Name: 세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하여 세포골격 네트워크를 시각화하는 방법을. 이 기술은 밀도 높은 3차원 생물학 샘플을 최소한의 광표백으로 장시간 촬영할 수 있어 세포 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 미국 국립과학재단(NSF)의 RUI Award(DMR-2203791)의 지원을 받아 J.S. 정렬 과정에서 Bin Yang 박사와 Manish Kumar 박사가 제공한 지도에 감사드립니다. Kinesin 모터의 준비 지침을 제공해 주신 Jenny Ross 박사와 K. Alice Lindsay 박사님께 감사드립니다.

세포골격 네트워크를 시각화하기 위한 맞춤형 형광 현미경

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
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<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
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<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
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<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
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</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다. 모든 연구는 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었습니다.

이 프로토콜과 관련된 두 가지 중요한 세부 사항은 시스템의 전체 비용과 예상 빌드 및 정렬 시간입니다. 정확한 비용은 가변적이지만 이 SOLS 또는 유사한 DIY 시스템의 토토 비용은 $85,000 USD 범위에 속할 것이라고 편안하게 추정할 수 있습니다. 이 견적은 모든 구성 요소의 소매 가격을 고려하므로 중고 구성 요소를 소싱하면 이 전체 가격이 크게 낮아질 수 있습니다. 구축 시간 측면에서 광학 경험이 거의 없는 사용자가 모든 구성 요소를 사용할 수 있고 준비된 경우 1-2개월 이내에 이 전체 SOLS 시스템을 구축하고 정렬할 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. 프로토콜의 길이와 복잡성에도 불구하고, 우리는 비디오 프로토콜과 짝을 이루는 서면 원고의 세부 사항의 양이 이 프로토콜을 간단하고 빠르게 따라갈 수 있도록 해야 한다고 믿습니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 갈보의 배치는 3개의 개별 4f 렌즈 쌍의 일부이므로 많은 렌즈의 배치를 결정합니다. 갈보가 O1 및 O2의 후면 초점면과 결합되고 기울기 불변 스캔을 보장하기 위해 올바르게 중앙에 위치하는 것이 중요합니다. 둘째, 이미지 품질은 서로에 대한 O2와 O3의 정렬에 매우 민감합니다. 여기서 먼저 O3 대 O2의 정렬 각도가 여기 광시트의 기울기와 일치하여 유사하게 기울어진 FoV에서 최대한 평평한 조명을 제공하도록 주의를 기울여야 합니다. 둘째, O3는 가능한 한 큰 면적의 평평한 FoV를 유지하기 위해 올바른 축 거리에 배치되어야 합니다. 셋째, O3는 O2-O2 인터페이스를 통과하는 신호를 최대화하기 위해 O3에서 올바른 측면 거리에 배치되어야 합니다.

사용 가능한 FoV 측면에서 이 시스템은 80μm x 80μm 영역에서 일관된 조명으로 평평하고 안정적인 필드를 달성했습니다. 이 영역은 카메라에서 제공하는 최대 FoV보다 작기 때문에 사용 가능한 FoV는 그림 13의 노란색 상자로 표시됩니다. 분해능 측면에서 이 시스템은 x축을 따라 432nm, y축을 따라 421nm의 최소 분해능 거리를 달성했으며, 이는 양호한 FoV에서 가우스 피팅 대 점 확산 함수(PSF)의 평균 시그마 x 및 y를 찾고 2를 곱하여 측정되었습니다. 이 시스템은 총 NA 측면에서 최적화되지 않았으며, 이는 사용자가 이 시스템이 달성한 것보다 더 높은 분해능을 원할 경우 상당한 개선의 여지가 있음을 의미합니다. 이러한 유형의 SOLS 빌드에는 호환 가능한 대물렌즈 옵션이 많이 있으며, 그 중 다수는 더 높은 시스템 해상도에 기여하지만 릴레이 인터페이스 8,11,13,20에서 더 높은 비용, 더 작은 FoV 또는 더 복잡한 정렬 기술의 단점이 있습니다. 이와는 별도로, 사용자가 더 큰 FoV를 원하는 경우, 2D 스캐닝을 허용하기 위해 두 번째 갈보를 통합하면 이러한 목표를 달성할 수 있지만, 추가적인 광학 및 제어 메카니즘이 설계(32)에 통합될 것을 요구할 것이다. 우리는 디자인 프로세스23에 관한 다른 유용한 리소스에 대한 링크와 함께 웹 사이트 페이지에서 시스템 수정에 대한 자세한 내용을 제공했습니다.

