Name: 암의 마우스 모델에서 정맥 혈전증 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: 배우세요 혈관 클립을 사용한 정제된 수술 기법으로 콜론 암 이종이식 마우스 모델에서 정맥 혈전증을 평가하는 방법을. 이 최적화된 프로토콜은 혈전 측정의 일관성과 재현성을 향상시켜 암 관련 혈전증 기전 연구와 신약 개발에 기여합니다.

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이 연구는 AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078(KR, VCC, XY 및 SL) 및 R01HL166608(KR 및 VCC)의 지원을 받았습니다.

이 연구를 위해 생후 8-12주, 체중 20-25g의 암컷 C57Bl6/J 마우스 16마리를 사용했습니다. 쥐는 표준 조건 하에서 수용되었고 차우와 물을 adlibitum으로 먹였습니다. 이 연구는 보스턴 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 여기에 설명된 개방 절차는 무균 상태에서 수행되었습니다.
1. 이종이식 모델
<ol><li>세포 배양<ol><li>이종 피하 이식 전에 MC-38 세포를 단층으로 80% 밀도까지 성장시킵니다.</li>
		<li>트립신화 및 10% FBS 함유 배지의 재현탁 후, 277 x g, 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 무혈청 배지의 세포를 1 x 104 MC-38 cells/μL 무혈청 배지의 농도로 재현탁시킵니다.<ol><li>트립신화의 경우 MC-38 세포가 원하는 합류점(보통 약 70%-80%)에 도달할 때까지 배양한 다음 페트리 접시에서 배양 배지를 흡인합니다.</li>
			<li>트립신-EDTA 용액 1mL를 추가하고 트립신으로 세포를 37°C에서 1분 동안 배양하여 분리를 허용합니다. 페트리 접시를 부드럽게 두드리거나 흔들어 균일하게 분리되도록 합니다.</li>
			<li>혈청 또는 트립신 억제제를 함유한 배양 배지를 추가하여 활성을 중화하고 추가 세포 해리를 방지합니다. 중화된 트립신 용액과 함께 분리된 세포를 수집합니다.</li>
			<li>재현탁의 경우, 트립신화를 통해 세포가 분리되면 이식 또는 추가 실험을 준비합니다. 수집된 세포 현탁액을 277 x g 으로 원심분리하여 세포를 펠트합니다.</li>
			<li>상층액(세포 펠릿 위의 액체)을 조심스럽게 제거합니다. 9mL의 배양 배지, 완충액 또는 용액을 세포 펠릿에 추가하여 이식 또는 실험을 위해 원하는 세포 농도를 얻습니다.</li>
			<li>위아래로 피펫팅하거나 배양 플라스크 쉐이커를 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 세포를 손상시킬 수 있는 격렬한 피펫팅을 피하십시오. 참고: 사용된 변이체 또는 세포주에 따라 세포를 1:1 비율로 용해된 기저막 매트릭스와 무혈청 배지로 재현탁시켜 이식 후 매우 공격적인 마우스 세포 성장 및 확산을 늦출 수 있습니다. 모든 세포 배양 단계는 특별히 할당된 공간에 있는 세포 배양의 완전한 무균 후드에서 수행해야 하며 마이코플라스마 검사를 정기적으로 받아야 합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>제공된 수동 프로토콜에 따라 자동화된 셀 카운터로 셀을 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 이식<ol><li>다음과 같이 실험군에 8마리의 마우스를, 대조군에 8마리의 마우스를 무작위로 배정한다. 대조군에서는 MC38 이종이식이 있는 마우스를 사용하고 폴리프로필렌 5-0 봉합사로 IVC 결찰을 수행합니다. 실험군에서는 MC38 이종이식이 있는 마우스를 사용하고 맞춤형 혈관 클립으로 IVC 결찰을 수행합니다.</li>
		<li>마우스를 왼쪽 측면 누워있는 자세에 놓고 앞다리와 뒷다리 사이의 오른쪽을 면도합니다. 등쪽 요추 부위를 따라 알코올과 요오드를 도포하여 주사 부위를 무균 상태로 준비합니다.</li>
		<li>200μL의 배지로 준비된 2 x 106 MC-38 세포를 27G 바늘을 사용하여 동물의 가장 말단 갈비뼈와 골반 돌출부 사이의 중간 측면에 피하로 주입합니다.</li>
