Name: 액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 학습하세요 LC-TIMS-ToF MS/MS를 이용한 히스톤 변형 분석 방법으로, 95% 효율의 추출 프로토콜과 TIMS 기술을 통해 이성질체 분리 및 후성유전학적 변이를 정밀하게 식별하는 기술을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 자료는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 보조금 번호(Grant No.) HRD-1547798 및 보조금 번호 HRD-2111661입니다. 이 NSF 보조금은 CREST(Centers of Research Excellence in Science and Technology) 프로그램의 일환으로 Florida International University에 수여되었습니다. 이것은 Florida International University의 탁월한 프로그램인 Institute of Environment의 기부 번호 1672입니다. 추가 지원은 미국 국립보건원(National Institute of Health)에서 보조금 번호로 제공되었습니다. 프란시스코 페르난데스-리마(Francisco Fernandez-Lima)와 그랜트 번호(Grant No.)R21AI135469 벤자민 A. 가르시아(Benjamin A. Garcia)와 국립과학재단(National Science Foundation)의 그랜트 번호(Grant No.)R01HD106051 CHE-2127882에서 Benjamin A. Garcia에게. 저자는 초기 분석법 개발 과정에서 Mario Gomez Hernandez박사의 초기 지원에 감사를 표하고자 합니다.

Histone Proteomic Analysis 및 Post-Translational Modification Characterization (히스톤 단백질체 분석 및 번역 후 변형 특성 분석)

<ol><li>Zhao, Z., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+of+histones+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications of histones in cancer.</a> Genome Biology. 20, 245(2019).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+16+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).</li>
<li>Kornberg, R. D., Thomas, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+Oligomers+of+the+histones%3A+The+histones+comprise+an+%28F2A1%292%28F3%292+tetramer%2C+a+different+oligomer+of+F2A2+and+F2B%2C+and+monomer+of+F1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1.</a> Science. 184 (4139), 865-868 (1974).</li>
<li>Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modifications+in+atherosclerosis%3A+From+the+past+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future.</a> Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).</li>
<li>Jeanne Dit Fouque, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BDouble-Down%26%2334%3B+mass+spectrometry+of+histone+H4+proteoforms%3A+Tandem+ultraviolet-photon+and+mobility%2Fmass-selected+electron+capture+dissociations%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">34;Double-Down&#34; mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations.</a> Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).</li>
<li>Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+thinking%3A+How+histone+modifications+regulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression.</a> Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+accumulation-serial+fragmentation+%28PASEF%29%3A+Multiplying+sequencing+speed+and+sensitivity+by+synchronized+scans+in+a+trapped+ion+mobility+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device.</a> Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).</li>
<li>Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+characteristics+of+a+new+hybrid+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometer+%28TripleTOF+5600%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600).</a> Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).</li>
<li>Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Workflow+for+ultra-rapid+analysis+of+histone+posttranslational+modifications+with+direct-injection+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry.</a> Bio-Protocol. 10 (18), e3756(2020).</li>
<li>Xue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+serum+biomarkers+for+pancreatic+adenocarcinoma+using+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis.</a> British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10S+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li>
<li>Mertins, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomic+analysis+of+posttranslational+modifications+by+serial+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment.</a> Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).</li>
<li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138(2021).</li>
<li>Romson, J., Emmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+calibration+options+for+accurate+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry.</a> International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619(2021).</li>
<li>Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+bottom-up+proteomics%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+future+of+this+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field.</a> Proteomes. 8 (3), 14(2020).</li>
<li>Ho, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+structural+proteomics%3A+cryoEM+of+protein+complexes+enriched+from+the+cellular+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu.</a> Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).</li>
<li>Eickbush, T., Moudrianakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+core+complex%3A+an+octamer+assembled+by+two+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions.</a> Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).</li>
<li>Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+view+of+the+epigenetic+landscape.+Part+II%3A+Histone+posttranslational+modification%2C+nucleosome+level%2C+and+chromatin+regulation+by+ncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs.</a> Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).</li>
<li>Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+autoantibodies+as+biomarkers+for+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection.</a> The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).</li>
<li>Huang, R. X., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+pathways+and+targets+for+radiotherapy+sensitization+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60(2020).</li>
<li>Dantuma, N. P., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+posttranslational+modifications+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response.</a> The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).</li>
<li>Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestrictive+identification+of+posttranslational+modifications+through+peptide+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).</li>
<li>Dolan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC+column+problems+everywhere+1%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">LC column problems everywhere 1.</a> LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).</li>
<li>Brusniak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+current+bioinformatic+solutions+for+analyzing+LC-MS+data+acquired+by+selected+reaction+monitoring+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology.</a> Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).</li>
<li>Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+computational+resources+for+designing+selected+reaction+monitoring+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions.</a> Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).</li>
<li>Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+software+tools+for+design+and+analysis+of+large+scale+MRM+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets.</a> Methods. 61, 287-298 (2013).</li>
</ol>

