Name: 혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 MicroSiM 장치를 활용한 혈액-뇌 장벽 조직 칩 모델링 방법입니다. 인간 유도만능줄기세포를 사용하여 패혈증이 뇌 기능에 미치는 영향과 유전적 요인의 기여도를 평가하는 이 기법은 신경과학 연구에 활용됩니다.

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J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. 및 L.W.는 NIH 보조금 R33 HL154249로 자금을 지원받았습니다. J.L.M.은 R44 GM137651에서 자금을 지원받았습니다. M.M.은 로체스터 대학의 Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience에서 자금을 지원받았습니다. M.T.는 RF1 AG079138에서 자금을 지원받았습니다. K.C.는 국제윤리연구재단(International Foundation for Ethical Research)의 지원을 받았습니다.

면역형광 염색을 통한 혈액-뇌장벽 모델 분석

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J.L.M.은 SiMPore의 공동 설립자이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. SiMPore는 이 연구에 사용된 멤브레인을 포함한 초박형 실리콘 기반 기술을 상용화하고 있습니다.

멤브레인 칩은 안정성을 위해 설계되었지만 조립 중에 잘못 취급하면 균열이 생기거나 파손될 수 있습니다. 따라서 칩 핀셋 노치에 칩을 잡고 고정 장치에 부드럽게 놓는 것이 중요합니다. 일반적으로 장치를 취급할 때 장치를 부딪히거나 떨어뜨리지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. 멤브레인 칩을 고정구 A1에 접합하는 동안 칩을 평평하게 배치하고 고정구 A1의 기둥 중앙에 배치하여 부품 1에 접합하는 동안 멤브레인 균열을 방지해야 합니다. 또한 보호 마스크를 제거한 후에는 노출된 PSA 층과의 접촉을 피해야 합니다. 보호 마스크를 제거한 후 부품 2를 취급할 때는 부품 가장자리를 따라 잡고 핀셋을 사용하여 PSA가 없는 삼각형 모서리를 잡는 것이 좋습니다.
가능한 BBB 모델에 대해 세포 배양 프로토콜이 설명되었지만, 여기에 설명된 BBB의 BMEC/주위 세포주위 공동 배양 모델은 생리학적 맥락 및 관심 있는 질문에 따라 충분하거나 불충분할 수 있습니다. 예를 들어, 면역 세포 이동은 주로 뇌의 모세혈관 후 정맥에서 일어난다41,42. 이 영역에서, 혈관 주위 공간은 BMEC/주위 세포 장벽을 성상교세포에 의해 확립된 신경교세포(glial limitans)로부터 분리합니다. 따라서, 모세혈관 후 정맥에서, 신경혈관 단위(NVU)는 물리적으로 분리된 두 개의 장벽을 직렬로 구성하며, 성상세포의 말단은 현재 모델에서 잘 표현되는 BMEC/주위 혈액 장벽과 직접 접촉하지 않습니다. 성상교세포 분비 인자가 혈액 장벽에 미치는 영향을 설명하는 NVU 모델이 목표인 경우, 혈관 주위 공간을 통해 용해성 인자 교환을 가능하게 하는 성상세포 구획을 장치에 추가할 수 있습니다. 이 예는 이전에 예시된 바 있으며(34) 3D '뇌' 구획에 있는 미세아교세포 및 뉴런과 같은 다른 세포를 포함하도록 확장될 수 있다. 플랫폼의 모듈식 아키텍처는 이러한 재구성을 달성하기 위해 간단한 조립 전략을 사용할 수 있도록 하여 플랫폼이 당면한 가설을 해결하는 데 필요한 만큼 단순하거나 복잡하도록 합니다. 각 세포 배양 설정; 그러나 새로운 세포주와 다중 배양에 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 질화규소 멤브레인의 특성으로 인해 조직 배양 플레이트와 비교하여 코팅 용액을 조정해야 할 수 있습니다. 피브로넥틴의 포함은 일반적으로 세포 부착 및 생존에 도움이 됩니다. 또한, 사용자는 내피 세포와 주위 세포를 반대 방향으로 배양할 수 있습니다. 이 경우, 예를 들어 투과성 측정이 이루어지고 해석되는 방식을 수정해야 할 수 있습니다. 그러나 이러한 유형의 문화에 대한 단계를 제공하는 것은 이 문서의 범위를 벗어납니다.