		<li>주사 후 동물을 주의 깊게 검사하고 다시 케이지에 넣습니다. 동물은 다음 사항에 대해 검사해야 합니다. 1. 생쥐의 행동, 활동 수준 및 전반적인 이동성의 변화. 중요한 변화는 불편함이나 건강 문제를 나타낼 수 있습니다. 2. 털의 질, 그루밍 습관, 눈에 보이는 고통이나 이상 징후를 포함한 쥐의 전반적인 신체 상태 3. 음식 섭취와 수분 섭취로 돌아가기 4. 활동 수준, 자세 또는 케이지 동료와의 상호 작용에 대한 모든 변화. 무기력증이나 공격성 증가는 고통의 징후일 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 종양 성장의 추적 관찰
<ol><li>3-4주 동안 종양 성장 추세에 대해 격주로 동물을 모니터링합니다. 캘리퍼스로 종양을 측정하고 종양 크기를 기록합니다.<ol><li>가장 긴 축(L)과 긴 축에 수직인 축(W)을 따라 종양을 측정합니다. 방정식 L x (W2) = V를 사용하여 종양 부피 (V)를 계산합니다. 종양의 크기가 각 치수에서 20mm를 초과하거나 종양에 궤양의 증거가 있는 경우 실험이 종료되기 전에 동물을 안락사시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 부피가 400mm3에 도달하면, IVC 결찰을 위해 마우스를 사용할 계획을 세운다.</li>
</ol>3. 마취 및 준비
<ol><li>이소플루란 챔버에서 쥐를 마취하고 진통제를 피하 주사합니다: 꼬리 바닥에서 동물을 잡습니다. 동물을 자주 사용하지 않는 손의 등쪽 표면에 두십시오.</li>
	<li>동물을 3%-4% 이소플루란으로 채워진 연속 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 발가락 꼬집기 반사가 없는 상태에서 적절한 전신 마취를 확인합니다. 1%-3% 이소플루란의 유지 용량을 사용하십시오. 양쪽 눈에 수의사 연고를 바릅니다.</li>
	<li>부프레노르핀(통증 완화를 위한 오피오이드)을 사용한 피하 주사: 0.9% 염화나트륨(NaCl)에 0.3mg/mL 농도의 부프레노르핀 스톡을 녹여 0.03mg/mL의 농도를 달성합니다.</li>
	<li>수술 전에 0.05-0.1mg/kg의 부프레노르핀 0.03mg/mL와 멸균 0.9% NaCl 500μL를 피하 주사합니다. 20g의 마우스에는 2μg 또는 66μL의 0.03mg/mL 부프레노르핀이 필요합니다.</li>
	<li>피부 준비: 완전히 마취된 쥐를 가열 담요 위에 누운 자세로 놓습니다. 0.5% 클로르헥시딘 팅크로 복부 앞쪽을 소독합니다. 시술 중 난방 담요의 온도를 자주 확인하고 온도가 떨어지지 않는지 확인하십시오.</li>
</ol>4. IVC 결찰
<ol><li>정중선 개복술<ol><li>복부 피부를 미세한 가위로 절개하여 방광에서 시작하여 복부 피부를 절개합니다. 비외상성 집게로 피부 절개 부위의 복막을 반쯤 꼬집습니다. 절개 부위와 위에 놓인 장 사이에 적절한 공간을 확보하십시오(그림 2A).</li>
		<li>복막을 무혈성 linea alba와 함께 세로로 엽니다.</li>
	</ol></li>
	<li>장을 오른쪽 복부 쪽으로 바깥쪽으로<ol><li>젖은 면 끝으로 내장을 당깁니다. 완전히 축축한 멸균 거즈로 장을 덮으십시오. 덮인 장이 장간막 혈관에 과도한 견인 없이 견인되지 않는 방향에 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>IVC에 대한 왼쪽 신장 정맥의 합류를 포함하여 IVC 및 가지의 전체 노출(그림 2B).<ol><li>200-300 μL의 생리 식염수를 떨어 뜨립니다. 요관, IVC, 대동맥 및 신장 정맥 과정을 탐색합니다(그림 2).</li>
	</ol></li>
	<li>신장 IVC와 좌측 신장 정맥 합류점의 무혈면.<ol><li>폴리프로필렌 6-0 봉합사를 무혈면을 통해 닫힌 팁 비외상성 겸자를 사용하여 꼬리에서 두부까지의 움직임으로 부드럽게 2x-3x 통과시킵니다.</li>
		<li>면봉 t와 함께 제공되는 부드러운 압력으로 최소한의 스며드는 것을 제어하십시오.amp르. 6-0 폴리프로필렌 봉합사를 두개골 움직임에 부드러운 꼬리로 통과시켜 제공된 평면을 넓힙니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생식선 및 요추 가지 소작(그림 2D)<ol><li>최대 4개의 후방 또는 요추 가지가 있을 수 있습니다. 척추 허혈 및 파행의 잠재적인 합병증을 피하려면 현재 프로토콜에서 요추 가지를 그대로 두십시오.</li>