멜빈 A. 파크(Melvin A. Park)와 매튜 윌렛츠(Matthew Willetts)는 timsTOF 악기 제조업체인 Bruker Daltonics Inc.의 직원입니다.

히스톤은 4개의 핵심 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2개)으로 구성된 옥타머 형태의 DNA와 상호 작용하여 염색질 구조를 조절하는 염기성 단백질입니다.20. 히스톤에는 수많은 라이신 및 아르기닌 잔기가 포함되어 있으며, 이는 쉽게 변형되어 히스톤 기능에 영향을 미치거나 다른 세포 단백질에 결합하여 염색질 화학을 변화시키는 광범위한 PTM을 유발합니다21. PTM은 여러 질병, 특히 여러 유형의 암에서 보고된 특정 PTM 그룹과 함께 작용하여 생물학적 반응을 유도할 수 있다22.
세포 수준에서 DNA 손상이 인식되면 병변이 표시된 복잡한 신호 전달 캐스케이드의 작용이 즉시 뒤따르며, 세포주기 진행의 조정과 필요한 복구 경로의 활성화가 뒤따릅니다. 또한, DNA 손상은 아세틸 및 메틸 부가물과 같은 다양한 변형을 유도하여 단백질 모집을 촉진한다23. DNA 병변에 관여하는 PTM의 매우 다양한 것은 이러한 분자 메커니즘이 공존을 조절하는 방법과 매우 복잡한 통합 네트워크를 통해 게놈의 무결성을 방어하는 기능적 중요성이 무엇인지에 대한 질문으로 이어집니다. 예를 들어, 히스톤 H3 (H3K9me3)의 라이신 9 트리메틸화는 다양한 질병에서 상이한 병리학과 연관되어 있다24. 이와 같은 이유로, 세포 수준(23)에서 이러한 변형의 완전한 특성화를 가능하게 하는 기기 분석 방법론을 개발할 필요가 있다.
수동 데이터 분석 소프트웨어 및 단백질체 분석 소프트웨어를 사용하여 HeLa S3 히스톤 추출을 분석한 결과 여러 히스톤 단백질에 대한 아세틸화(+42.01Da), 메틸-프로피오닐화(+70.04Da), 디메틸화(+28.03Da) 및 트리메틸화(+42.05)를 포함한 PTM이 밝혀졌습니다. 또한 PASEF 기반 MS/MS 분석법은 동일한 PTM을 운반하는 일부 위치 이성질체 펩타이드를 구별할 수 있었습니다.
서론에서는 PTM 연구에서 LC-TIMS-ToF MS/MS를 결합하는 것의 이점에 대해 간략하게 설명하여 이동성 트랩에서 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용하는 DDA의 최근 개발을 보여줍니다. 주요 아이디어는 다양한 펩타이드에서 오는 신호를 분해할 수 있는 방법론을 확립하는 것이며 지금까지 고전적인 기술로는 해결할 수 없었습니다. 프로피온산 무수물을 사용한 유도체화 공정은 트립신에 의한 라이신 C-말단의 절단을 방지하여 더 길고 더 많은 정보를 제공하는 펩타이드를 생성합니다. 동일한 m/z 및 머무름 시간을 가진 펩타이드는 단편화 패턴으로 식별할 수 있었지만 이러한 종 중 일부는 이 LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS 방법을 사용하여 이동성 영역에서 분리될 수 있음도 확인되었습니다.
이를 더 잘 이해하기 위해 그림 8은 모든 분자의 세 가지 주요 특성을 나타내므로 손상되지 않은 단백질, 지질 또는 펩타이드(이 경우 히스톤 H3 18-26)인지 여부에 관계없이 화합물을 식별할 수 있습니다. 이러한 특성에는 크로마토그래피 컬럼에서 화합물의 머무름 시간(분), 각 화합물의 질량-전하 비율(m/z) 및 이러한 화합물이 드리프트 가스와 상호 작용할 때 나타나는 이동도(1/Ko)가 포함됩니다. 도 8A에서, 변형되지 않은 H3 펩타이드 18-26은 28.15분의 RT를 갖는 것으로 나타났으며, 이의 이동도 스펙트럼에서 적어도 2개의 형태를 가지고 있음을 나타내는 2개의 밴드를 나타내는데, 이는 앞서 기술한 프로토콜에 따라 프로피오닐화된 2개의 라이신(18 및 23)의 결과인 것으로 의심되는 결과이다. 다음 스펙트럼(그림 8B,C)은 동일한 펩타이드(H3 18-26)를 보여주지만 B, K18Ac와 C, K23Ac 사이에서 아세틸화기(42.02)의 위치를 변화시킵니다. 이 두 이성질체(K18Ac 및 K23Ac)는 서로 다른 공간 분포를 나타내기 때문에 TIMS 셀의 가스와 서로 다른 상호 작용을 하기 때문에 모빌로그램을 통해 확인되었습니다. 이 방법의 중요성은 예를 들어 DNA 손상을 통해 다양한 질병과 관련된 다양한 PTM을 더 자세히 식별하고 연구할 수 있는 가능성에 있습니다.
