Name: 자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 학습하세요 자동화된 세포 프로세서를 활용한 CAR T-세포 반자동 생산 방법을. 바이러스 전달 및 배양 과정을 통해 임상용 세포를 경제적으로 제조하는 유연한 폐쇄 시스템을 탐색하세요.

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저자들은 이 작업에 대한 여러 개인과 조직의 기여에 감사를 표하고자 합니다. 세포 및 유전자 치료 실험실(Cell and Gene Therapy Laboratory)과 펜실베이니아 중개 및 상관 연구 실험실(Penn Translational and Correlative Studies Laboratory)은 공정 개발 및 IND 제출 준비에 귀중한 지원을 제공했습니다. 멜리사 바르게세(Melissa Varghese)와 아만다 디노피아(Amanda DiNofia)는 이 원고의 기초가 되는 IND 제출을 위한 프로세스 개발 및 준비에 기여했습니다. 이 연구는 필라델피아 아동 병원의 세포 및 유전자 치료 협력 단체의 가속 보조금의 지원을 받았습니다. 저자들은 또한 기술 및 연구 지원에 대해 Miltenyi Biotec에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 1 은 copyright © 2023 Miltenyi Biotec BV & Co. KG의 적용을 받습니다. 판권 소유.

임상 규모의 CAR-T 세포 제조를 위한 자동 프로세서

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K., S.G. 및 Y.W.는 Miltenyi Biotec으로부터 연구 지원을 받았습니다.

CAR-T 세포 치료제는 B세포 및 기타 악성 종양에 대한 유망한 치료법으로 부상했습니다. 그러나 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 높은 비용, 노동 집약적인 생산, 오염 위험을 증가시키는 개방형 단계 등 몇 가지 한계가 있습니다. 최근에는 이러한 한계를 해결하기 위해 Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하 "프로세서")를 비롯한 여러 반자동 플랫폼이 등장했습니다. 이 원고에 설명된 프로세서에 통합된 T 세포 형질도입(TCT) 공정은 폐쇄형 시스템에서의 T 세포 농축, 활성화, 바이러스 형질도입, 배양 확장 및 수확을 포함합니다. 경쟁사의 자동 세포 처리기 플랫폼은 현재 널리 사용되지 않지만 배양 파라미터에 대한 공정 중 모니터링이 더 우수하거나, 유리한 장비 또는 재료 비용이 들거나, 설치 공간이 더 작아 전용 클린룸 공간 대신 생물 안전 작업대에서 사용할 수 있습니다. 주어진 응용 프로그램 및 환경에 가장 적합한 플랫폼을 선택하는 것이 중요합니다.
CAR-T ...