		<li>양측 자궁 뿔 동맥 공급 및 하복부 혈관을 포함한 2-3개의 곁가지가 있는지 확인합니다. 첫 번째 양측으로 존재하는 분기의 일관된 중단을 보장합니다. 왼쪽 신장 정맥과 IVC(infra-renal IVC)의 합류점 바로 원위부에 있는 양측 가지를 소작합니다. 자궁 뿔의 정맥 배출 혈관이 파괴되지 않았는지 확인하십시오. 알림: 곁가지 소작은 매끄럽고 중단 없는 표면을 제공하여 제어되지 않는 출혈 가능성을 줄이기 때문에 선택됩니다. 또한 소작은 10-0 봉합사를 사용한 봉합사 결찰보다 빠르고 실현 가능합니다. 따라서 동물은 더 짧고 안전한 절차에 노출됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>요관의 경로와 혈관을 다시 확인하여 진물이 나오거나 부주의한 소작이 없는지 확인합니다(그림 2C).</li>
	<li>실험군의 혈관 클립을 사용한 IVC 결찰<ol><li>비외상성 집게로 2-0 나일론 봉합사 너비의 혈관 클립을 사용자 정의합니다. 실험군의 맞춤형 혈관 클립을 infrarenal IVC 주위에 둘레로 적용합니다.</li>
		<li>봉합사 위에 혈관 클립을 적용합니다. 1차 봉합 통로는 2-3개의 세심한 꼬리에서 두개골 운동으로 충분한 무혈면을 제공합니다(그림 2E-F).</li>
		<li>준비된 평면을 통해 혈관 클립을 추가로 통과시킵니다. 왼쪽 신장 정맥과 IVC가 합류하는 지점에 평면을 준비하여 사건 없이 클립 통과를 허용할 수 있을 만큼 충분히 넓습니다(그림 2E).</li>
		<li>맞춤형 혈관 클립을 준비된 평면을 통해 IVC 과정에 수직으로 수평으로 놓습니다. 적절한 남은 공간을 확보하기 위해 5-0 폴리프로필렌 봉합사 위에 혈관 클립을 놓습니다(그림 2G).</li>
		<li>혈관 클립 부위의 혈관 손상이나 출혈을 방지하기 위해 위의 단계를 부드럽게 수행하십시오. 잠재적인 진물이 있는지 수술 부위를 관찰하십시오. 진물이 나는 경우 면봉으로 수술 부위에 부드러운 압력을 가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대조군의 봉합사를 사용한 IVC 결찰<ol><li>6-0 폴리프로필렌 봉합사로 봉합 결찰. 5-0 실크 봉합사 위에 준비된 평면의 신장 IVC 주위에 외과용 사각 매듭을 봉합합니다.</li>
		<li>봉합사가 완성되면 실크 봉합사를 부드럽게 제거하여 충분한 잔여 공간을 확보하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>생리식염수 200μL를 피하 주사합니다. 참고: 클램프 적용으로 부분 IVC 폐색에 대한 유사한 기술을 제공하기 위해 현재 연구에서 혈관 클립을 맞춤화하여 입술 사이에 공간을 제공합니다. 그런 다음 혈관 클립을 왼쪽 신장 정맥과 IVC의 합류점에서 준비된 무혈면에 배치합니다.</li>
	<li>연속 실행 4-0 vicryl 봉합사로 개복술을 닫습니다.</li>
</ol>5. 인덱스 수술 후 후속 조치
<ol><li>수술 후 1시간 동안 또는 균형과 교정 능력이 회복될 때까지 동물을 지속적으로 모니터링하고, 완전히 회복될 때까지 격리된 깨끗한 케이지에서 먼저 발생하는 모든 것을 모니터링합니다.</li>
	<li>2일 동안 매일 동물을 모니터링하십시오. 동물이 괴로워 보이면 2일 동안 하루에 두 번 모니터링하십시오. 프로토콜에 따라 수술 후 진통 및 수액을 투여합니다.<ol><li>0.9% 염화나트륨(NaCl)에 0.3mg/mL 농도의 부프레노르핀 스톡을 녹여 0.03mg/mL의 농도를 달성합니다.</li>
		<li>0.05-0.1 mg/kg의 0.03 mg/mL 부프레노르핀을 500 μL의 멸균 0.9% NaCl과 함께 피하 주사하며, 인덱스 수술 후 처음 48시간 동안 8-12시간마다 주사합니다. 20g 마우스의 경우 2μg 또는 66μL의 0.03mg/mL 부프레노르핀이 필요합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 안락사 및 혈전이 포함된 IVC 채취
<ol><li>이소플루란 챔버에서 쥐를 마취하고 꼬리 바닥에서 동물을 잡고 동물을 손의 등쪽 표면에 유지합니다.</li>
	<li>동물을 3%-4% 이소플루란으로 채워진 연속 마취 유도 챔버로 옮깁니다. 동물을 누운 자세로 놓습니다.</li>
	<li>설명된 대로 xiphoid에서 시작하여 방광까지 긴 정중선 개복술을 수행합니다.</li>
	<li>장을 복부 우측으로 바깥쪽으로 내보내고 장골 분기의 원위부에 고정된 IVC를 신장 IVC 범위까지 채취합니다(그림 2G).</li>
	<li>혈전과 종양 채취 후 자궁경부 탈구가 있는 동물을 안락사시킵니다.</li>
</ol>7. 통계 분석
<ol><li>통계 분석을 평균, 중앙값 및 표준 편차(SD) 또는 평균의 표준 오차(SEM), 25번째 또는 75번째 백분위수 또는 최소값과 최대값을 포함한 전체 값 범위로 적절하게 표시합니다. 스튜던트 t-검정과 F-검정을 적절하게 수행합니다. p <0.05 수준에서 통계적 유의성을 평가합니다.</li>
</ol>