단편화 데이터가 희소할 때, 특정 잔기에서 변형을 식별하는 것은 두 개 이상의 상이한 변형이 동일한 잔기에서 (또는 그 근처에) 동시에 발생할 수 있고 단일 변형(25)으로 이해될 수 있기 때문에 어렵다. 이는 변형되지 않은 펩타이드가 식별되었는지 확인함으로써, 특히 다중 변형이 아닌 단일 변형의 존재를 확인하거나 거부하는 표준물질을 사용함으로써 해결할 수 있습니다(표 1).
과도한 오염이나 불순한 히스톤 추출을 방지하려면 사용하기 전에 시약의 품질을 확인하는 것이 중요합니다. 예를 들어, NIB 완충 용액을 대량으로 보관하고 사용하는 경우 용액이 탁하거나 비정상적으로 나타나지 않고 투명한지 확인하십시오. 탁도는 박테리아 성장의 결과일 수 있으며, 이는 샘플을 오염시키고 히스톤과 박테리아 단백질의 혼합물을 초래할 수 있습니다. 또한 단백질 농도를 측정하는 데 사용되는 BCA 또는 Bradford 분석과 같은 분석을 위한 새로운 보정 곡선을 준비하여 보정 곡선에 사용되는 단백질이 만료되거나 분해되지 않도록 하는 것이 좋습니다.
이 방법은 다른 유형의 세포 또는 유기체, 예를 들어 모기로 확장 될 수 있습니다. 전체 또는 부분 유기체의 경우, 최종 히스톤 농도가 분석에 적합한지 확인하기 위해 적절한 수의 유기체를 선택하는 것이 특히 중요합니다.
또한 질량분석기 유지보수에 대한 일반적인 지침으로, 기기에 축적되고 실행 사이에 오염되는 것을 방지하기 위해 프런트 엔드를 주기적으로 청소해야 합니다. 이 청소에는 필요에 따라 커튼, 오리피스 플레이트 및 사중극자가 포함되어야 합니다.
일반적으로 LC를 사용할 때는 MS 등급 용매를 사용하여 매주 새로운 이동상을 준비하는 것을 고려해야 합니다. 이동상 준비를 위한 전용 피펫과 유리 용기를 보관하고 새로운 용액이 시스템에 배치될 때마다 LC 라인을 퍼지하는 것이 좋습니다. 가드 및 분리 컬럼은 일반적으로 각각 100-200회 주입 및 500-1500회 주입마다 교체해야 합니다26. 샘플 배치를 실행하기 전과 후에 블랭크를 주입해야 합니다. 지정된 배치 내에 많은 수의 샘플이 있는 경우 배치 내에서 다양한 간격으로 공백을 실행하는 것도 고려할 수 있습니다.
이 프로토콜은 히스톤 PTM을 검출하고 이온 이동성을 기반으로 등압 및 이성질체 종을 분화하기 위한 PASEF 기반 DDA 워크플로우를 제공합니다.
이 프로토콜에는 광범위한 시료 전처리가 필요하며 전체 실험 시료 전처리 시간을 고려해야 합니다. 평균적으로 시료 전처리 프로토콜을 완료하는 데 영업일 기준 2-3일이 소요됩니다. 또한 실험실과 기기 버전 간의 차이는 분석의 전반적인 민감도에 영향을 미칠 수 있습니다.
극소수의 단백질체 데이터 분석 소프트웨어는 수동 조정 또는 수정 없이 상향식 방법을 통해 히스톤을 분석하는 데 사용하기에 적합한 것으로 간주되었다 27,28,29. (적어도 처음에는) 수동 분석을 사용하여 결과를 확인해야 하며, 이 또한 시간이 많이 걸립니다. 분석 소프트웨어를 사용하는 경우 일반적으로 쉽게 확인하거나 거부할 수 있는 MS/MS 주석 기능이 있어야 합니다.
또한 TIMS 셀을 삽입하고 이동도 값을 사용하지 않는 한 질량 분석법을 통해 이성질체를 분리하는 것이 불가능하다는 점도 언급할 가치가 있습니다. 예를 들어, 히스톤 변형의 위치는 단편화 패턴 (PASEF)을 사용하여 결정할 수 있습니다.