이 특정 설계에 대한 특정 구성 요소를 개선하는 것 외에도 이 빌드에 다른 고해상도 현미경 기술이나 양식을 추가하는 것이 매우 실현 가능할 것입니다. 이러한 개선 사항 중 하나는 다중 파장 조명을 통합하는 것인데, 이는 추가 여기 레이저를 원래의 여기 경로8에 정렬하는 것을 포함합니다. 또한 이러한 유형의 SOLS 설계는 샘플에 접근할 수 있기 때문에 광학 핀셋, 미세유체역학 및 유변 물성 측정을 포함하되 이에 국한되지 않는 추가 기능을 현미경에 추가하는 것은 비교적 간단합니다 2,33.

지금까지 공개된 수많은 라이트 시트 가이드와 비교했을 때, 이 프로토콜은 광학 경험이 많지 않은 사용자도 도움이 될 수 있는 수준의 지침을 제공합니다. 기존의 시료 슬라이드 장착 기능을 갖춘 사용자 친화적인 SOLS 빌드를 더 많은 청중이 이용할 수 있도록 함으로써 장비가 활용되었거나 활용될 수 있는 모든 분야에서 SOLS 기반 연구의 응용 분야를 더욱 확장할 수 있기를 바랍니다. SOLS 기기의 응용 분야가 2,34,35 번으로 빠르게 성장하고 있음에도 불구하고 SOLS 유형 기기의 많은 이점과 활용이 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있다고 생각하며 이러한 유형의 기기가 앞으로 나아갈 가능성에 대한 흥분을 표현합니다.