키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 입양 이식은 난치성 B 세포 악성 종양 1,2,3,4,5 환자를 치료하는 데 놀라운 효능을 보여주었습니다. 그러나 CAR-T 세포의 전통적인 제조 방법은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 고도로 전문화된 단계를 수행하기 위해 고도로 훈련된 기술자가 필요합니다. 예를 들어, 자가 CAR-T 세포 제품의 기존 제조 공정에는 밀도 구배 원심분리, T 세포를 농축하기 위한 용출 또는 자기 분리, 멸균 플라스크에서 바이러스 벡터를 사용한 활성화 및 형질도입, 수확 및 제형 전에 바이오리액터에서의 팽창이 포함됩니다. 최근 이 프로세스를 부분적으로 자동화하는 것을 목표로 하는 다양한 시스템이 등장했습니다. 예를 들어, Miltenyi CliniMACS Prodigy(이하, "프로세서"라 칭함)는 자동화된 방식으로 이러한 단계들 중 많은 것을 수행할 수 있는 자동화된 세포 처리 장치이다(6,7,8,9). 전통적이고 자동화된 CAR-T 제조 방법에 대한 심층적인 논의는 최근 리뷰 기사10에 제시되어 있습니다.
이 프로세서는 조혈 전구 세포 처리를 위한 미국 식품의약국(FDA) 승인 의료 기기인 CliniMACS Plus의 기능을 기반으로 합니다. 이 프로세서에는 세포의 자동 세척, 분획 및 배양이 가능한 세포 배양 장치가 포함되어 있습니다(그림 1). T 세포 형질도입(TCT) 공정은 수동 CAR-T 세포 제조를 대부분 복제하는 프로세서 장치 내의 사전 설정 프로그램입니다. TCT를 사용하면 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 사용자 정의 가능한 셀 처리가 가능합니다("활동 매트릭스", 그림 2). 프로세서는 많은 단계를 자동화하고 여러 장치의 기능을 하나의 기계로 통합하기 때문에 기술자의 교육과 전문 문제 해결 기술이 덜 필요합니다. 모든 단계가 폐쇄된 일회용 튜빙 세트 내에서 수행되기 때문에 프로세서는 개방형 제조 공정에 허용되는 것으로 간주되는 것보다 덜 엄격한 공기 처리 인프라가 있는 시설에서 작동할 수 있습니다. 예를 들어, ISO 클래스 8(EU 등급 C에 필적) 인증을 받은 시설에서 프로세서를 작동하고 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> 그림 1: T 세포 형질 도입 시스템을 사용한 CAR-T 세포 제조. 튜브 세트가 설치된 프로세서가 표시됩니다. 튜빙 세트를 사용하면 멸균 용접을 통해 처리 완충액, 배양 배지 및 렌티바이러스 벡터가 포함된 백과 같은 다른 구성 요소를 연결할 수 있습니다. 백혈구 채취 산물이 Application bag에 추가되면 T Cell Selection Beads로 라벨링하고 Separation column을 통과한 다음 Reapplication bag으로 옮길 수 있습니다. 그런 다음 선택된 세포는 배양용 기기의 배양 장치로 보내지고 활성화 시약으로 활성화됩니다(재료 표 참조). 최종 생성물은 Target cell bag에 수집됩니다. 공정 전반에 걸쳐 품질 관리를 위해 샘플을 무균으로 제거할 수 있습니다. 원 안의 회색 숫자는 튜빙 세트를 통해 액체 경로를 지시하는 프로세서의 번호가 매겨진 밸브를 나타냅니다. 11의 허가를 받아 복제했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> 그림 2: 활동 매트릭스. T 세포 선택 및 활성화 후 CAR-T 세포 제조 공정의 나머지 부분은 완전히 맞춤화할 수 있습니다. 활동을 추가하거나 삭제할 수 있으며 적절한 날짜와 시간에 예약할 수 있으며 활동 이후의 문화권 볼륨(Volume)을 지정할 수 있습니다. 예를 들어, 형질도입 활성은 1일차 오전 10:00에 시작하도록 구성되었고, 활동 종료 시 배양 부피는 100mL로 설정되었습니다. 활동 매트릭스는 재배 기간 동안 편집할 수 있습니다. 프로세스 상태는 처리 장치의 통합 화면에서 모니터링할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 원고의 목적은 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고 규제 기관이 임상시험용 신약(IND) 신청을 승인하는 데 필요할 수 있는 공정 중 및 제품 출시 테스트에 대한 지침을 추가로 제공하는 것입니다. 제시된 프로토콜은 공급업체가 권장하는 접근 방식에 가깝고 현재 단일 센터 연구자 주도 I/II 상 임상 시험에서 평가되고 있는 IND 28617의 기본 프로토콜입니다. 이 임상시험은 B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 또는 B 계통 림프구성 림프종(B-Lly) 환자를 위한 인간화 CD19 지향 자가 CAR-T 세포를 제조하기 위해 이 프로세서를 사용하는 것의 안전성과 효능을 결정하는 것을 목표로 합니다[NCT05480449]. 이 임상시험은 2022년 9월에 시작되었으며 B-ALL 또는 B-Lly에 0-29세 환자 최대 89명을 등록할 계획입니다. 우리는 원고에 시험의 일부 제조 결과를보고합니다.
원고는 따라야 할 단계가 포함된 프로토콜로 제시되었지만, 다른 사람들이 자신의 CAR-T 세포 제조 공정을 최적화하기 위한 출발점으로 간주되어야 한다는 점을 지적하고 싶습니다. 제시된 프로토콜에 대한 가능한 변이의 비포괄적 인 목록은 다음을 포함합니다 : 동결 보존 된 T 세포 대신 신선한 T 세포를 시작 물질로 사용; 다른 T 세포 농축 방법을 사용하거나 완전히 생략하는 단계; IL2 대신 IL7/IL15와 같은 다른 배지 및 사이토카인 칵테일을 사용합니다. 인간 AB 혈청의 농도를 변화시키거나 완전히 생략하는 것; 형질도입 시기; "multi-hit" transductions를 사용하여; 다양한 교반, 배양량 및 먹이 일정; 핵산 또는 비-렌티바이러스 벡터의 전기천공법을 포함하는 다양한 유전자 전달 방법을 사용하는 단계; 상이한 최종 제형 완충액 및/또는 동결 보호제를 사용하는 단계; 나중에 주입하기 위해 냉동 보관하는 대신 CAR-T 세포를 신선하게 주입합니다. 이러한 변화는 치료 제품의 세포 조성 및 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>전체 프로세스 단계</td>
			<td>프로세스 데이</td>
			<td colspan="4">제품 상세 정보</td>
		</tr><tr><td>세포 농축</td>
			<td rowspan="2">0일차</td>
			<td colspan="4">CD4+/CD8+ T 세포 선택</td>
		</tr><tr><td>세포 활성화</td>
			<td colspan="4">T 세포 배양 파종 및 활성화</td>
		</tr><tr><td>세포 형질도입(Cell Transduction)</td>
			<td>1일차</td>
			<td colspan="4">렌티바이러스 transduction(배양 용량 100mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">세포 확장(세포 제형 후)</td>
			<td>2일차</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>3일차</td>
			<td colspan="4">배양 세척(1 사이클); 셰이커가 활성화되었습니다. 배양 부피가 200mL로 증가</td>
		</tr><tr><td>4일차</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>5일차</td>
			<td colspan="4">사료 (50 mL); 배양 용량이 최종 용량 250mL에 도달</td>
		</tr><tr><td>6일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>7일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확</td>
		</tr><tr><td>8일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-150 mL / +150 mL) 또는 수확</td>
		</tr><tr><td>9일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>10일째</td>
			<td colspan="4">공정 중 샘플; 배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>11일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>12일째</td>