진핵 세포에서 DNA는 뉴클레오솜(nucleosome)이라고 하는 기능적 단위로 염색질로 포장됩니다. 이 단위는 4 개의 코어 히스톤 (H2A, H2B, H3 및 H4 각각 2 개) 1,2,3,4의 옥타머로 구성됩니다. 히스톤은 진핵생물에서 가장 풍부하고 고도로 보존된 단백질 중 하나로, 유전자 조절에 크게 관여한다5. 히스톤 번역후 변형(PTM)은 염색질 역학의 조절에 큰 역할을 하며 DNA 전사, 복제 및 복구와 같은 다양한 생물학적 과정을 조작한다6. PTM은 주로 DNA 3,7과 접촉하는 히스톤의 N- 말단 영역의 접근 가능한 표면에서 발생합니다. 그러나 꼬리와 코어 변형은 염색질 구조에 영향을 미쳐 뉴클레오솜 간 상호 작용을 변경하고 특정 단백질을 모집합니다 3,8.
액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 기반 단백질체학의 현재 과제는 관심 분석물질의 잠재적인 동시 용리입니다. 데이터 의존적 분석(DDA)의 경우, 이는 MS/MS 수집 공정 중 여러 전구체 이온의 잠재적 손실로 해석됩니다9. ToF(Time-of-Flight) 기기는 매우 높은 주파수 9,10(최대 수십 kHz)11에서 스펙트럼을 획득합니다. 따라서 복잡한 시료(MS1) 내의 전체 전구체 이온을 빠르게 스캔할 수 있으므로 최적의 감도와 MS/MS 염기서열분석 속도(최대 100Hz)9를 약속하고 생물학적 시료 분석에 이상적입니다10. 그럼에도 불구하고 이러한 높은 스캔 속도에서 사용할 수 있는 감도는 MS/MS 속도9에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 완화하기 위해 직교 사중극자 비행 시간(qToF) 질량 분석기와 함께 TIMS(Trapped Ion Mobility Spectrometry)를 추가했습니다. TIMS에서 모든 전구체 이온은 사중극자9로 단일 전구체 질량을 선택하는 대신 이동성의 함수로 나란히 축적되고 용리됩니다. PASEF(Parallel Accumulation-Serial Fragmentation)는 감도 손실 없이 초당 수백 개의 MS/MS 이벤트를 허용합니다9.
이 연구의 주요 목표는 이동성 트랩의 병렬 축적에 이어 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리(CID)를 사용하여 DDA의 최근 발전을 보여주는 것이었습니다. Histone PTM은 머무름 시간(RT), 이동성 및 단편화 패턴을 기반으로 자신 있게 할당되었습니다.