광시트 형광 현미경(LSFM)은 여기광이 시트 1,2로 형성되는 고해상도 형광 이미징 기술 제품군을 나타내며, 여기에는 SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy), SCAPE(Swept Confocally-Aligned Planar Excitation) 및 OPM(Oblique-Plane Microscopy)3,4,5,6,7이 포함됩니다. epi-fluorescence, total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) 또는 confocal microscopy와 같은 다른 현미경 방식과 달리 LSFM에서는 광독성이 최소화되며 활발하게 이미징되는 샘플의 평면만 조명되기 때문에 더 긴 시간 척도에 걸쳐 샘플을 이미징할 수 있습니다 8,9,10. 따라서 LSFM 기법은 장기간에 걸쳐 3D 샘플을 이미징하는 데 매우 유용하며, 특히 컨포칼 현미경 기법을 사용하기에는 너무 두꺼운 샘플도 유용합니다. 이러한 이유로 LSFM은 2004년 최초 개발 이후 많은 생리학자, 발달 생물학자 및 신경과학자가 살아있는 제브라피시 및 초파리 배아와 같은 전체 유기체의 시각화를 위해 선택하는 이미징 기술이 되었습니다 3,4,6,11 . 지난 20년 동안 LSFM의 장점은 생체 내 및 시험관내 13,14,15,17 모두에서 조직11,12, 세포 및 세포 내 규모를 포함하여 점진적으로 더 작은 규모에서 구조와 역학을 시각화하는 데 활용되었습니다.
문헌에서 성공적인 사용 사례에 대한 보고에도 불구하고 상용 LSFM 시스템의 높은 비용(작성 당시 ~25만 달러)18,19은 이 기술의 광범위한 사용을 방해합니다. DIY 빌드를 연구자에게 실현 가능한 대안으로 만들기 위해 오픈 액세스 노력인 OpenSPIM22를 포함하여 여러 빌드 가이드 8,13,20,21이 게시되었습니다. 그러나 현재까지 광학 경험이 거의 없는 연구자들은 기존의 슬라이드 장착 샘플과 호환되지 않는 초기 LSFM 설계만 사용할 수 있습니다(그림 1A). 최근의 단일 대물렌즈, 광시트(SOLS) 구현은 여기와 검출 모두에 단일 대물렌즈를 사용하므로(그림 1C) 호환성 5,6,8,13,20과 관련된 한계를 극복했습니다. 그러나 SOLS 설계의 다양성에 대한 비용은 이미징을 위해 물체 평면을 카메라에 릴레이, 틸트 해제 및 이미지로 다시 이미지화하기 위한 두 가지 추가 대물렌즈가 필요하기 때문에 빌드의 복잡성이 크게 증가한다는 것입니다(그림 1D). 복잡한 SOLS 스타일 설정에 쉽게 액세스할 수 있도록 이 백서는 슬라이드 호환 SOLS 시스템의 설계, 구축, 정렬 프로세스 및 사용에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 이는 초급 광학 교육 과정만 알고 있는 연구자에게 유용합니다.
프로토콜 자체는 간결하지만 독자는 준비 단계에서 다른 리소스를 참조하여 디자인 또는 하드웨어 고려 사항의 특정 부분에 대해 자세히 알아보아야 합니다. 그러나 독자가 이 설계의 사양을 따르려는 경우 특정 광학 부품을 선택하는 방법을 이해할 필요가 없을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 LSFM 구성의 특성. (A) 초기 LSFM 설계에서 공통적으로 사용되는 두 개의 직교 대물렌즈를 사용한 설정. 이 구성에서는 모세관 또는 겔 실린더를 사용하여 시료를 담는데, 이는 기존의 슬라이드 장착 기술과 호환되지 않습니다. (B) 다음을 보여주는 SOLS 광시트 설계의 개략도: (C) 샘플 평면(O1)에서 여기 및 방출 수집 모두에 사용되는 단일 대물렌즈; 이를 통해 기존 슬라이드를 상단에 장착할 수 있으며 (D) SOLS 방출 경로에 릴레이 대물렌즈 시스템을 장착할 수 있습니다. O2는 방출광을 수집하고 이미지를 확대합니다. O3는 카메라 센서에 올바른 기울기 각도로 평면을 이미지화합니다. 약어: LSFM = light-sheet fluorescence microscopy; SOLS = 단일 대물렌즈 광시트; O1-O3 = 목적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>1" 플라노-오목렌즈 f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>정렬 레이저 예상 비용: $49.5</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선 f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 및 정렬 레이저 예상 비용: $342.42</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선 f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 예상 비용: $114.14</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선 f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 예상 비용: $114.14</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중항 f = 150mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 예상 비용: $114.14</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선 f = 45mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 예상 비용: $114.14</td></tr><tr><td>1" 무채색 이중선 f = 75mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 예상 비용: $114.14</td></tr><tr><td>1" 원통형 렌즈 f = 100mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 예상 비용: $117.62</td></tr><tr><td>1" 원통형 렌즈 f = 200mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 예상 비용: $111.22</td></tr><tr><td>1" 원통형 렌즈 f = 50mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 예상 비용: $117.62</td></tr><tr><td>1" 장착 핀홀, 30 &마이크로; m 핀홀 직경</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>예상 비용: $77.08</td></tr><tr><td>1" 실버 미러(x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, 정렬용 1개 예상 비용: $168.78</td></tr><tr><td>2" 타원형 미러</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 예상 비용: $179.98</td></tr><tr><td>2" 포스트 홀더(x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>맞춤형 레이저 마운트, ND 휠, 안전 스크린 예상 비용: $98.45</td></tr><tr><td>2" 게시물 (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>맞춤형 레이저 마운트 및 광학 부품 예상 비용: $277.3</td></tr><tr><td>3" 게시물 (x4)&nbsp;</td><td>쏘랩스&nbsp;</td><td>TR3</td><td>M3 지지대 및 기타 마운트용 예상 비용: $24.6</td></tr><tr><td>3" 포스트 홀더 (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>예상 비용: $38.48</td></tr><tr><td>30에서 60mm 케이지 어댑터&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>O1 장착 예상 비용: $45.42</td></tr><tr><td>30mm 케이지 필터 휠</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>ND 필터 장착 예상 비용: $172.36</td></tr><tr><td>30mm 케이지 플레이트(x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>정렬 케이지 및 정렬 레이저 구축 예상 비용: $114.54</td></tr><tr><td>30mm 직각 키네마틱 미러 마운트(x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>M1 및 M2 장착 및 