혈관 클립을 사용한 마우스 암 모델에서 최적화된 정맥 혈전증 분석

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합성 이종이식 대장암 모델에서는 대조군에 비해 실험군에서 더 높은 혈전성 및 응고 마커 발현을 관찰했습니다. 중요한 것은 이러한 모든 매개변수의 분산이 대조군에 비해 실험군에서 더 낮았다는 것입니다. 수정에는 IVC와 왼쪽 신장 정맥의 합류 지점에 특정 압력 프로파일이 있는 혈관 클립을 도입하는 것이 포함되었습니다. 클립은 5-0 폴리프로필렌 봉합사인 스페이서 위에 놓였습니다. 이 변형은 혈전 크기와 혈전증 마커의 변동성을 줄입니다. 모든 쥐는 100% 생존을 경험했습니다.
기술적 뉘앙스 이 절차에는 몇 가지 단계에 대한 특별한 주의가 포함되었습니다. 개복술 후, 우발적인 부상을 방지하기 위해 양쪽 요관을 철저히 검사했습니다. 최적의 노출을 달성하기 위해 내장은 축축한 거즈로 덮여 있었고 과도한 견인 없이 오른쪽 상부 사분면에 유지되었습니다. 다음으로 IVC 곁가지를 요관, IVC, 대동맥에서 2-3mm 떨어진 곳에서 소작하여 정맥의 손상을 방지하였다. 완전한 지혈을 확인한 후 IVC 결찰을 위한 평면을 준비했습니다. 생쥐의 대동맥과 IVC는 경로를 따라 밀접하게 연결되어 있으며 이를 해부하려고 하면 출혈과 동물의 손실로 이어질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 유일한 예외는 좌측 신장 정맥과 대동맥 합류점21입니다. 그런 다음 집게로 세 번 이하의 세심하고 날카로운 발산 동작을 사용하여 봉합사 통로를 준비했습니다.
생후 8-12주 된 쥐의 IVC 직경은 대략 0.3 내지 0.5mm 범위인 것으로 보고되고 있다. 부분 IVC 결찰 시술은 완전 결찰과 구별할 수 있는 공간을 확보해야 합니다. 현재 연구에서는 스페이서의 0.10-0.15mm에 해당하는 5-0 봉합사 구경을 고려했습니다. 따라서, 혈관 클립 입술 공간을 2-0 봉합사에 맞게 조절하여 0.3mm IVC 및 0.1mm 공간을 위한 적절한 공간을 제공하였다.
폴리프로필렌 봉합사는 무혈 가이드를 제공하여 혈관 클립의 적용을 수용하기 위해 두개골 운동에 대한 반복적인 꼬리로 평면을 1-2mm 더 넓힐 수 있도록 했습니다. 마지막으로, 5-0 폴리프로필렌 봉합사와 호환되는 입술 잔여 공간이 있는 맞춤형 혈관 클립을 배치했습니다.
혈관 폐쇄를 위한 백금과 같은 귀금속 클립에 대한 선택은 이러한 물질이 상대적으로 불활성이고 특정 흡수성 및 지연된 흡수성 봉합사22,23,24에 비해 물질 유발 염증을 감소시킨다는 사실에 의해 주도됩니다. 이 금속 클립은 화학 반응에 강하여 안정적입니다. 이것은 봉합사 재료를 사용하는 것에 비해 염증 위험이 낮은 더 안전하고 효과적인 대안으로 이어집니다.
모델의 변환 관련성 쥐 정맥 혈전증 모델은 인간의 심부정맥 혈전증과 근본적으로 다릅니다. 첫째, 설치류 모델에서 혈전 형성은 상류 방향으로 관찰됩니다. 그러나, 임상 VT는 나이더스(nidus) 25,26으로부터 하류에 형성된다. 둘째, 인간과 생쥐 모델 간의 인과 관계는 다릅니다. 인간의 경우 혈전 형성은 혈류 방해가 뒤따르는 지표 현상입니다. 한 가지 예외는 메이-서너 증후군이다. 메이-서너 증후군은 척추와 우측 장골동맥 사이에 위치한 좌측 장골정맥에 가해지는 외압이 증가하여 좌측 장골정맥 혈전증 또는 좌측 장골정맥의 혈전의 위험이 높아지는 질환을 말합니다. 마우스 모델에서는 정맥 흐름의 방해가 주요 사건이며, 이는 혈류의 둔화와 혈전 형성을 초래한다25.
대퇴 정맥 전해 손상 모델12와 같은 다른 모델과 비교할 때 IVC 정체는 분명한 이점을 제공합니다. 이를 통해 IVC 필터, 카테터 유도 혈전용해 및 내강 재개통과와 같은 국소 치료 조치를 검사할 수 있으며 혈류가 있는 상태에서 혈전 형성을 위한 환경을 제공할 수 있습니다. 이에 의해, 내피 손상과 정체의 두 팔이 이 모델에서 검사됩니다. IVC의 혈전은 또한 폐색전증과 같은 합병증의 더 높은 발생과 관련이 있습니다. 한 가지 한계는 IVC가 인간에게 DVT의 덜 흔한 부위라는 것입니다.
3R(Reduction-Refinement-Replacement) 프레임워크 동물 모델에 3R 프레임워크를 통합하는 것이 중요합니다. 3R 프레임워크의 통합은 동물의 고통을 제한하고 윤리적이고 책임감 있는 동물 연구 관행을 촉진합니다. 3R은 쥐에서 사망률이 관찰되지 않았기 때문에 현재 발견에 적용됩니다. 또한 연구에 더 적은 수의 동물을 사용할 수 있습니다. 따라서 마우스의 수와 비용을 줄일 수 있습니다.
연구 제한 사항 클립 방법의 가능한 한계는 테스트된 혈관 클립의 상대적으로 좁은 압력 프로파일 범위를 포함합니다. 따라서 광범위한 압력 프로파일에 대한 추가 연구가 설계될 수 있습니다. 종전의 연구들은 면역력이 저하된 균주 마우스가 혈전 형성에 더 취약하다는 것을 보여주었고, 응고 중량은 면역 능력이 있는 마우스에서 다를 수 있다12. 향후 연구에서는 다양한 마우스 균주 배경에서 혈전 중량의 일관성 정도를 조사하는 것이 좋습니다.
결론 현재 방법은 부분 IVC 결찰 모델을 통해 정맥 혈전증 연구에 대한 보다 일관된 측정을 제공합니다. 우리는 이 수정을 통해 강력하고 신뢰할 수 있는 쥐 모델을 생성하여 인간 질병과 관련된 다양한 암 모델을 사용하여 암 관련 혈전증의 결과를 조사할 수 있기를 바랍니다.
현재 연구는 특히 암 관련 혈전증에 초점을 맞추고 있지만, 향후 연구에서는 다양한 동반 질환(예: 비만, 만성 신부전)의 마우스 모델과 혈전증의 위험을 증가시키는 정상 마우스에 대한 포괄적인 분석을 수행할 것입니다.