<table><tbody><tr><td>-80 > C Freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Animal Origin-Free</td></tr><tr><td>1 mL 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>94060710 Finntip Flex 1000 &mu; L, 비멸균, 비여과, 랙 팁</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>최대 1.5 mL 10 &micro의 시료를 간단하고 안전하게 처리하기 위해 이 튜브를 사용하십시오</td></tr><tr><td>. L 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94060100</td><td>Finntip Flex, 10 &mu; L, 비멸균, 비여과, 랙 10</td></tr><tr><td>% NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28324</td><td>NP-40 Surfact-Amps 세제 용액</td></tr><tr><td>10x Dulbecco' s PBS without Ca2+/Mg2+</td><td>(Mediatech)</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>Falcon 원추형 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>200 &micro; L 젤 로딩 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-138</td><td>Fisherbrand&nbsp; 젤 로딩 팁, 1&ndash; 200 &뮤; L</td></tr><tr><td>200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>94060310</td><td>Finntip Flex 200&mu; L, 비멸균, 비여과, 랙 팁</td></tr><tr><td>2x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td> SDS-PAGE <td></td></tr><tr><td>50 mL 원추형 튜브</td>용 사전 혼합 단백질 샘플 버퍼 <td>Corning</td><td>352070</td><td>Falcon 원추형 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>96-웰 플랫 바닥 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트, V-Bottom 600 &mu; L</td><td>Axygen</td><td>P-DW-500-C-S</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>179124</td><td>ACS 시약, &ge; 99.5%</td></tr>아<tr><td>세토니트릴(ACN)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>HPLC,</td></tr><tr><td>0.1% 포름산(v/v)이 함유된 Fisher Chemical 아세토니트릴, LC/MS 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LS120</td><td>Optima LC/MS 등급, Thermo Scientific</td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>328110500</td><td>AEBSF 염산염, 98%</td></tr>중<tr><td>탄산암모늄, NH4HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td>BioUltra, &ge; 99.5% (T)</td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액, NH4OH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1303</td><td>ACS 사양 충족, USP/NF 논문 테스트를 위한 시약 사양 충족 GR ACS</td></tr><tr><td>Argon (Ar)</td><td>Airgas</td><td>AR HP 300</td><td></td></tr><tr><td>BEH C18 HPLC 컬럼</td><td>Waters</td><td>186003625</td><td>XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 & Aring;, 5 &마이크로; m, 4.6 mm X 250 mm, 1K&ndash; 15K</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>열 충격 분율, pH 7, &ge; 98%</td></tr><tr><td>염화칼슘, CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>무수, 분말, &ge; 97%</td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic scoring wafer</td><td>Restek</td><td>20116</td><td></td></tr><tr><td>Compass DataAnalysis 6.0</td><td>Bruker Datonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compass HyStar 6.2</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compass IsotopePattern</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compass timsControl 4.1</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89237526</td><td></td></tr><tr><td>일회용 세포 리프터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 08100240</td><td>Fisherbrand 세포 리프터; 일회용 리프터는 세포층을 빠르게 제거합니다</td></tr>. 일회용 <tr><td>펠릿 페슬</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-141-363</td><td>Fisherbrand&nbsp; 펠렛 유봉; 마이크로 원심분리기 튜브에서 단백질 및 DNA 펠릿을 재현탁하거나 연조직을 분쇄</td></tr>합니다 <tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td>1 M</td></tr><tr><td>Formic acid (FA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695076</td><td>ACS 시약, &ge; 96%</td></tr> <tr><td>용융 실리카 모세관 75 &mu; m ID x 363 &mu; m OD(</td><td>Molex (Polymicro)</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38S</td><td>아세트산, 빙하 (인증 ACS), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR747725-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토그래프</td><td>&nbsp; Shimadzu</td><td></td><td>Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC 시스템</td></tr><tr><td>염산, HCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>258148</td><td>ACS 시약, 37%</td></tr><tr><td>Hypercarb 30-40 &mu; m 탄소 150&ndash; 300 &어링;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60106-402</td><td></td></tr><tr><td>Hypersep 카트리지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60109-404</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS 보정 표준, ESI-ToF</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td>TuningMix</td></tr><tr><td>염화마그네슘, MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>무수, &ge; 98%</td></tr><tr><td>메탄올, HPLC용</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A454</td><td>Optima, HPLC용, Fisher Chemical&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>마이크로센트리퓨지 튜브 어댑터</td><td>GL Sciences</td><td>501021514</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-200-8727</td><td>Enzo Life Sciences&nbsp; Microcystin-LA</td></tr><tr><td>MS 시료 바이알, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm</td><td>LEAP PAL 부품</td><td>LAP.11190933</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>모델: ND3300</td><td></td></tr><tr><td>질소(N2)</td><td>Airgas</td><td>NI UHP300</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio X+</td><td>Bioinformatic Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 지시 스트립, Instachek</td><td>Micro Essential Lab</td><td>JR-113</td><td>모델: Hydrion</td></tr><tr><td>Potassium chloride, KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACS 시약, 99.0%&ndash; 100.5%</td></tr> <tr><td>압력 주입 셀</td><td>다음 발전</td><td>&nbsp; 모델: PC77</td><td></td></tr><tr><td>Propionic Anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.00608</td><td>합성용</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기 (700&ndash; 18,000 x g)</td><td>NuAire, 모델: Nuwind</td><td>NU-C200V</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &mu; m, 3 g</td><td>ESI Source Solutions</td><td>r13.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>4569035</td><td>Any kD 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔, 8.6 cm &times; 6.7 cm (W &times; L), Mini-PROTEAN 전기영동 셀</td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11079.06</td><td>98+%</td></tr><tr><td>염화나트륨, NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACS 시약, &ge; 99.0%</td></tr><tr><td>SPE 디스크, C18</td><td>VWR</td><td>76333-134</td><td>Empore SPE 디스크, C18, CDS 분석, 90 mm x 0.5 mm, 12 &micro; </td></tr><tr><td>m SpeedVac+ 진공 펌프 및 플레이트 로터</td><td>Savant</td><td>모델: SC210A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Millipore</td><td>1.07651</td><td>미생물학에 적합</td></tr><tr><td>황산, H2SO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>339741</td><td>99.999%</td></tr><tr><td>TIMS-ToF 질량 분석기</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>모델 Tims tof</td></tr><tr><td>ms 트리클로로아세트산 용액, TCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>6.1&nbsp; N</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td>HPLC에 적합합니다. 99.0%</td></tr><tr><td>Triversa Nanomate</td><td>Advion</td><td>모델: TR263</td><td></td></tr><tr><td>TrypsinProtease, MS 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>튜브 회전기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880017</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 포름산(v/v), LC/MS 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LS118</td><td>Optima LC/MS 등급, Thermo Scientific&nbsp;</td></tr></tbody></table>