정렬 레이저 예상 비용: $463.95</td></tr><tr><td>4" 포스트 홀더 (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>예상 비용: $320.1</td></tr><tr><td>561 nm 레이저 및 전원 공급 장치&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>여기 레이저 예상 비용: $6000</td></tr><tr><td>60mm 케이지 플레이트(x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>TL1 및 M3 마운트 장착 예상 비용: $88.52</td></tr><tr><td>60mm 직각 키네마틱 미러 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>M3 장착 예상 비용: $187.26</td></tr><tr><td>90&deg; 플립 마운트</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>정렬 레이저 예상 비용:</td></tr><tr><td>외부 C-마운트 스레드와 내부 SM1 스레드가 있는</td> $95.5 어댑터 <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>렌즈 튜브를 카메라에 연결하려면 예상 비용:</td></tr><tr><td>외부 SM1 나사와 내부 C-마운트 나사가 있는</td> 어댑터 <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>튜브 렌즈를 렌즈 마운트에 연결하려면 예상 비용:</td></tr><tr><td>외부 SM1 스레드 및 내부 M25 스레드가 있는 어댑터 (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>O1 및 O2를 장착하려면 예상 비용:</td></tr><tr><td>외부 SM1 스레드 및 내부 M26 스레드가 있는 어댑터</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>O3 장착하기 위해 예상 비용: $22.38</td></tr><tr><td>정렬 디스크</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>예상 비용: $20.45</td></tr><tr><td>정렬 레이저</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM 예상 비용: $16.98</td></tr><tr><td>자동 조명 플라스틱 슬라이드, 빨간색&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>예상 비용: $20</td></tr><tr><td>빔 셔터&nbsp;</td><td>쏘랩스&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>레이저 광선을 차단하려면 예상 비용: $65.8</td></tr><tr><td>케이지 회전 마운트 (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>CL1-3 를 장착하기 위해 예상 비용: $282.15</td></tr><tr><td>케이지 시스템 로드 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>M3 및 O1 장착하기 위해 예상 비용: $44.8</td></tr><tr><td>케이지 시스템 로드 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>O3 장착하기 위해 예상 비용: $14.28</td></tr><tr><td>케이지 시스템 막대 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>슬릿 장착 예상 비용: $30.76</td></tr><tr><td>케이지 시스템 로드 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>튜브 렌즈 정렬 예상 비용: $25.3</td></tr><tr><td>케이지 시스템 로드 12"(x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>정렬 케이지 예상 비용: $145.36</td></tr><tr><td>카메라</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>예상 비용: ~$14,000</td></tr><tr><td>클램핑 포크(x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>포스트 마운트를 고정하려면 예상 비용: $338.8</td></tr><tr><td>커버 유리, 22 x 22mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>슬라이드 샘플 예상 비용: $265</td></tr><tr><td>Dichroic&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>절제/방출 경로 분할 예상 비용: $965</td></tr><tr><td>Dovetail Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>핀홀을 번역하려면 예상 비용: $90.55</td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>예상 비용: $140.99</td></tr><tr><td>젖빛 유리 정렬 디스크(x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>정렬 케이지 및 중간 평면의 경우 예상 비용 : $ 75.14</td></tr><tr><td>함수 생성기</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>galvo 를 제어하려면 예상 비용 : $ 900</td></tr><tr><td>검류계 - 1D 대형 빔 직경 시스템</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>예상 비용 : $ 1715.78</td></tr><tr><td>검류계 전원 공급 장치</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>예상 비용 : $ 300</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Gellan 껌 3D 비드 샘플 예상 비용: $68.25</td></tr><tr><td>FIJI 소프트웨어</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>다운로드 https://imagej.net/software/fiji/downloads 예상 비용: 무료</td></tr><tr><td>핫 플레이트/교반기</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td>샘플 솔루션 준비용 예상 비용: $550</td></tr><tr><td>K-Cube 브러시 모터 컨트롤러</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>드라이브 Z825B 예상 비용: $757.51</td></tr><tr><td>Kinematic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>이색성 마운트 예상 비용: $92.01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 에서 다운로드 예상 비용: 무료</td></tr><tr><td>레이저 광 차단제&nbsp;</td><td>쏘랩스&nbsp;</td><td>LB1</td><td>ND 필터 반사용 예상 비용: $57.65</td></tr><tr><td>레이저 마운트</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td>3D 프린트 예상 비용: N/A</td></tr><tr><td>레이저 안전 스크린 (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>미용 레이저 광 차단 예상 비용: $92.02</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 튜브 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 예상 비용: $1491</td></tr><tr><td>렌즈 마운트(x10)&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>모든 렌즈 및 추가 정렬 미러를 장착합니다. 