2023년 6월 16일
이 프로토콜은 면역형광 후 이미지 분석, 일시적인 과발현 고려 사항, 웨스턴 블롯을 사용한 ATG9A 당화 상태 조사를 포함하여 ATG9A 생물학 연구에 도움이 될 수 있는 다양한 방법을 설명합니다.
우리 연구실에서는 어떤 지질과 단백질 기계가 ATG9A 소포 이동에 관여하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. ATG9A는 식세포 형성 및 성숙을 위한 자가포식 경로에서 매우 중요합니다. 그러나 우리는 최근 ATG9A가 세포 소기관 항상성에 미치는 영향을 연구하고 있습니다.
가장 큰 과제는 단백질과 단백질 기계가 어떻게 기능하는지에 대한 분자 세부 사항을 밝히는 것입니다. AlphaFold 및 고분해능 in-situ cryo-EM을 기반으로 하는 단백질 엔지니어링과 같은 기술은 현재 가장 많은 발전을 이루고 있습니다. 제 연구실의 연구는 자가포식체가 어떻게 형성되는지에 대한 근본적인 통찰을 확립했습니다.
이러한 통찰력은 여기에 설명된 것과 같은 고급 분자 세포 생물학 기술에 의해 뒷받침되었습니다. 특정 단백질 태그 사용의 몇 가지 단점과 태그의 국소화에 따라 ATG9A의 행동이 어떻게 바뀔 수 있는지 설명합니다. 따라서 N 또는 C 말단입니다.
또한 이러한 단점을 감지하는 방법과 이를 피하는 방법도 제안합니다. 이 외에도 재현 가능한 방식으로 ATG9A 분산을 정량화하는 워크플로우도 제공합니다. 여기에서는 면역형광 및 실시간 이미징에서 다양한 세포 구획 간의 ATG9 분산 분석을 위한 이미지 획득 및 분석에 이르는 워크플로우를 제공합니다.
그리고 이미지 분석을 위한 파이프라인의 표준화는 세포 생물학자들이 결과의 신뢰성과 재현성을 높일 수 있는 우선 순위라고 생각합니다.
본 연구에서는 ATG9A 소포 수송의 기전과 이것이 오토파지 및 세포소기관 항상성에 미치는 역할을 조사합니다. 연구진은 HEK293A 세포를 사용하여 단백질 태그가 ATG9A의 국소화 및 행동에 미치는 영향을 이해하기 위해 다양한 세포 이미징 기술을 활용했습니다.
ATG9A 수송의 정밀한 영상화 및 정량화는 초기 발굴 포트폴리오의 오토파지 표적 검증 및 기전적 리스크 제거에 있어 매우 중요한 과제를 해결합니다. 막 단백질 국소화에 대한 표준화된 워크플로우는 오토파지 경로 구성 요소의 재현 가능한 평가를 가능하게 하여, 질환 관련 시스템에서 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 역량은 오토파지 조절을 표적으로 하는 프로그램의 견고한 진행/중단(go/no-go) 결정의 근거가 됩니다.
이 이미징 및 정량화 워크플로우는 ATG9A 수송 분석을 초기 발견, 표적 검증 및 오토파지 관련 프로그램의 전임상 연구의 접점에 배치합니다.