암 관련 정맥 혈전 색전증(VTE) 정맥혈전색전증(VTE) 위험은 암 생존자가 일반 인구에 비해 4-7배 더 높습니다 1,2,3. 이 질환은 암 환자 7명 중 1명에게 치명적이다. VTE의 발생률은 암의 종류와 종양 부담에 따라 다르며, 췌장암과 위암 환자에서 가장 높다4.
암 환자에서 암 관련 VTE는 예후적으로 중요합니다. 암 진단 후 첫 해에는 연령, 인종, 기저암의 병기를 조정한 후에도 전체 생존율이 좋지 않은 것으로 나타났다5. 이러한 발견은 암과 관련된 VTE를 검사하는 것의 중요성과 동물 모델을 사용하여 그 메커니즘을 조사해야 할 필요성을 강조합니다. 이 영역의 중개적 관련성은 암 환자에서 VTE가 혈전예방과 항혈전제 요법으로 예방되고 치료될 수 있다는 사실에 의해 더욱 강조된다6.
암 및 정맥 혈전증의 동물 모델 암 모델은 일반적으로 이종이식(xenograft)이라고 불리며, 이는 마우스에 암세포를 주입하는 것을 수반합니다. 원점과 같은 부위에 암세포를 주입하는 것을 orthotopic 모델이라고 하며, 다른 부위(옆구리의 피하 평면)에 주입하는 것을 이종성 모델이라고 합니다. 암세포의 기원 종은 HT-29 세포주(인간 결장암)7,8,9와 같은 동종 모델로 암세포를 결정합니다. 반대로, 합성 모델은 RenCa 및 MC-38 세포주 3,10을 포함하는 쥐 암 세포주를 사용합니다.
문헌은 설치류의 동맥, 정맥 및 모세혈관 혈전증 모델을 설명했습니다. 정맥 혈전증은 기계적 손상(가이드 와이어) 또는 완전 IVC 결찰, 화학적 손상(염화제2철) 또는 전해 손상에 의해 하대정맥(IVC)에서 유도됩니다. 염화제2철 유도 혈전증 또는 IVC 결찰은 완전한 폐색 모델을 나타냅니다. 후자는 혈액의 정체를 초래하고 염증성 혈관 침윤을 초래한다11,12,13. 완전한 결찰 모델은 마우스의 95%에서 100%에서 높은 혈전증 형성률을 초래합니다. 부분 IVC 결찰 모델은 외측 장요추 가지의 중단을 포함할 수 있으며, IVC12의 원위 표적 지점에 봉합사 결찰을 적용함으로써 정맥 복귀를 폐지합니다. 때때로, 공간 홀더는 정맥 복귀를 부분적으로 방해하기 위해 사용됩니다. 그러나, 혈전 무게는 현재의 부분 폐색 모델에서 일관되지 않으며, 그 결과 응고 무게와 높이에서 높은 변동성을 초래한다12,14.
이 두 가지 큰 정맥 기계 모델(부분 및 전체)에는 한계가 있습니다. 첫째, IVC 결찰술(정체 모델)은 종종 저혈압을 초래합니다. 혈액은 척추 정맥을 통해 흘러 들어갑니다. 경험이 풍부하지만 이 모델의 사망률은 5%-30%이며 학습 곡선 동안 더 높은 비율이 예상됩니다. 중요한 것은 완전한 폐색 모델은 일반적으로 혈전이 비폐색성인 인간의 심부정맥혈전증(DVT)을 재현하지 않는다는 것입니다. 완전한 폐색은 혈액 유변학적 요인과 약력학적 매개변수를 변경하여 국소 부위에서 화합물의 생체이용률을 변화시킬 수 있습니다. 이러한 한계로 인해, 완전한 교합 모델은 치료 목적과 약물 발견을 위한 새로운 화합물을 테스트하는 데 최적이 아닐 수 있다12.
내피 손상으로 인한 혈류 감소가 있는 정맥 혈전증의 임상적으로 보다 관련성 있는 쥐 모델을 제공하기 위해 내피 파괴가 없는 상태에서 혈류 제한에 의해 DVT가 유발되는 정맥 혈전증 모델이 도입되었습니다. 모델은 주사 전자 현미경15에 의해 검증되었습니다. 선호되는 임상적으로 관련된 혈전증 모델은 약물 발견을 가능하게 하는 거의 완전한 혈전증을 가진 모델입니다. 현재의 부분 교합 모델에서의 응고 형성은 일관되지 않으며, 그 결과 응고 무게와 높이에서 높은 변동성을 초래한다12,16. 더욱이, 응고 중량은 기존 방법으로는 가변적이어서 연구당 더 많은 마우스가 필요하다12.
이전의 암 관련 혈전증 모델은 결장암, 췌장암 및 폐암에 초점을 맞추었으며 모두 완전한 폐색 모델이었다17,18,19. 이 원고는 부분 폐색 혈전증 모델을 수정하여 가변성과 마우스 사망률이 낮은 혈전을 제공합니다(그림 1). 이전 연구에서는 면역이 손상된 흉선혈 마우스 배경 19,20,21에 동종 암 세포주를 사용했습니다. 이 원고는 C57Bl6/J 마우스에서 MC-38 세포 합성 이종이식을 사용하여 면역 능력이 있는 마우스를 사용하고 혈전 형성에 대한 면역 성분을 검사할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>부프레노르핀 0.3 mg/mL</td><td>PAR 제약</td><td>&nbsp; NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>The Jackson Lab</td><td>IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>12777-830</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>Ab9498</td><td></td></tr><tr><td>셀 카운터</td><td>MOXIE</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>클램프</td><td>&nbsp; 고급 과학 도구</td><td>&nbsp; &nbsp; 13002-10</td><td></td></tr><tr><td>클립 ASSI. B2V 단일 클램프, 범용,</td> <td>정확한 수술 및 Scientific Instruments</td><td>PR 2 144.50 289.00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Fibrin</td><td>Millipore</td><td>MABS2155-100UG</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - 대형 루프</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Hill Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13111-12</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>&nbsp; Covetrus</td><td>NDC 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>MC-38 셀</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCC172</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon Eclipse 반전 현미경</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>&nbsp; 14079-10</td><td></td></tr><tr><td>봉합사- Vicryl</td><td>AD-Surgical</td><td>#L-G330R24</td><td></td></tr><tr><td>봉합사-나일론 2-0</td><td>Ethilon</td><td>664H</td><td></td></tr><tr><td>봉합사-프롤렌 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8661G</td><td></td></tr><tr><td>봉합사-프롤렌 6-0</td><td>Ethicon</td><td>PDP127</td><td></td></tr><tr><td>VEV03100</td><td>VisualSonics</td><td>FujiFilm</td><td></td></tr><tr><td>Vitrogel Matrigel Matrix</td><td>The Well Bioscience</td><td>VHM01&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