예상 비용: $164.7</td></tr><tr><td>마그네틱 룰</td>러 <td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>정렬을 확인하려면 예상 비용: $52.74</td></tr><tr><td>마이크로 매니저 소프트웨어&nbsp;</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>다운로드 https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 예상 비용: 무료</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12550400</td><td>슬라이드 샘플 예상 비용: $123.9</td></tr><tr><td>현미경 스테이지&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 사용자 정의 부품</td><td>샘플 세부 번역을 위해 예상 비용: ~$16,000</td></tr><tr><td>Mini Vortex Mixer&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>샘플 준비용 예상 비용: $152.64</td></tr><tr><td>모터화된 액추에이터</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>M1 를 미세 번역하려면 예상 비용: $729.07</td></tr><tr><td>장착된 표준 Iris (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>정렬을 위해 최소 2개 예상 비용: $118.02</td></tr><tr><td>ND 필터 세트&nbsp;</td><td>쏘랩스</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>여기 강도를 줄이려면 예상 비용: $726.73</td></tr><tr><td>대물 렌즈 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>계획 Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 예상 비용: ~$15,000</td></tr><tr><td>대물 렌즈 2</td><td>Nikon</td><td>TU 계획 Fluor 100X/0.90&nbsp;</td><td>O2 예상 비용: ~$6,000</td></tr><tr><td>대물 렌즈 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3 예상 비용: ~$6,800</td></tr><tr><td>OPM 왜곡 보정 소프트웨어</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>이미지 처리용. 에서 다운로드 https://github.com/QI2lab/OPM 예상 비용: 무료</td></tr><tr><td>포토다이오드 파워 센서</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>레이저 강도 측정용 예상 비용: $379.68</td></tr><tr><td>포지티브 그리드 왜곡 타겟</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Brightfield 정렬 예상 비용: $267.87</td></tr><tr><td>파워 미터 디지털 콘솔</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>레이저 강도 측정용 예상 비용: $1245.48</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>형광 코팅 슬라이드 샘플 예상 비용: $27.7</td></tr><tr>포스트 Thorlabs<td>용 직각 클램프</td><td>&nbsp;</td><td>RA90</td><td>M3 지원 및 플립 다운 미러 예상 비용: $32.46</td></tr><tr><td>RMS 스레드 케이지 플레이트(x2)&nbsp;</td><td>쏘랩스&nbsp;</td><td>CP42</td><td>정렬 레이저 예상 비용: $70.56</td></tr><tr><td>전단 플레이트 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>예상 비용: $182.85</td></tr><tr><td>전단 플레이트 5.0-10.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>예상 비용 : $ 201.47</td></tr><tr><td>전단 플레이트 10.0-25.4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>예상 비용 : $ 236.42</td></tr><tr><td>전단 플레이트 보기 화면</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>예상 비용 : $ 337.74</td></tr><tr><td>1-3 mm 플레이트</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td>가있는 전단 간섭계 <td>시준 확인 예상 비용 : $ 465.85</td></tr><tr><td>슬립온 포스트 칼라 (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>포스트 높이를 유지하기 위해 예상 비용: $208.25</td></tr><tr><td>Slit</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>예상 비용: $294.64</td></tr><tr><td>슬롯 렌즈 튜브, 3"</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>정렬 레이저의 경우 예상 비용: $77.45</td></tr><tr><td>정사각형 거울, 1 x 1"</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069& hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 예상 비용: $14.76</td></tr><tr><td>스택형 렌즈 튜브 1/2"(x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>CL1-3 장착 예상 비용: $40.86</td></tr><tr><td>스택형 렌즈 튜브 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>O3 장착 예상 비용: $15.41</td></tr><tr><td>스택형 렌즈 튜브 2"(x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>카메라 경로 예상 비용: $35.7</td></tr><tr><td>스터드 페디스탈 베이스 어댑터 (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>포스트 마운트를 테이블에 부착하려면 예상 비용: $400.71</td></tr><tr><td>렌즈 마운트(x3)</td> <td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>핀홀, O2 및 O3 를 미세 번역하려면 예상 비용:</td></tr><tr><td>표준 마이크로미터(x2)를 사용한 번역 스테이지</td> <td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 예상 비용: $647.54</td></tr><tr><td>여행 매뉴얼 번역 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>O3 케이지 번역 마운트 예상 비용: $497.3</td></tr><tr><td>튜브 렌즈</td><td>니콘</td><td>MXA20696</td><td>TL3 예상 비용: $359</td></tr><tr><td>흰색 장착 LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>MNWHL4</td><td>명시야 광원 예상 비용: $171.28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>총 예상 비용: $84,858.98</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>저자는 많은 부품이 중고로 구입되었다고 지적합니다. 여기에서는 모든 품목의 소매 가격을 반영하려고 시도했으므로 중고 품목, 특히 더 비싼 품목을 구입하여 총 비용을 크게 줄일 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>선택적 구성 요소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>정렬 중 진단 검사용. Acquisiton 카메라를 대신 사용할 수 있지만 나중에 재정렬해야 합니다. 예상 비용: $1089</td></tr></tbody></table>