			<td colspan="4">배지 교환(-180 mL / +180 mL) 또는 채취</td>
		</tr><tr><td>13일째</td>
			<td colspan="4">수확</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 프로세스 타임라인 및 개요. 이 표는 현재 임상 시험에서 사용되는 TCT 프로세스 단계를 요약한 것입니다[NCT05480449]. 이 과정은 CD4+/CD8+ 선택에 의한 T 세포 농축, 배양 파종 및 0일차에 활성화로 시작되며, 1일차에 형질도입이 이어집니다. 세포를 48시간 동안 휴지시킨 후 배양 세척, 배양량을 200mL로 늘리고 진탕 메커니즘을 사용하여 교반합니다. 6일째에 첫 번째 공정 중 샘플을 채취합니다. 최소 3회 용량의 CAR-T 세포(환자가 &lt;50kg인 경우 5 × 10 6 CAR-T 세포/kg, 그렇지 않으면 2.5 × 108 CAR-T 세포) 및 품질 관리 테스트(~2 × 106 CAR-T 세포)에 충분한 세포가 확보되면 세포를 채취합니다. 또는 배양이 총 4-5 x 109 세포에 도달하면. 약어: TCT = T 세포 형질도입; CAR-T = 키메라 항원 수용체 T 세포; MACS = 자기 활성화 세포 분류.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 붕규산 튜브</td><td>Charles River</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>20mL 시약 백</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원추형 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>150mL 전사 세트</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>2,000mL 전사 세트</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BDB559925</tr><tr><td>알코올 준비</td><td>Tyco/Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bag Access</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 CAR 감지 시약 비오틴</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 참조 비드 10um</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 참조 비드 15um</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 참조 비드 5um</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 슬라이드</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>CD4 시약</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>CD8 시약</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA 완충액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>완충액</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Origen</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>냉동 백 50mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>냉동 바이알, 1.8mL</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>냉동 바이알, 4.5mL</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>인간 AB 혈청</td><td>Valley Biomedical</td><td></td><td>Sterile 여과, 열 비활성화</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민 25%</td><td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민 5%</td><td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP 재조합 인간 IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>사이토카인</td></tr><tr><td>MACS GMP T Cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>활성화 시약</td></tr><tr><td>MycoSeq Mycoplasma 감지 키트</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 하이포더믹 14G</td><td>Medline</td><td>SWD200573</td><td></td></tr><tr><td>바늘, SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 2-200 &mu; L, 개별 포장</td>된 <td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 팁, 50-1000 &mu; L, 개별 포장</td>된 <td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>Pipets 10 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>Pipets 25 mL</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipets 5 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>Baxter</td><td>2B2544X</td><td>전해질 솔루션</td></tr><tr><td>Prodigy TS520 Tubing Set</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>튜빙 세트</td></tr><tr><td>멸균 필드</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>주사기 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>주사기 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td> 주사기 30 mL BD 302832 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP 매체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>매체</td></tr><tr><td>삼중 샘플링 어댑터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>바이러스 벡터</td><td>CHOP 임상 벡터 코어</td><td></td><td>huCART19</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety 캐비닛</td><td>The Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>프로세서</td></tr><tr><td>제어 속도 냉동고</td><td>대패 / Kryosave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler 밸런스</td><td>메틀러</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 멸균 튜빙 용접기</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sebra 튜브 실러</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>Barkey</td><td></td><td>건식 해동 장치</td></tr><tr><td>XN-330 혈액학 분석기</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 t 세포 제조