세포 배양 중에 직면할 수 있는 또 다른 문제는 장치가 표준 조직 배양 플레이트 및 플라스크에 비해 환경 변화에 더 민감할 수 있기 때문에 배지의 빠른 증발입니다. 과도한 증발이 보이거나 세포 성장이 느려지는 경우 정확한 설정을 보장하기 위해 모든 중요한 인큐베이터 파라미터를 측정해야 합니다. 세포 배양 챔버 내부에 놓인 조직 캡 또는 작은 페트리 접시에 더 많은 물을 추가하거나 배지를 더 자주 교환해야 합니다. 또한 기포가 하단 채널로 들어가 트렌치 다운 장치의 트렌치에 끼일 수 있습니다. 제거할 수 있지만 처음부터 거품을 추가하지 않는 것이 가장 쉽습니다. 이를 위해서는 피펫팅 배지를 하단 챔버로 피펫팅하기 전에 피펫 팁에 기포가 없거나 피펫 팁 끝에 공기가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 채널의 매체 증발로 인해 매체 표면과 포트 상단 사이에 틈이 생길 수 있습니다. 미디어가 반대쪽 포트의 표면에 도달할 때까지 소량의 미디어를 하나의 포트로 피펫할 수 있으며, 그 후 미디어는 반대쪽 포트에서 교환될 수 있습니다. hECSR 및 E6 + 10% FBS 배지는 수조에서 가열해서는 안 되지만 다른 매체는 기포 형성을 줄이기 위해 예열할 수 있습니다. 기포가 하단 챔버로 들어가면 채널을 통해 100μL를 빠르게 피펫팅하여 제거할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 챔버 사이의 오염 또는 장치 표면에 쏟아진 매체로 이어질 수 있습니다. 또한 세포층을 파괴할 수 있습니다. 또는 배지를 먼저 채널에서 제거한 다음 50μL 용량으로 다시 주입할 수 있습니다. 그러나 미디어를 먼저 제거하면 채널에 더 많은 기포가 형성될 수 있습니다. 기포가 멤브레인 영역 바로 아래에 있지 않으면 세포 배양에 영향을 주지 않고 채널에 남아 있을 수 있습니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 주위 세포의 부착 및 성장은 어려울 수 있습니다. 최적화된 파종 밀도를 사용하는 것은 생리학적으로 관련된 주위 세포 대 내피 세포 비율을 가진 층을 형성하는 데 필수적입니다. 또한, pericyte는 전단에 민감하기 때문에 채널의 모든 배지 교환은 세포를 보호하기 위해 매우 천천히 수행되어야 합니다. BPLC 배양의 경우 800μg/mL 콜라겐 유형 IV 또는 100μg/mL 피브로넥틴으로 하단 챔버를 코팅하여 부착을 개선할 수 있습니다.
여기에 설명된 장치의 면역세포화학은 세포 건강 및 기능에 대한 정성적 분석을 가능하게 합니다. 조직 배양 플레이트 또는 기타 플랫폼에서 염색하는 방법은 플랫폼으로 직접 변환할 수 있어야 합니다. 상단 챔버에서만 세포 배양의 경우, 고정 후 PBS를 하단 챔버에 추가하고 나머지 단계를 위해 그대로 둘 수 있으며, 상단 챔버에서만 차단 및 염색을 수행할 수 있습니다. 이렇게 하면 멤브레인이 파손되거나 하단 챔버에 기포가 유입될 위험이 최소화됩니다. 공동 배양 염색의 경우 모든 단계에서 두 챔버를 모두 사용하는 것이 좋습니다. 고정제와 PBS의 점도는 매체의 점도와 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 하단 챔버에 기포를 추가하는 것이 더 쉬울 수 있으며, 하단 챔버에 피펫팅하기 전에 팁 끝에서 피펫 팁의 공기가 있는지 확인하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.