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

재구성된 세포골격 복합체는 비평형 연성 물질을 연구하기 위한 귀중한 모델 시스템으로 부상했습니다. 이러한 3D 조밀한 네트워크의 역학을 충실하게 포착하려면 종종 형광 컨포칼 현미경과 관련된 광학 절편이 필요합니다. 그러나 최근 광시트 형광 현미경(LSFM)의 발전으로 비용 효율적이고 때로는 우수한 대안으로 자리 잡았습니다. 광학에 익숙하지 않은 세포골격 연구자들이 LSFM을 이용할 수 있도록 기성 부품으로 다용도 광시트 형광 현미경을 제작하는 단계별 초보자 가이드를 제공합니다. 기존 슬라이드 시료로 시료를 장착할 수 있도록 이 LSFM은 여기 및 방출 수집 모두에 단일 대물렌즈를 활용하는 단일 대물렌즈 광시트(SOLS) 설계를 따릅니다. 독자가 기기를 수정하고 특정 요구 사항에 맞게 설계할 수 있도록 SOLS의 각 구성 요소의 기능을 충분히 자세히 설명합니다. 마지막으로, 키네신 구동 미세소관 네트워크에서 과꽃을 시각화하여 이 맞춤형 SOLS 기기의 사용을 시연합니다.