암의 마우스 모델에서 정맥 혈전증 분석

Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer

이 방법론 논문은 특히 암 관련 혈전증(CAT)의 맥락에서 정맥 혈전증의 설치류 모델의 외과적 뉘앙스를 강조합니다. 심부 정맥 혈전증은 암 생존자에게 흔한 합병증이며 잠재적으로 치명적일 수 있습니다. 현재의 쥐 정맥 혈전증 모델은 일반적으로 봉합사를 사용하여 하대정맥(IVC)의 전체 또는 부분적인 기계적 폐색을 포함합니다. 이 시술은 혈액의 전체 또는 부분 정체와 내피 손상을 유도하여 혈전 형성을 유발합니다. 현재 모델은 혈전 중량의 높은 변동성, 상당한 사망률, 학습 곡선 연장과 같은 한계가 있습니다. 이 보고서에서는 이러한 한계 중 일부를 해결하기 위해 혈관 클립을 사용한 수술 개선법을 소개합니다. 합성 대장암 이종이식 마우스 모델을 사용하여 맞춤형 혈관 클립을 사용하여 대정맥을 결찰했습니다. 이 클립은 IVC 결찰 후 5-0 폴리프로필렌 봉합사와 유사한 잔류 립 공간을 허용합니다. 봉합사 방법을 사용한 마우스가 대조군으로 사용되었습니다. 혈관 클립법은 봉합사법보다 가변성이 적고 일관되게 재현 가능한 부분 혈관 폐색과 더 큰 응고 무게를 가져왔습니다. 더 큰 응고 중량, 더 큰 응고 질량 및 IVC 내강 표면적에 대한 응고는 6-0 폴리프로필렌 봉합사에 비해 혈관 클립의 더 높은 압력 프로파일로 인해 예상되었습니다. 이 접근법은 그레이 스케일 초음파에 의해 검증되었으며, 봉합 방법에 비해 혈관 클립이 있는 대정맥에서 일관되게 더 큰 혈전 덩어리를 보여주었습니다. 이러한 관찰은 면역형광 염색으로 더욱 입증되었습니다. 이 연구는 생쥐에서 정맥 혈전증 모델을 생성하는 개선된 방법을 제공하며, 이는 CAT의 기계론적 이해와 약물 발견과 같은 중개 연구에 사용할 수 있습니다.