저분자 투과성 분석에 대해 설명된 프로토콜은 μSiM 장치에서 배양된 내피 세포의 장벽 기능에 대한 기능적 및 정량적 평가를 가능하게 합니다. 이 분석 중에 발생할 수 있는 한 가지 문제는 프로토콜 단계 4.1.7.4의 하단 채널에서 샘플을 수집하는 동안 피펫으로 기포를 끌어들이는 것입니다. 이 문제를 방지하려면 샘플 수집을 시작하기 전에 팁이 포트에 밀봉되어 있는지 확인하고 샘플을 너무 빨리 채취하지 않는 것이 중요합니다. 그래도 문제가 해결되지 않으면 사용된 팁의 크기가 너무 작거나 커서 포트에 맞지 않을 수 있습니다. 재료 목차에 나열된 팁을 사용하십시오. 건강해 보이는 합류 단층에도 불구하고 예기치 않게 높은 투과성 값이 측정되는 경우, 시료 채취 중에 단층의 무결성이 중단되지 않았는지 확인해야 합니다. 샘플 채취 직후 항상 현미경으로 단층을 확인하는 것이 좋습니다. 단층이 여전히 온전하고 건강해 보이면 샘플을 고정할 수 있으며 예를 들어 접합 단백질의 면역염색을 통해 장벽 기능의 생물학적 마커를 평가할 수 있습니다. 반대로, 예기치 않게 낮은 투과성 값이 측정되는 경우 기포 없이 하단 채널에서 50μL의 매체를 샘플링하는 것이 중요합니다. 저장소 팁이 배치되자마자 샘플링 포트에서 배지가 나오는 경우, 대부분의 형광 소분자가 하단 채널에서 샘플링된 초기 10μL 부피에 존재하므로 피펫을 샘플링 포트에 장착하기 전에 해당 배지를 수집해야 합니다. 소수성 펜을 사용하여 포트 주위에 원을 그리거나 포트 주위에 구멍이 있는 소수성 테이프를 배치하면 수동적으로 펌핑된 매체가 퍼지는 것을 방지할 수 있습니다. 샘플링 중에 기포가 제거되거나 전체 50μL 샘플이 제거되지 않은 경우 샘플을 사용해서는 안 됩니다. 대안적으로, 정확한 부피를 결정하여 투과성 계산에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 제거된 부피가 ≥40 μL인 경우에만 행해져야 하며, 이는 ~98-99% 염료 회수율34에 해당한다.

살아있는 조직은 장벽을 만들고 유지하며 한 구획에서 다른 구획으로 운반되는 세포와 분자를 조절하는 특수 세포에 의해 구획화됩니다. 장벽 기능의 부적절한 조절은 급성 질환과 만성 질환의 원인이 될 수 있습니다. 혈액뇌장벽(BBB)은 인체에서 가장 제한적인 조직 장벽이다1. BBB의 기능 장애는 알츠하이머병2, 파킨슨병3,4, 다발성경화증5,6을 포함한 광범위한 중추신경계(CNS) 질환의 기초가 됩니다. BBB의 손상은 패혈증7, COVID-198 및 수술 후 섬망9과 같은 급성 장애의 결과로서 장기적인 인지 장애와도 관련이 있다. 뇌 질환을 치료할 수 있는 잠재력을 가진 약물의 개발은 뇌의 표적에 생체 활성 분자를 전달하기 위해 의도적으로 BBB를 뚫어야 하는 과제 때문에 좌절할 정도로 어려웠다(10). 이러한 이유로, BBB 기능을 시험관 내에서 연구하는 방법은 중추신경계 질환의 이해와 치료에 가장 중요합니다.
시험관 내에서 장벽 기능을 측정하는 기본 방법은 반투과성 막에 단층 또는 공동 배양을 설정하고 소분자 확산 또는 작은 전류에 대해 세포가 부여하는 저항을 측정하는 것을 포함합니다11,12,13,14. 미세생리학적 시스템(MPS)의 출현으로 BBB를 3D15,16로 모델링하기 위한 선택의 폭이 넓어졌지만, 시스템 형상의 다양성으로 인해 MPS 간 투과성 측정 또는 확립된 문헌 값과 비교하기가 어렵습니다. 신뢰할 수 있는 기준값의 확립은 뇌혈관 내피세포에 의한 광범위한 장벽 조절로 인해 체외 투과성 값이 매우 면밀히 조사되는 BBB 연구에서 특히 중요합니다12,17,18. 이러한 이유로 2D 멤브레인에 설정된 단층 전반에 걸친 투과성 측정은 향후 몇 년 동안 BBB 연구의 필수 요소로 남을 것입니다. 이는 상피 장벽을 포함한 다른 조직 장벽에 대해서도 마찬가지이며, 여기서 기준선 투과성의 절대값은 시험관 내 모델 19,20,21을 검증하고 비교하기 위해 사용된다.