우리는 gellan 검에서 끼워넣어진 1개 μm 구슬의 부피 측정 검사를 실행했습니다. 그림 14 는 x, y, z 방향에 따른 기울기 보정 체적 스캔의 최대 강도 투영을 보여줍니다.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> 그림 14: 겔란 검에서 1μm 형광 비드의 체적 이미징. 기울기 보정된 체적 스캔의 최대 강도 투영이 표시됩니다. 스케일 바 = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
우리는 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 사용하여 미세소관 과꽃 샘플의 체적 스캔을 수행하여 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 방법을 시연했습니다. 간단히 말해서, 로다민-표지된, 탁솔-안정화된 미세소관은 GTP에 의해 재구성된 이량체로부터 중합되었다; 그런 다음 중합 후 스트렙타비딘 기반 키네신 모터 클러스터를 ATP와 함께 샘플에 혼합하여 6μM 미세소관, 0.5μM 키네신 이량체 및 10mM ATP의 최종 농도를 높였습니다. 탁솔-안정화된 미세소관 및 키네신 운동 클러스터의 제조를 위한 광범위한 프로토콜 및 가이드는 Mitchson Lab 및 Dogic Lab 웹사이트25,26에서 찾을 수 있습니다. 샘플을 현미경 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 넣고 밀봉한 다음 이미징하기 전에 8시간 동안 그대로 두어 운동 활동이 중지되도록 하여 샘플이 과꽃과 유사한 안정적인 구조 상태에 도달하도록 했습니다.
재구성된 세포골격 시스템에 대한 연구는 이미지 라벨링 필라멘트에 컨포칼 또는 에피형광 현미경을 가장 자주 사용합니다. 그러나, 이들 두 기술 모두 조밀한 3D 샘플을 이미지화하는 능력에 있어서 제한된다(27). 샘플을 준2D 28,29로 제한함으로써 체외 세포골격 기반 활성 물질 연구에서 많은 진전이 이루어졌지만, 세포골격 네트워크는 본질적으로 3D이며, 3D 샘플에서만 발생할 수 있는 효과를 이해하는 데 현재의 많은 노력이 놓여 있습니다(29,30), 따라서 고해상도 3D 이미징의 필요성이 대두되고 있습니다.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> 그림 15: 단일 대물렌즈 광시트 현미경을 통한 재구성된 세포골격 샘플의 3D 시각화 촉진. (A) Leica DMi8 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 획득한 형광 미세소관 과꽃의 이미지. 이미지는 z-스캔의 다른 평면을 보여줍니다. 스케일 바 = 30 μm. (B) 동일한 샘플의 단일 대물렌즈 광시트 설정에서 수행된 체적 스캔에서 디컨볼루션된 기울기 보정 이미지. 눈금 막대 = 30μm. 여기서 기울기 보정된 이미지 영역은 그림 13B에 표시된 사용 가능한 FoV(노란색 상자)에 해당합니다. 공초점은 커버슬립 근처의 단일 평면을 이미징하는 데 탁월하지만, 형광 샘플의 밀도는 이미징 평면 아래에서 오는 추가 신호로 인해 더 높은 평면에서 이미징할 때 복잡성을 유발합니다. 광시트는 이미징 평면만 비추어 이 문제를 피하므로 z의 다른 평면에서 균일하게 선명한 이미징을 허용합니다. 약어: SOLS = 단일 목표 라이트 시트; FoV = 시야. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 15에서는 키네신 운동 클러스터에 의해 과꽃과 같은 구조로 수축된 재구성된 미세소관 네트워크의 체적 이미징을 보여줍니다. 이전 연구28,31에서 볼 수 있듯이 이러한 3D 구조는 중앙으로 갈수록 조밀해지는 경향이 있어 신호에서 우세한 밝은 형광 영역이 생성됩니다. 커버슬립(낮은 z 레벨) 근처의 이미징 평면에서 컨포칼 현미경(그림 15A)은 과꽃 주변부의 단일 필라멘트를 분해할 수 있으며, 위쪽의 초점이 맞지 않는 형광 신호로 인해 중앙을 향한 추가 배경을 확인할 수 있습니다. 그러나 z에서 몇 미크론을 움직이면 과꽃의 초점이 맞지 않는 조밀한 부분이 이미징 평면의 신호에서 우세하기 때문에 이미지 품질이 빠르게 저하됩니다. 광시트의 단면 조명(그림 15B)은 이미징 평면 위와 아래의 과꽃의 조밀한 부분에서 초점이 맞지 않는 신호를 제거하여 평면 간에 유사한 이미지 품질을 허용합니다. 고품질의 신뢰할 수 있는 체적 스캔 데이터를 생성하는 광시트의 기능은 재구성된 세포골격 시스템에서 3D 현상을 시각화하고 특성화할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