생후 8-12주의 암컷 C57Bl6/J 마우스 그룹에 세포 성장의 로그 단계에서 MC-38 세포를 주입했습니다. 이종이식은 주사 후 3주와 4주 사이에 빠르게 성장했다18. 종양이 평균 400mm3의 부피에 도달하면, 마우스를 대조군과 실험군에 무작위 배정하였다. 대조군은 봉합사로 IVC 결찰술을 받았고, 실험용 마우스는 혈관 클립을 사용하여 IVC 결찰을 받았습니다. 대조군과 실험군의 종양 부피는 유의한 차이 없이 비슷했다(353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46.2mm3, p=0.445). 혈전을 포함하는 장골 정맥의 분기점에 대한 신장 IVC를 48시간 후에 채취하고, 혈전 중량은 정맥 혈전성의 생물학적 판독 역할을 했습니다. 대조군과 실험군의 모든 동물에서 수술 후 경과는 자궁 뿔 변색, 근골격계 허혈 또는 하지의 파행 문제의 증거 없이 별다른 사건이 없었습니다. 두 번째 개복술에서는 혈관 클립 변위가 관찰되지 않았습니다. 실험이 종료되기 전에 사망률은 관찰되지 않았다.
정상화된 체중 비율에 대한 혈전 중량 이종이식이 있는 마우스는 체중이 감소할 가능성이 높기 때문에 혈전 중량(mg)은 수확 시 총 체중(둘 다 mg)으로 정규화되었습니다. 실험군의 마우스에서 대조군 마우스(±±0.001453 ± 0.002666, P-값: 0.0019; 그림 3).
면역형광 분석 조직병리학적 평가는 IVC 및 혈전을 검사하는 데 사용되었습니다. 대정맥의 파라핀 포매 절편은 항-CD31(내피 세포의 마커)20 및 항-피브린 및 DAPI로 염색되었습니다(그림 4A).
대조군 마우스의 infraarenal vena cava는 온전한 CD31 염색과 혈관의 내강을 부분적으로 차지하는 피브린을 보여주었습니다. 실험군에서는 CD31 발현이 온전하지 않았으며, 이는 내피 세포 손상과 피브린 발현이 두드러진 큰 혈전을 시사합니다. 혈관 벽은 또한 피브린 염색을 나타냈습니다(그림 4A).
면역형광의 경우, 피브린 마우스 단클론 항체를 1:1000 희석하여 4°C에서 밤새 배양하였다. CD31의 경우, 면역블롯 및 IF(4°C에서 1:1000 및 1:100 하룻밤)에 대해 검증된 토끼 다클론 항-CD31 항체를 사용했습니다. 이 항체는 마우스, 인간 및 돼지 CD31에 대해 반응하는 것으로 알려져 있습니다. IF의 경우, 2차 항체는 실온에서 45분 동안 1:250 희석하여 Alex Fluor 488, 594 및 647로 구성되었습니다.
이미지 정량화를 위해 전체 슬라이드를 전동 무대 시스템으로 스캔했습니다. 이미지는 ImageJ에서 처리되었으며, 여기서 신호는 그레이스케일로 변환되었고, 픽셀의 수와 강도는 적분 밀도로 분석되었습니다. 정맥 영역은 관심 영역으로 표시되었습니다. 모든 이미지들의 통합 밀도는 그 면적(18)으로 정규화되었다.
이들은 암과 관련된 심부정맥 혈전증 모델에서 상향 조절되는 것으로 나타났습니다. 여러 이미지의 정량화는 이전에 이미지 J18을 사용하여 수행된 것과 같이 통합 밀도 분석을 사용하여 수행되었습니다. 대조군은 실험군에 비해 피브린 발현이 현저히 낮았다(p:0.0080; 그림 4B; 174 ± 104 대 503.5 ± 182.4 평균 ± SD). 주목할 만한 점은 피브린 발현의 분산이 대조군에 비해 실험에서 더 낮았다는 점이다(F 통계량, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
그레이스케일 초음파 수술 2일 후, 혈전 채취 직전에 생쥐는 회색조 초음파 검사를 받았습니다. 두 그룹의 마우스는 infrarenal vena cava에서 혈전을 보였다. 그러나 혈전은 혈관 클립이 있는 마우스에서 더 컸습니다. 대표적인 초음파 이미지는 그림 5에 나와 있습니다. 혈관의 무반향 영역은 특허 내강을 암시하고 혈관의 과반향 밀도는 조직화된 혈전을 나타냅니다. 대조군 마우스의 결찰된 적극내정맥(infrarenal vena cava)은 그림 5A에서 두 개의 노란색 화살촉으로 구분된 부분 혈전을 보여줍니다. 대조적으로, 그림 5B 는 혈관 클립 모델(두 개의 노란색 화살촉으로 표시되고 흰색 별표로 표시)로 생성된 대정맥을 거의 폐색하는 큰 혈전을 보여줍니다. 주목할 점은, 대정맥이 실험군에서는 확대된 반면, 대조군에서는 붕괴되었는데, 이는 대조군에서 더 큰 혈전 부담과 일치한다는 점이다.
두 분석법(초음파 및 IF) 모두 실험군이 대조군보다 일관되게 더 큰 혈전을 가지고 있음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig01.jpg"> 그림 1: IVC-대동맥과 좌측 신장 정맥(LRV)-IVC의 합류점에 클립을 적용한 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig02.jpg"> 그림 2: 클립을 사용한 수술 중 IVC 혈전증 모델 . (A) 정중선 개복술. (B) IVC에 대한 왼쪽 신장 정맥의 합류를 포함하여 IVC의 전체 노출. (C) 요관 과정을 시연하고 왼쪽 요관에 대한 의인성 외상을 피합니다. (D) 생식선 가지를 소작합니다. (E) 왼쪽 신장 정맥 합류 지점에 대한 IVC 절개. (F) 5-0 폴리프로필렌 봉합사를 절개면에 통과시켜 봉합사를 통과시키기 위한 평면을 넓히는 단계. (G) 준비된 평면을 통해 혈관 클램프를 통과시키는 단계. (H) IVC 클램핑 후 48시간 후에 응고 형성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig03.jpg"> 그림 3: 혈관 클립 IVC 결찰을 받은 마우스 그룹은 정상화된 혈전 대 체중 비율이 더 높았습니다. 평균 정규화된 혈전 대 체중 비율. 밀리그램으로 표시되는 두 값의 단위입니다. 오차 막대 = SD. 스튜던트 t-검정이 적용되었습니다. P &lt;0.0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig04v2.jpg"> 그림 4: 혈관 클립 IVC 결찰을 받은 마우스 그룹에서 피브린 및 CD 31 발현 증가. 봉합사를 사용한 IVC 결찰을 시행한 대조군과 혈관 클립을 사용한 IVC 결찰을 시행한 실험군에서 100배 배율로 얻은 대표 면역형광 이미지. 마우스당 무작위로 선택된 이미지가 표시됩니다(N= 마우스/그룹 4개). (A) 대조군 및 실험군에서의 피브린 및 CD31 발현. 흰색 별표로 표시된 두 개의 노란색 화살촉은 IVC를 거의 막고 있는 큰 혈전을 나타내며, 이는 부분적으로 폐색된 IVC를 의미합니다. (B) 피브린의 통합 밀도: 선은 중앙값을 나타냅니다. 학생의 T-검정을 수행했습니다. p-값 = 0.0080. 대조군 및 실험군의 혈전을 포함하고 항-CD31 및 Alexa Fluro 2차 항체로 염색한 대표적인 대정맥 이미지의 IF 염색. 400x 배율이 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig05.jpg"> 그림 5: 혈관 클립 IVC 결찰을 사용한 마우스 그룹에서 부분적으로 클램핑된 IVC 내 혈전 표면적 증가. 대조군과 실험군의 대표적인 그레이스케일 초음파 영상. (A) 대조군의 대표적인 그레이스케일 도플러 이미지: IVC의 영역은 특허 내강을 암시하는 무반향 영역을 나타내고, 다른 부분은 혈전을 나타내는 과반향 영역을 나타낸다. (B) 실험군의 대표적인 회색조 도플러 이미지: 노란색 화살촉으로 묘사된 IVC 내의 조직화된 혈전(흰색 별표)은 실험군에서 더 두드러졌습니다. 더욱이, 혈전은 시상부에서 두 가지 뚜렷한 방식으로 나타났다. 내강의 중요한 단면을 막는 혈전도 IVC의 다른 쪽에 묘사되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 논문은 정맥 결찰을 달성하기 위해 혈관 클립을 사용하여 마우스 암 모델에서 정맥 혈전증을 평가하기 위한 최적화된 방법을 제시하는 것을 목표로 합니다. 최적화는 혈전증 관련 측정의 변동성을 최소화하고 인간 암 관련 정맥 혈전증과의 관련성을 향상시킵니다.