BBB 연구 커뮤니티를 위한 가치 있는 새로운 도구를 확립하는 것을 목표로 우리는 지난 5년 동안 장벽 조직 모델링에 사용하기 위한 si, licon membrane(μSiM) 플랫폼을 특징으로 하는 마이크로장치를 22개 및 고급23,24,25,26개로 도입했습니다. 플랫폼의 활성화 기능은 수억 개의 나노 기공(27,28) 또는 나노 기공과 미세 기공(29)의 혼합을 갖는 초박형(<100nm 두께) 멤브레인이다. 독립형 멤브레인 칩은 초박형 구조(30)를 안정화하고 장치 조립을 위해 핀셋으로 처리할 수 있도록 하는 300μm 실리콘 '칩' 상에서 생산됩니다. 그들의 초박형 특성으로 인해, 멤브레인은 상업용 멤브레인 배양 장치(31,32)에 사용되는 종래의 트랙-에칭된 멤브레인보다 2배 더 높은 투과성을 갖는다. 실제로, 이것은 nanopores (<60 nm) 보다는 더 작은 분자의 유포에 막의 방해가 무시할 수 있다33이다는 것을 의미한다. 따라서, 세포 장벽의 경우, 세포와 세포가 증착하는 매트릭스만이 막(34)에 의해 분리된 정점으로부터 기저부로의 소분자 수송 속도를 결정할 것이다. 장치 설계와 멤브레인의 초박형 특성은 광학 현미경 검사에 많은 이점을 제공합니다. 여기에는 1) 위상차 또는 명시야 이미징을 사용하여 살아있는 배양을 추적할 수 있는 기능, 2) 멤브레인을 추출하여 커버 유리로 옮길 필요 없이 in situ 형광 염색 및 이미징 기능, 3) 멤브레인이 컨포칼 '슬라이스'보다 얇기 때문에 직접 공동 배양이 6-10μm 두께의 트랙 에칭 멤브레인으로 달성할 수 있는 것보다 세포 유형 간에 더 자연스러운 간격을 갖는다는 사실이 포함됩니다.
가장 최근에는 신속한 조립(34) 및 사용자 정의(35,36)를 용이하게 하기 위해 플랫폼을 모듈식 형식으로 발전시켰습니다. 우리는 모듈식 형식을 활용하여 생명 공학과 협업하는 뇌 장벽 실험실 간에 장치 구성 요소를 배포했습니다. 그런 다음 장치 조립, 단일 배양 및 공동 배양, 면역형광 염색 및 저분자 투과성을 위한 프로토콜을 공동으로 개발했으며 이러한 방법이 실험실 간에 재현 가능하다는 것을 보여주었습니다. 또한 이러한 프로토콜을 사용하여 모듈식 플랫폼이 인간 유도만능줄기세포(hiPSC)에서 뇌 미세혈관유사 내피세포(BMEC)를 생성하기 위해 확장 내피 배양법(EECM)을 사용하여 개발된 검증된 BBB를 지원한다는 것을 보여주었습니다37. 현재 보고서의 목적은 이러한 방법을 더 자세히 검토하고 함께 제공되는 비디오의 도움으로 BBB 커뮤니티에서 플랫폼의 광범위한 채택을 촉진하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Polyclonal 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 마우스 IgG 항체, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>염소 &alpha;-마우스 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>염소 &alpha;-토끼 IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, 마우스 IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Occludin 마우스 IgG 항체, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, 토끼 IgG 항체, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin 마우스 IgG2B 클론 # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 토끼 IgG 항체, 다클론</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, peptides, and recombinant proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Methanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>유사 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>유사한 제품으로 대체 가능</td></tr>: <tr><td>Accutase</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>A1110501</td><td></td></tr>, <tr><td>Acetic acid</td><td>, Sigma-Aldrich</td>, <td></td> 695092 <td></td></tr><tr><td>B27, supplement</td>, <td>Thermo Fischer, Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr>, <tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>인간 태반의 콜라겐 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐, 쥐 꼬리</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td>의 Type I 용액 <td>유사한 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 내피 세포 성장 매체-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>필수 6 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>피크 혈청</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr>소 혈장 <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td><td></td></tr><tr><td>의 피브로넥틴피브로넥틴, 인간 단백질, 혈장</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>유사한 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>유사한 제품 PBS로 대체 가능</td></tr><tr><td> 칼슘, 마그네슘</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>유사 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>전체 키트 사용(보충제 포함)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>유사 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 증류수</td><td>Invitrogen&trade;</td><td></td><td>10977015 유사한 제품으로 대체 할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Experimental models : Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood-brain barrier hCMEC / D3 cell</td><td>line Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Human brain vascular pericytes</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS (IMR90) -4 human induced pluripotent stem cells</td><td>WiCell</td><td>RRID : CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>유리 제품 및 플라스틱 제품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150mm TC 처리 세포 배양 접시, 20mm 그리드</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>클램프</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning 조직 배양 플레이트(6웰)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>평면 96웰 비결합 마이크로플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 장치 홀더</td><td>&nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>마이크로스코프 슬라이드 홀더와 호환되는 치수</td></tr>, <tr><td>Nunc 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>, Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>, Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>관 캡에 세포 배양용 물 주입 가능</td></tr><tr><td>P20-200 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>대체 브랜드는</td></tr><tr><td>Transwell 필터 (12 well, 12 mm, 0.4 &mu; m 기공 크기, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 대물렌즈(안도르용)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>공기; WD : 4mm; NA 0.45</td></tr><tr><td>10X 대물렌즈(Nikon용)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>공기; WD: 6.2mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>40X 대물렌즈(LWD)(안도르용)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>물 침수; WD : 590-610 밀리미터; NA 1.15</td></tr><tr><td>Andor 회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>옥스포드 기기, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 위상차 현미경</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>유사 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>은 유사 제품으로 대체 가능</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP Pen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>2mm tip 권장</td></tr><tr><td>고정 장치가 포함된 조립 키트</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>고정 장치 A1, A2, B1 및 B2 포함</td></tr><tr><td>현미경용 카메라 어댑터</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &파이; 30 어댑터는 Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR 카메라</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>유사한 제품으로 대체할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Cell strainer, 40 &micro; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>구성 요소 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>구성 요소 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 칩</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>다른 칩 형식을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>SMD 핸들링 핀셋 이중 각도</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td> <td>"칩 핀셋"</td></tr><tr><td>스테인레스 강철 정밀 유형 GG 핀셋</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td> <td>"스트레이트 핀셋"</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>이미지 처리</td></tr><tr><td>용</td><td>Fusion Oxford Instruments, 버전</td><td>2.3.0.44 용 Andor</td><td></td> 지침 버전 2.0에 대한</tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>지침</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>이미지 처리용. 버전 9.9.0에 대한 지침</td></tr></tbody></table>

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 microsim(μsim) 장벽 조직 플랫폼 사용

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

microSiM(μSiM)은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 모델링하기 위한 막 기반 배양 플랫폼입니다. 기존의 멤브레인 기반 플랫폼과 달리 μSiM 은 실험자에게 살아있는 세포 이미징, '혈액'과 '뇌' 챔버 사이의 방해받지 않는 파라크린 신호 전달, 멤브레인의 추출/재장착 없이 면역형광을 직접 이미지화할 수 있는 기능을 포함한 새로운 기능을 제공합니다. 여기서는 초박형 나노다공성 질화규소 멤브레인을 사용하여 BBB의 단일 배양(내피 세포) 및 공동 배양(내피 세포 및 주위 세포) 모델을 구축하기 위한 플랫폼의 기본 사용을 보여줍니다. 당사는 1차 세포 배양 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 배양 모두와의 호환성을 입증합니다. 자사는 면역형광 염색을 통한 BBB 모델의 정성 분석 방법을 제공하고 저분자 투과성 분석에서 장벽 기능의 정량적 평가를 위한 μSiM 의 사용을 시연합니다. 제공된 방법을 통해 사용자는 플랫폼에서 장벽 모델을 설정할 수 있으며, 인체 조직 연구를 위한 조직 칩 기술의 사용을 발전시킬 수 있습니다.