액체 크로마토그래피, trapped ion mobility spectrometry 및 time-of-flight mass spectrometry를 사용한 histone modification screening

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

히스톤 단백질은 진핵생물 사이에서 매우 풍부하고 보존되어 있으며 번역 후 변형(PTM)으로 알려진 구조의 결과로 유전자 조절에 큰 역할을 합니다. 외부 또는 유전적 요인과 관련하여 각 PTM의 위치 및 특성 또는 PTM 패턴을 식별하면 이 정보를 DNA 전사, 복제 또는 복구와 같은 생물학적 반응과 통계적으로 연관시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 생물학적 샘플에서 히스톤 PTM을 검출하기 위한 고처리량 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 상보적 액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동성 분광법 및 ToF(Time-of-Flight) 질량분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 사용하면 단일 분석에서 생물학적으로 가장 관련성이 높은 변형을 분리하고 PTM을 할당할 수 있습니다. 설명된 접근 방식은 이동성 트랩에서 병렬 축적을 사용한 후 순차적 단편화 및 충돌 유도 해리를 사용하는 종속 데이터 수집(DDA)의 최근 개발을 활용합니다. Histone PTM은 머무름 시간, 이동성 및 단편화 패턴에 따라 자신 있게 할당됩니다.

상향식 단백질체학 워크플로우(그림 7)에는 일반적으로 미처리 샘플에서 표적 단백질을 추출한 다음 단백질의 농도를 정량화한 다음 일반적으로 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피를 통한 분획이 포함됩니다. 분획 후, 단백질은 단백질 분해 효소(종종 트립신)를 사용하여 절단되고, 마지막으로 생성된 펩티드의 질량 분석 및 확립된 데이터베이스18을 사용하여 단백질 식별이 이루어집니다. 염기서열 정보는 표시된 질량 대 전하(m/z) 범위 내의 전구체 이온에서 파생되며, 이는 충돌 유도 해리(CID)를 거쳐 데이터베이스19 를 사용하여 식별 및 염기서열 분석될 단편화 패턴을 생성합니다(그림 8).
이 연구의 주요 목표는 프로토콜 섹션에서 앞서 설명한 단계에 따라 LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA 방법을 개발하고 적용하는 것이었습니다. 이성질체 및 동중압 펩타이드에 대한 번역 후 변형의 위치를 결정하는 것은 식별 및 스펙트럼 해석과 관련하여 특별한 과제를 제시했습니다. 이 연구에서는 재조합 인간 히스톤 표준물질과 HeLa S3 세포를 샘플로 사용했습니다.
ESI-TIMS-PASEF-ToF MS / MS를 통한 인간 히스톤 표준물질의 히스톤 PTM 분석은 펩타이드 당 5 개의 전하로 검출 된 중대형 펩타이드 (길이 3-30 아미노산)를 산출했습니다. 프로피오닐화 절차는 트립틱 분해에 의해 일반적으로 생산되는 펩타이드보다 더 길고 더 많은 정보를 제공하는 펩타이드를 생산하는 데 성공했습니다. 데이터 분석 결과, 펩타이드는 다양하게 변형된 상태로 확인되었습니다. 장점으로, TIMS 기반 분석법은 동일한 PTM을 운반하는 일부 위치 이성질체 펩타이드를 차별화했습니다. 예를 들어, 두 개의 이성질체 종은 머무름 시간 및 m/z에서 중첩될 수 있습니다. 그러나 두 신호는 이동성 도메인에서 분리될 수 있습니다(그림 9).
그림 9에 표시된 펩타이드에 대한 해당 단편화 스펙트럼은 적절한 FASTA 파일을 사용하여 단백질체 분석 소프트웨어에 의해 주석을 달았습니다. 그림 9A에서 변형되지 않은 펩타이드는 3개의 프로피오닐(+56.03) 그룹(N-말단, 라이신 18 및 라이신 23)과 함께 표시됩니다. 그림 9B에서 펩타이드는 라이신 18의 아세틸기(+42.02)와 두 개의 프로피오닐기(N-말단에 하나, 라이신 23에 하나)로 관찰됩니다. 마지막으로, 도 9C에서 펩타이드는 라이신 23 및 2개의 프로피오닐기(N-말단 및 라이신 18)에서 관찰된 아세틸화와 함께 관찰된다. 이전에 발표된 바와 같이, PASEF의 장점은 동일한 특징을 반복적으로 표적화함으로써 염기서열분석 속도와 감도를 증가시키는 데 사용될 수 있다9. 이를 통해 사용자는 생물학적 샘플에서 더 많은 구조 정보를 얻을 수 있습니다. 이 경우 이것은 각 히스톤에서 발생하는 PTM의 유형 및 위치에 적용됩니다.
