x 선 및 세포 분별 법

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

배양 된 일차 또는 확립 된 세포 주는 일반적으로 동물 모델을 사용 하기 전에 초기 접근법으로 서 근본적인 생물학적 및 기계적 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 아연 (Zn) 및 원자 흡 광도 분광학이 있는 다른 미 량 원소 연구를 위해 전체 세포 추출 물과 세포 분 획을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

이 문서에서는 대서양 연어의 미세 미네랄 가용성을 평가하기 위한 체계적인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 방법론은 생물학적 복잡성이 증가하는 도구와 모델을 포함한다: (1) 화학적 분화 분석, (2) 체외 용해도, (3) 세포주에서의 섭취 연구, (4) 생체 내 어류 연구.

대서양 연어의 아연의 예로 입증 된 보완 적 방법을 사용하여 물고기 사료의 미네랄 가용성 평가

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

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이 프로토콜은 마이코박테리아에서 Zn2+ 제한 리보솜을 생성하기 위한 Zn2+ 제한 배지, 성장 혈관 및 종자 배양의 준비를 자세히 설명합니다. Zn2+의 흔적은 Zn2+ 제한 성장으로 이어지며 모델 박테리아, Mycobacterium smegmatis 및 인간 병원체 M. tuberculosis에서 체외에서 Zn2+ 제한을 확인하기 위한 생물 지표로 사용되는 형태 생성 특징을 설명합니다.

Mycobacterium smegmatis를 Mycobacteria의 아연 제한 성장 조건에 대한 생물 지표로 사용

배우세요 포유류 아연 수송체의 기능적 특성을 In Vitro Zinc Transport Assay로 분석하는 방법을. HEK293T 세포와 형광 현미경을 활용하여 ZnT-1 단백질의 아연 수송 역할을 실시간으로 측정하고 조절 메커니즘을 규명합니다.

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