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 다양한 악성 및 비악성 질환 치료를 위한 유망한 면역 치료 접근법을 나타냅니다. CAR-T 세포는 세포 표면 표적을 인식하고 결합하여 표적 세포를 죽이는 키메라 단백질을 발현하는 유전자 변형 T 세포입니다. 기존의 CAR-T 세포 제조 방법은 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 오염 위험이 있을 수 있습니다. 자동화된 세포 프로세서인 CliniMACS Prodigy를 사용하면 폐쇄형 시스템에서 임상 규모로 세포 치료제를 제조할 수 있어 오염 위험을 최소화할 수 있습니다. 처리는 컴퓨터의 제어 하에 반자동으로 이루어지므로 프로세스에 대한 사람의 개입을 최소화하여 시간을 절약하고 변동성과 오류를 줄입니다.
이 원고와 비디오는 이 프로세서를 사용하여 CAR-T 세포를 제조하기 위한 T 세포 형질도입(TCT) 공정에 대해 설명합니다. TCT 과정에는 CD4+/CD8+ T 세포 농축, 활성화, 바이러스 벡터를 사용한 transduction, 확장 및 수확이 포함됩니다. 이러한 단계의 순서와 타이밍을 허용하는 기능인 활동 매트릭스를 사용하여 TCT 프로세스를 광범위하게 사용자 지정할 수 있습니다. 당사는 현행 우수제조관리기준(cGMP)을 준수하는 CAR-T 세포 제조에 대한 실무를 제공하고 임상시험용 신약(IND) 신청을 지원하는 필수 방출 테스트 및 전임상 실험에 대해 논의합니다. 임상 CAR-T 세포 제조를 위한 반자동 공정 사용의 타당성을 입증하고 장단점에 대해 논의합니다. 마지막으로, 소아 B세포 악성종양[NCT05480449]을 표적으로 하는 연구자 주도 임상시험을 이 제조 공정이 임상 환경에서 어떻게 적용될 수 있는지에 대한 예시로 설명합니다.