번역 후 변형 분석은 그림 10에서 볼 수 있듯이 시퀀스 커버리지 플롯으로 시각적으로 표현할 수도 있습니다. 그림 10A에서, 소화 전에 프로피오닐화 된 히스톤 H3 표준물질은 청색 선으로 표시된 결과보다 더 긴 펩타이드를 나타냅니다. HeLa S3 세포에서 추출한 히스톤은 그림 10B와 동일한 방식으로 처리되었습니다. 동일한 아미노산 위치에서 많은 다른 패턴을 포함하여 여러 PTM이 표시되었습니다. 이것은 생물학적 샘플에서 예상할 수 있습니다. 참고로, 그림 10B 의 몇 가지 회색 선은 낮은 강도로 인한 MS2 의 부족으로 인해 모호하게 식별된 펩타이드를 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig01.jpg"> 그림 1: 스테이지 팁의 개략도 표현 및 생산. (A-G) C18-실리카 디스크 스테이지 팁 제조에 대한 단계별 가이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig02.jpg"> 그림 2: 데이터 처리: 프로피오닐화된 표준 히스톤Mix_QC 펩타이드 20210804. 데이터 처리를 시작하기 전에 가능한 전하 상태 및 단편화(1550.9013, 775.9543, 517.6386 등)의 이론적 목록을 준비하여 기본 피크 크로마토그램(BPC +All MS)에서 해당 값을 추출해야 합니다. 각 펩타이드를 추출한 후 그림에 표시된 분석 목록과 같은지 확인합니다. 피크 775.9543을 예로 선택했습니다. 그림의 오른쪽에는 세 개의 그래프가 표시되어 있는데, 첫 번째 그래프는 크로마토그램(강도 대 시간 그래프)에 해당하고, 두 번째 그래프는 모빌로그램에 해당하며, 세 번째 그래프는 PASEF 단편화가 포함된 질량 스펙트럼에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig03.jpg"> 그림 3: timsControl 프로토콜 단계 1-4. 다음 그림에서는 timsControl 프로시저의 처음 네 단계를 보여 줍니다. 왼쪽 상단에서 계측기 버튼을 클릭하여 계측기와 소프트웨어 간의 연결을 켜고 끕니다. 작업을 실행하기 전에 소프트웨어가 작동 모드에 있는지 확인해야 합니다. 마지막으로 TIMS 매개변수가 올바른지 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig04.jpg"> 그림 4: 소스 매개변수. 이 경우 Syringe Hamilton 500μL는 TuneMix에만 사용되었습니다. 다른 매개 변수가 올바른지 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig05.jpg"> 그림 5: 질량 대 전하(m/z) 보정. 왼쪽 하단 패널 보정 모드에서 100%의 점수를 얻을 때까지 보정을 선택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig06.jpg"> 그림 6: 이동성 보정. 왼쪽 하단 패널 보정 모드에서 최소 98.5%의 점수를 얻을 때까지 보정을 선택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig07.jpg"> 그림 7: 일반적인 상향식 단백질체학 워크플로우. 시료 전처리부터 식별까지 상향식 절차의 단계별9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig08.jpg"> 그림 8: 머무름 시간, 동위원소 패턴 및 H3 18-26 이동성 프로파일. (A) 변형되지 않은 프로피오닐화, (B) 다른 두 위치에서 프로피오닐화된 K23Ac 펩타이드, 및 다른 두 위치에서 프로피오닐화된 K18Ac. 패널 B와 C에 표시된 구조적 이성질체의 경우 이동성 분리의 장점에 주목하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig09.jpg"> 그림 9: PASEF를 사용한 MS/MS 단편화 펩타이드 염기서열분석의 예. 단편 스펙트럼은 아미노산 위치가 18-26인 H3 펩타이드에 대한 단백질체 분석 소프트웨어로부터 수득하였다. (A) 변형되지 않은 프로피오닐화, (B) 다른 두 위치에서 프로피오닐화된 K23Ac 펩티드, 및 다른 두 위치에서 (C) K18Ac 프로피오닐화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65589/65589fig10.jpg"> 그림 10 : 시각적 히스톤 PTM 분석 요약의 예. HeLa S3 세포의 (A) H3 표준물질 및 (B) H3에서 관찰된 펩타이드 및 PTM의 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/65589fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 표준 및 HeLa S3 펩타이드 LC-TIMS-ToF MS/MS 특성. 실험 특성(예: 머무름 시간, m/z, 1/Ko 및 LC 피크 영역)을 포함한 표적 및 관찰된 펩타이드 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65589/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