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis ...

이 연구는 암 관련 혈전증에 초점을 맞춘 정맥 혈전증에 대한 설치류 모델을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 합성 대장암 이종이식 마우스 모델에서 혈관 클립을 사용하여 일관성과 재현성을 개선하고 암 관련 혈전증 기계론적 이해 및 약물 발견을 발전시키는 정교한 수술 기법을 소개합니다. 2012년 IVT 협착 모델에 흐름 감소 모델이 도입되었지만, 지난 10년 동안 암 관련 혈전증 모델에서는 큰 진전이 없었습니다.이것이 이러한 노력의 근거였습니다. 암 관련 혈전증 연구 분야에서 현재 기술에는 스캐닝, 전자 현미경 이미지, 면역형광 염색과 같은 분자 생물학 도구, 정밀 수술 기구, 데이터 분석 소프트웨어 및 데이터 해석, 동물 복지와 같은 고급 이미징 기술이 포함됩니다. 현재 실험적 과제에는 혈전 중량의 가변성, 높은 사망률, 정맥 혈전증의 설치류 모델에서의 장기간의 학습 곡선이 포함됩니다.또한 정맥 흐름 방향과 혈전 형성 메커니즘은 임상 사례와 다릅니다. 당사의 연구 프로토콜은 암 관련 혈전증의 설치류 모델의 격차를 해소합니다. 이종이식 모델에서 혈관 클립을 사용하는 새로운 수술 기법을 도입하여 보다 일관되고 재현 가능한 혈전증 결과를 제공합니다.이를 통해 중개 연구에서 암 관련 혈전증 및 약물 발견에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

venous-thrombosis-assay-in-a-mouse-model-of-cancer

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

하부 대정 맥 혈전증의 마우스 전체 스태시스 모델은 정맥 벽 조직 및 혈전의 같지는 금액을 산출. 이것은 정맥 벽과 occlusive 혈전 사이에 만성 염증으로 급성에서 진행을 평가 상호 작용을 평가하기위한 유용한 입증되었습니다.

하부 대정 맥 혈전증의 마우스 완전한 스테이 시스 모델

이 비디오는 꼬리 정맥 주입을 사용하여 표지된 암세포를 마우스 모델에 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 또한 실시간 생체 내 살아있는 동물 이미징을 사용하여 유방암, 전이 형성 및 성장을 모니터링합니다.

꼬리 정맥 주사: 마우스 모델에서 전이성 연구를 위한 암세포 투여 방법

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

우리가 설명 여기에 열 등 한 베 나 정 맥 협 착 증 깊은 정 맥 혈전 증의 murine 모델. 이 모델이 혈액 흐름 제한, 인 간에 있는 정 맥 혈전 증의 주요 트리거 중 하나.

열 등 한 베 나 정 맥의 협 착 증: 깊은 정 맥 혈전 증의 Murine 모델

현재 프로토콜 스테이 시스 모델을 사용 하 여 정 맥 혈전 증을 얻기에 단계를 설명 합니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 혈전 형성 및 해상도 측정 하는 비-침략 적 방법을 사용 하는.

스테이 시스 고주파 초음파에 의해 모니터링 하는 쥐에 의해 유도 된 깊은 정 맥 혈전 증

생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

결장직장암(CRC) 오가노이드의 포털 정맥 주사는 스트로마가 풍부한 간 전이를 일으킨다. CRC 간 전이의 이러한 마우스 모델은 종양-스트로마 상호작용을 연구하고 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 요법과 같은 신규한 스트로마-지시 치료제를 개발하는데 유용한 도구를 나타낸다.

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

이 논문은 마우스에서 암 절제 수술 중 총 정맥 마취 (TIVA)를 모델링하는 방법을 설명합니다. 목표는 암 환자에게 마취 전달의 주요 기능을 복제하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 마취 기술이 절제 수술 후 암 재발에 어떤 영향을 미치는지 조사 할 수 있습니다.

암 절제 수술 중 전체 정맥 마취의 생체 내 마우스 모델

배우세요 혈관 클립을 사용한 정제된 수술 기법으로 콜론 암 이종이식 마우스 모델에서 정맥 혈전증을 평가하는 방법을. 이 최적화된 프로토콜은 혈전 측정의 일관성과 재현성을 향상시켜 암 관련 혈전증 기전 연구와 신약 개발에 기여합니다.

암의 마우스 모델에서 정맥 혈전증 분석

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