트렌치 다운 장치의 조립은 그림 1에 나와 있습니다. 고정 장치는 구성 요소와 멤브레인 칩의 조립을 안내합니다. 성분 1은 주로 칩에 접착하기 위한 PSA 표면과 하단 챔버에 대한 개구부 및 하단 챔버에 대한 피펫 접근을 위한 포트가 있는 아크릴입니다. 성분 2는 채널 레이어이며 그리핑을 위해 오른쪽 상단에 비접착, PSA가 없는 "삼각형"이 포함되어 있습니다. 트렌치-다운 장치는 상단 챔버에 평평한 세포 배양 성장 영역을 제공하는 반면, 트렌치업 장치는 하단 챔버에서 세포 배양을 위한 평평한 표면을 제공합니다.
hCMEC/D3 및 HBVP와 hiPSC IMR90-4 유래 EECM-BMEC 유사 세포 및 BPLC의 내피 단일배양 및 공동 배양을 수행하고 Nikon Eclipse Ts2 위상차 현미경과 10x 대물렌즈를 사용하여 위상 이미지를 획득했습니다(그림 2). 1차 세포 배양을 위한 최적의 파종 밀도(파종 후 1일 후 촬영한 이미지)와 파종되지 않은 HBVP가 표시됩니다(그림 2A). 최종 공동 배양 및 단일 배양 단계 이미지(6일 내피 세포 배양)는 구별하기 어려울 수 있으며(그림 2C), 성공적인 일차 세포 공동 배양을 확인하려면 면역형광 염색이 필요할 수 있습니다(프로토콜 섹션 3 참조). 낮은, 높은, 최적의 hiPSC 유래 BPLC 파종 밀도도 예시되어 있습니다(그림 2B). hiPSC 유래 공동 배양은 1차 공동 배양에 비해 위상차 이미징에서 더 명확하게 구별할 수 있습니다(그림 2D). 낮은 BPLC 파종은 주위 세포 커버리지 불량과 주위 세포 응집을 초래하는 반면, 과잉 파종은 주위 세포층이 막에서 벗겨지는 결과를 초래합니다. 또한, 바닥 챔버에서 배지를 너무 빨리 교환하면 이러한 세포가 전단에 매우 민감하기 때문에 주위 세포 손실이 발생할 수 있습니다. pericyte에 의한 최적의 커버리지는 내피층에 틈이 없는 BBB 모델의 경우 ~90%입니다.
면역염색된 hiPSC 유래 공동 배양의 대표적인 이미지는 그림 3 (6일 내피 세포 배양)에 나와 있습니다. IMR90-4 유래 BPLC는 pericyte marker PDGFRβ에 대해 염색하고, IMR90-4 유래 EECM-BMEC-유사 세포는 부착 접합 마커 VE-cadherin에 대해 염색했습니다. Hoechst는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 이미지는 0.2μm 슬라이스의 40x LWD 대물렌즈를 사용하여 Spinning Disc 컨포칼 현미경으로 획득하고 Imaris로 처리했습니다. 두 세포층 모두 얇은 나노막이 보이지 않더라도 시각화할 수 있습니다.
결과의 실험실 간 재현성을 입증하기 위해 스위스 베른 대학교와 미국 뉴욕 로체스터 대학교의 물리적으로 멀리 떨어진 두 실험실에서 동일한 실험 조건을 사용하여 샘플링 기반 저분자 투과성 분석을 수행했습니다(그림 4)34. hiPSC IMR90-4 유래 EECM-BMEC 유사 세포를 μSiM 장치에서 2일, 4일 또는 6일 동안 배양하고 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양했습니다. 분석은 두 실험실 모두에서 150μg/mL Lucifer Yellow(457Da)를 사용하여 수행되었습니다. 장치에서 2일 동안 배양한 내피 세포의 투과성의 높은 변동성은 2일의 배양이 장벽 성숙에 불충분했음을 나타냅니다. 장벽 성숙 시 실험실 간에 투과성에는 4일 후부터 유의미한 차이가 없었습니다. 또한 μSiM 및 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양한 내피 세포의 투과성이 이전에 발표된40개와 일치함을 보여주었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> 그림 1: μSiM 조립 단계 . (A) 칩을 픽스처 A1에 올려 놓아 준비합니다. 최종 트렌치 다운 장치를 위해 칩 트렌치를 위로 놓습니다. 최종 트렌치업 장치를 위해 칩 트렌치를 아래로 놓습니다. (B) 부품 1에서 보호 마스크를 제거하고 앞면이 아래로 향하도록 하여 부품 1을 칩에 접착합니다. 고정 장치 A2와 압력을 가하여 접착합니다. (C) 시트에서 성분 2를 제거하고 상단 보호층을 벗겨내어 성분 2와 성분 1을 접착합니다. 채널을 조명기 B1에 놓고 구성요소 1을 구성요소 2 위가 위로 향하게 놓습니다. 고정구 B2로 압력을 가하여 접착합니다. 약어: FAn = 고정 장치 An; FBn = 픽스처 Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> 그림 2: 공동 배양 개략도 및 장치 내 세포 배양의 대표 위상차 이미지. (A) pericyte 및 endothelial cell seeding의 위치. (B) 멤브레인 칩의 트렌치를 가로지르는 셀 위치의 측면도 개략도. (C) 일차 HBVP 및 hCMEC/D3 뇌 내피 세포주에 대한 낮고 최적의 파종 밀도의 대표 이미지. 