NCT05480449 임상시험의 초기 3회 CAR-T 제조 실행 결과는 아래 표 3에 나와 있습니다. 출발 물질, 벡터, 배양 사이토카인 및 AB 혈청 농도는 각 실행에 대해 일관되게 유지되었습니다. 제품은 7일 또는 8일에 수확되었습니다. 하루 평균 세포 성장율은 46%(총 세포 수 증가)였으며, 이는 TCT 과정이 세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 이러한 결과는 프로세서가 일관되고 재현 가능한 CAR-T 세포 산물을 생산할 수 있음을 시사합니다.
표 4에 요약된 최종 제품 테스트 결과는 CAR-T 세포가 품질 관리 표준을 통과했음을 보여줍니다. 세포 생존율은 88%에서 94% 사이였고 CD3 T 세포 순도는 89-93%였습니다. 중요한 것은 내독소, 마이코플라스마, 불임, 복제 가능한 렌티바이러스 및 잔류 백혈병 세포가 검출되지 않았다는 것입니다. 이러한 결과는 TCT 공정이 임상 사용을 위한 규제 기...

이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

우리 프로토콜의 장점은 여전히 유연성을 제공하는 반자동 폐쇄형 시스템이라는 것입니다. 노동 집약적인 단계는 컴퓨터에서 실행되는 자동화로 대체되며, 컴퓨터에서 실행되기 때문에 사용자가 프로토콜을 사용자 지정할 수 있습니다. 이 모든 것은 폐쇄형 시스템에서 수행됩니다.우리는 병원에서 흔히 볼 수 있는 줄기세포 실험실이 상용 대체품보다 훨씬 저렴한 비용으로 임상 등급의 CAR-T 세포를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것을 발견했습니다. 우리는 우리의 공정이 다른 표적에 대한 CAR-T 세포 특이성을 만들고 다른 유형의 세포 및 유전자 치료제를 제조하는 데 쉽게 적용될 수 있다고 생각합니다. 우리 팀은 다른 CAR-T 세포 표적과 새로운 유전자 치료법을 탐구할 준비가 되어 있습니다.더 넓은 범위에서 세포 및 유전자 치료는 빠르게 확장되고 있으며, 당사는 이 흥미로운 분야에서 계속 지원하고 혁신할 수 있게 되어 기쁩니다.

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이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 프로토콜의 목표는 폐쇄형 사이토카인 포획 시스템을 통합하고 전담 직원이나 GMP 시설의 사용이 필요하지 않은 벤치탑의 자동화된 2세대 세포 농축 장치를 사용하여 병원체 특이적 임상 등급 T 세포를 제조하는 것입니다. 생성된 거대세포바이러스 pp65 특이적 T 세포는 환자에게 직접 투여할 수 있습니다.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

우리는 안정적으로 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 생성하고 시험관 내 및 생체 내에서 그들의 분화 및 기능을 테스트하는 접근 방식을 설명합니다.

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

이 프로토콜은 관심 유전자를 가진 일차 인간 T 세포를 형질도입하는 과정을 간략하게 설명하여 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준과의 호환성을 보장합니다.

유전자 변형 T 세포 생성을 위한 GMP 준수 절차

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

이 프로토콜은 mRNA 전기천공에 의한 일차 T 세포의 분리, 활성화, 증식, 일시적 형질전환 등 원차 T 세포 배양의 필수 단계를 설명합니다. 또한, 표현형, 활성화 마커, 생존 가능성 및 키메라 항원 수용체(CAR) 발현의 유동 세포 분석을 위한 워크플로우 및 항체 패널도 제안됩니다.

1차 인간 T 세포의 분리, 배양 및 일시적 형질인화를 통해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 방법

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

학습하세요 자동화된 세포 프로세서를 활용한 CAR T-세포 반자동 생산 방법을. 바이러스 전달 및 배양 과정을 통해 임상용 세포를 경제적으로 제조하는 유연한 폐쇄 시스템을 탐색하세요.

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조

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