우리의 연구는 트랜스 작업 역학, 국소 구조 및 평형에서 멀리 떨어진 재료의 기계적 특성 간의 관계에 대한 지식을 발전시키는 것을 목표로 합니다. 세포골격 네트워크와 같이 평형에서 멀리 떨어진 물질을 시각화하려면 형광 광시트 현미경이 가장 적합한 기술적으로 어려운 작업인 광표백을 통해 손상을 최소화하면서 시료 부피 전체에 걸쳐 유사한 이미지 품질로 조밀한 3차원 시료를 이미지화할 수 있는 기능이 필요합니다. 형광 광시트 현미경 시스템은 뛰어난 광학 절편 기능을 제공하여 광표백을 최소화하면서 장시간 동안 이러한 두꺼운 3차원 샘플을 이미징할 수 있습니다.특히, 우리가 소개할 단일 대물렌즈 광시트 시스템은 기존의 슬라이드 장착 샘플과 호환되므로 매우 다재다능한 도구입니다. 대다수의 단일 대물렌즈 광시트 가이드는 광범위한 광학 경험을 가진 사용자를 위해 작성되었습니다. 복잡한 단일 대물렌즈 라이트 시트 스타일 설정에 더 쉽게 접근할 수 있도록 이 상세 가이드는 초급 수준의 광학 교육 과정을 갖춘 사용자가 따라할 수 있는 단계를 제공합니다.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그들의 모국어 microenvironment에서 진화 많은 생물 학적 및 임상 상황에서는 그것은 세포 프로세스를 연구에 유리합니다. 여기 우리는 세포 배양, 동물 실험 및 임상 환자 연구에 실시간 영상을 제공할 수있는 저비 용의 광섬유 현미경의 조립 및 사용에 대해 설명합니다.

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포의 미세 영상은 cytoskeletal 구조에서 동적 변화 특성화 수 있습니다. 고정 표본을 사용하는 기술과는 달리,이 방법은 전에 동일한 세포에있는 굴지의 cytoskeleton의 시간적 변화에 대한 자세한 평가, 동안 다양한 물리적, 약리, 또는 염증성 자극 후를 제공합니다.

GFP - 굴지 표현 라이브 내피 세포 굴지의 Cytoskeleton 연구

이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.

단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

상세한 지시는 타일 (HIST) 현미경 및 단일 분자 이미징에 대 한 용법을 휩 쓸 높은 경사를 구축 하는 방법에 설명 되어 있습니다.

높은 경사 구축 가이드 확장 된 시야의 단일 분자 이미징 타일 현미경을 휩 쓸

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

배우세요 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하여 세포골격 네트워크를 시각화하는 방법을. 이 기술은 밀도 높은 3차원 생물학 샘플을 최소한의 광표백으로 장시간 촬영할 수 있어 세포 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

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