이미지는 파종 후 1일(HBVP) 및 파종 후 2시간(hCMEC/D3)에 획득했습니다. (D) hiPSC 유래 뇌 주피세포 유사 세포에 대한 낮은, 높은, 최적 파종 밀도의 대표 이미지. 이미지는 파종 후 1일 후에 획득했습니다. (E) 최종 HBVP 및 hCMEC/D3 공동 배양 및 hCMEC/D3 단일 배양의 대표 이미지. 이미지는 HBVP 파종 후 8일 및 hCMEC/D3 파종 후 7일 후에 획득되었습니다. (F) 실패한 BPLC 및 EECM-BMEC 유사 세포 공동 배양 및 EECM-BMEC 유사 세포 단일 배양의 대표 이미지. 이미지는 BPLC 시딩 후 7일 및 EECM-BMEC 시딩 후 6일 후에 획득되었습니다. 과소 파종된 BPLC 배양은 충분한 커버리지를 갖지 못하는 반면, 과잉 파종된 BPLC 배양은 과밀화되어 뭉치거나 후퇴하기 시작합니다. 스케일 바 = 100μm(CF). 약어: HBVP = 인간 뇌 혈관 주위 세포; hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; BPLC = hiPSC 유래 뇌 주위 세포 유사 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> 그림 3: 장치에서 면역 염색된 hiPSC 유래 세포 공동 배양의 대표 이미지. 세포는 내피 세포 마커 VE-cadherin(녹색), pericyte marker PDGFRβ(빨간색) 및 핵 염색(파란색)에 대해 염색되었습니다. 두 층의 세포를 가까운 거리에서 볼 수 있으며, 얇은 질화규소-나노막(흰색 화살표는 왼쪽 이미지의 막 위치를 표시함)으로만 분리되어 있습니다. 눈금 막대 = 50μm. 약어: hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; PDGFRβ = 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> 그림 4: 샘플링 기반 소분자 투과성 분석 . (A) 실험 워크플로의 개략도. (B) 스위스 베른 대학교(UniBe)와 미국 뉴욕 로체스터 대학교(UR)의 물리적으로 멀리 떨어진 두 실험실 간의 실험실 간 재현성 시연: hiPSC 유래 내피 세포를 μSiM 장치에서 2일, 4일 또는 6일 동안 배양하고 트랜스웰 필터에서 6일 동안 배양했습니다. 투과성 분석은 150μg/mL Lucifer Yellow(457Da)를 사용하여 수행되었습니다. 적색 막대는 트랜스웰 필터(40)에서 6일 동안 배양한 동일한 hiPSC-유래 내피 세포의 이전에 공개된 나트륨 플루오레세인(376Da) 투과성 데이터를 나타낸다. N = 그룹당 4-16. Tukey의 사후 검정을 사용한 이원 분산 분석이 사용되었으며 비교는 관련 p &lt; 0.05에 대해서만 표시되었습니다. (C) μSiM에서 2일 동안 배양한 hiPSC 유래 EECM-BMEC 유사 세포를 사용한 사이토카인 반응 시연; 0.1ng/mL TNFα + 2IU/mL IFNγ) 또는 배지 대조군(비자극, NS)을 150μg/mL Lucifer Yellow를 사용하여 투과성 분석 전에 20시간 동안 상단 챔버에 추가했습니다. N = 그룹당 3개. 스튜던트 t-검정, p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>탑 챔버 파종 표면적</td>
			<td>탑 웰 체적(Top Well Volume</td>
			<td>하단 챔버 파종 표면적</td>
			<td>하단 채널 볼륨</td>
		</tr><tr><td>~37mm2</td>
			<td>100 μL (≥115 μL 수용 가능)</td>
			<td>~42mm2</td>
			<td>10 μL (기포 방지를 위한 피펫 20 μL)</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 중요한 μSiM 표면적 및 부피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>과녁</td>
			<td>고정제</td>
			<td>차단 솔루션</td>
			<td>희석</td>
		</tr><tr><td>VE-카데린</td>
			<td>4% PFA 또는 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.4% Tx-100 또는 10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31 시리즈</td>