95 % 효율의 히스톤 추출 프로토콜을 사용하여 방법을 제안합니다. LC-TIMS-ToF MS/MS와 함께 짧은 시간에 히스톤에 존재하는 PTM에 대한 스크리닝을 얻을 수 있습니다. 그리고 무엇보다도, 이성질체를 분리할 수 있는 가능성.이성질체 펩타이드의 분리는 탠덤 질량분석법만으로는 가능하지만 종종 어렵습니다. TIMS를 통합함으로써 추가적인 차원의 분리를 도입하여 많은 위치 이성질체 식별을 단순화합니다. 또한 패시브 기술은 이러한 실험의 민감도를 높여 후성유전학적 변이를 분석하는 능력을 더욱 향상시킵니다.PTM 위치를 식별하는 능력이 향상됨에 따라 다양한 환경 또는 생물학적 요인 간의 상관 관계와 후성유전체에 미치는 영향을 추가로 결정할 수 있습니다. 히스톤 분석을 개선하고 촉진하는 방법은 의료 및 환경 화학을 포함한 여러 연구 분야에 적용될 수 있습니다. 네이티브 또는 손상된 상태에서의 단백질 확인의 역학은 HDX를 사용한 TIMS MS/MS의 구현을 통해 확립됩니다.LC-TIMS-ToF MS/MS 및 Nano LC-TIMS-ToF MS/MS를 통해 다양한 생체 시료에 존재하는 PTM의 차이를 차트로 작성합니다.

histone-modification-screening-using-liquid-chromatography-trapped

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

이 프로토콜은 최근 발표된 EU Commission Regulation 2023/915에 따라 식품 내 맥각 알칼로이드의 존재를 결정하기 위해 검증된 액체 크로마토그래피-이온 이동성-고분해능 질량 분석 방법을 제공합니다.

액체 크로마토그래피-트랩 이온 이동성 분광법-비행 시간 질량 분석법을 통한 식품 매트릭스에서 조절되는 맥각 알칼로이드 검출

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

학습하세요 LC-TIMS-ToF MS/MS를 이용한 히스톤 변형 분석 방법으로, 95% 효율의 추출 프로토콜과 TIMS 기술을 통해 이성질체 분리 및 후성유전학적 변이를 정밀하게 식별하는 기술을 익히세요.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

더 많은 동영상 탐색