			<td>4% PFA 또는 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.3-0.4% 트리톤 X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5 (클라우딘-5)</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1 (조-1)</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>오클루딘</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% 트리톤 X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>PFA 4% 함유</td>
			<td>GS 5% + 트리톤 X-100 0.4%</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2 (영문)</td>
			<td>PFA 4% 함유</td>
			<td>GS 5% + 트리톤 X-100 0.4%</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>염소 α-마우스 IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>염소 α-마우스 IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>표 2: μSiM 장치에서 공동 배양 면역세포화학을 위해 검증된 항체 및 염색 방법. 약어: PFA = 파라포름알데히드; MeOH = 메탄올; GS = 염소 혈청.
보충 파일 1: 투과성 값 계산을 위한 템플릿. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 보고서는 혈액-뇌 장벽 모델 구축을 위한 μSiM 플랫폼의 조립, 세포 배양 및 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

우리는 패혈증이 뇌에 미치는 영향과 혈액 매개 요인의 기여를 이해하기 위해 혈액-뇌 장벽의 조직 GI 모델을 개발하고 있습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 사용. 우리는 특정 환자 집단의 감수성에 대한 유전적 요인의 기여도를 평가할 계획입니다.조직 칩 커뮤니티 내의 현재 실험 과제는 결과의 재현성과 외부 실험실의 기술 채택입니다. 고유한 조직 칩 설계, 조직 칩 내 소량, 표준 기능 분석의 부족은 모두 이러한 문제에 기여하며 종종 사용자가 형광 기반 분석을 주요 출력으로 제한합니다. Micro simm 장치는 다양한 in vitro 모델링을 위한 모듈성, 고해상도 라이프스타일 이미징 및 ultra syn 100 나노미터, 고도로 생산된 나노 멤브레인에 이상적인 유리 광 표면을 제공하여 원활한 가용성 인자 누화 및 정밀한 투과성 분석을 보장합니다.마이크로 심(micro simm)을 통해 우리는 특정 세포 유형이 뇌 혈관 주위의 지지대를 제공하는 매트릭스 단백질을 더 많이 생산하는 경향이 있음을 확인했습니다. 이제 우리는 염증이 이 동일한 세포를 강화하거나 기질을 분해하여 장벽 무결성을 변화시키는지 여부를 질문할 수 있습니다. 앞으로 우리는 패혈증과 같은 전신 염증의 경우 이러한 세포가 혈액-뇌 장벽과 어떻게 상호 작용하는지 연구하기 위해 성상교세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)와 같은 녹색 세포가 있는 모델에 또 다른 구획을 추가할 것입니다.또한 치매와 겹쳐진 수술 후 섬망과 같은 전신 염증의 추가 원인도 조사할 계획입니다.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

이 프로토콜은 개방형 웰 형식과 유체 흐름 기능을 통합하는 재구성 가능한 멤브레인 기반 세포 배양 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 표준 프로토콜과 호환되며 오픈 웰과 미세유체 배양 모드 간의 가역적 전환이 가능하여 엔지니어링 및 생명과학 실험실의 요구 사항을 모두 수용할 수 있습니다.

정적 장벽 조직 모델을 동적 미세생리학 시스템으로 변환

배우세요 MicroSiM 장치를 활용한 혈액-뇌 장벽 조직 칩 모델링 방법입니다. 인간 유도만능줄기세포를 사용하여 패혈증이 뇌 기능에 미치는 영향과 유전적 요인의 기여도를 평가하는 이 기법은 신경과학 연구에 활용됩니다.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

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