액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening
2024년 1월 12일
액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.
95 % 효율의 히스톤 추출 프로토콜을 사용하여 방법을 제안합니다. LC-TIMS-ToF MS/MS와 함께 짧은 시간에 히스톤에 존재하는 PTM에 대한 스크리닝을 얻을 수 있습니다. 그리고 무엇보다도, 이성질체를 분리할 수 있는 가능성.
이성질체 펩타이드의 분리는 탠덤 질량분석법만으로는 가능하지만 종종 어렵습니다. TIMS를 통합함으로써 추가적인 차원의 분리를 도입하여 많은 위치 이성질체 식별을 단순화합니다. 또한 패시브 기술은 이러한 실험의 민감도를 높여 후성유전학적 변이를 분석하는 능력을 더욱 향상시킵니다.
PTM 위치를 식별하는 능력이 향상됨에 따라 다양한 환경 또는 생물학적 요인 간의 상관 관계와 후성유전체에 미치는 영향을 추가로 결정할 수 있습니다. 히스톤 분석을 개선하고 촉진하는 방법은 의료 및 환경 화학을 포함한 여러 연구 분야에 적용될 수 있습니다. 네이티브 또는 손상된 상태에서의 단백질 확인의 역학은 HDX를 사용한 TIMS MS/MS의 구현을 통해 확립됩니다.
LC-TIMS-ToF MS/MS 및 Nano LC-TIMS-ToF MS/MS를 통해 다양한 생체 시료에 존재하는 PTM의 차이를 차트로 작성합니다.
개요
본 연구는 히스톤 수식의 고신뢰도 분석을 위해 액체 크로마토그래피, 트랩 이온 이동도 분광법 및 비행 시간형 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 활용한 분석 워크플로우를 제시합니다. 이 방법은 번역 후 수식(PTMs) 및 그 위치 이성질체의 식별 능력을 유의미하게 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 후성유전학
배경
- 히스톤은 다양한 수식화를 통해 유전자 조절에서 중요한 역할을 합니다.
- 이러한 수식화를 식별하는 것은 후성유전학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
- 전통적인 방법들은 이성질체를 분리하는 데 어려움이 있습니다.
- TIMS를 도입하면 개선된 분리를 위한 새로운 차원을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 효율적인 히스톤 추출 및 분석 방법을 개발하기 위함입니다.
- PTM 및 그 이성질체의 식별 능력을 향상시키기 위함입니다.
- 환경 요인과 후성유전학적 변이 사이의 상관관계를 분석하기 위함입니다.
사용된 방법
- 95%의 효율을 달성하는 히스톤 추출 프로토콜.
- 고해상도 분석을 위한 LC-TIMS-ToF MS/MS.
- 실험의 민감도를 높이기 위한 패시브 기술.
- 히스톤에 존재하는 PTM 스크리닝.
주요 결과
- TIMS를 이용한 이성질체 펩타이드의 성공적인 분리.
- PTM 위치 식별의 개선.
- 후성유전학적 변이 분석 능력 강화.
- 생물학적 요인과 후성유전체 간의 잠재적 상관관계.
결론
- 제시된 방법은 히스톤 변형 분석을 상당히 개선합니다.
- TIMS를 도입하면 이성질체 식별이 간소화됩니다.
- 이 접근 방식은 후성유전학적 영향에 대한 추가 연구의 길을 열어줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
LC-TIMS-ToF MS/MS를 이용한 히스톤 번역 후 변형(PTM)의 고처리량 스크리닝은 초기 발견 및 타겟 검증 단계에서 정밀한 후성유전학적 매핑에 대한 필수적인 요구를 충족합니다. PTM 위치를 정확하게 지정하고 이성질체 형태를 구별하는 능력은 후성유전학적 상태와 생물학적 반응 간의 연결에 대한 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이 워크플로우는 질병 메커니즘과 관련된 염색질 변형의 강력한 정량적 분석을 가능하게 함으로써 리스크가 조정된 포트폴리오 의사결정을 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 고신뢰도 PTM 매핑을 통해 후성유전학적 조절 기전의 분석을 가능하게 합니다.
- 히스톤 수정의 위치 이성질체를 구분하여 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- PTM 패턴을 환경적 또는 유전적 요인과 상관 분석함으로써 생물학적 리스크 감소를 촉진합니다.
- 발견 파이프라인 내 후성유전학적 타겟의 추진을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 크로마틴 수정 화합물의 하위 스크리닝을 위해 검증된 생물학적 샘플을 준비합니다.
- 분석 표준화 및 벤치마킹을 위해 재현 가능하고 정량적인 PTM 프로필을 제공합니다.
- 스크리닝 캠페인에 적합한 확장 가능하고 고처리량인 분석을 가능하게 합니다.
- 히스톤 수정 랜드스케이프에 미치는 화합물 효과의 신뢰성 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 샘플 컨텍스트가 뒷받침되는 경우, PTM 검출을 질병 관련 후성유전학적 바이오마커와 정렬합니다.
- 발견 단계의 후성유전학적 매핑부터 전임상 모델 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 생물학적 섭동에 반응하는 PTM 변화를 정량화함으로써 리스크가 조정된 진전을 가능하게 합니다.
- 상세한 변형 프로파일링을 통해 중개 연구에서의 기전적 리스크 제거를 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 LC-TIMS-ToF MS/MS 프로토콜은 초기 발견부터 리드 물질 확인까지의 과정을 통합하여, 후성유전학 연구에서 가설 기반 및 스크리닝 기반 워크플로를 모두 지원합니다.
- 발견 생물학: PTM 패턴을 생물학적 결과와 매핑하여 가설 검증 및 경로 규명을 촉진합니다.
- 스크리닝: 화합물 평가 및 재현성 평가를 위해 분석 가능한 정량적 PTM 데이터를 제공합니다.
- 분석학: 비교 분석을 위해 PTM 위치, 이성질체 분리 및 단편화 스펙트럼의 고해상도 측정을 제공합니다.
- 중개 연구: 관련이 있는 경우, PTM 프로필을 질환 모델 및 바이오마커 전략과 일치시킬 수 있게 합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 프로그램에 걸친 지속적인 후성유전학 연구를 위해 재사용 가능한 분석 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 후성유전학적 표적 검증 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 높은 재현성과 처리량으로 PTM 분석을 표준화합니다.
- 전략적 가치: 정보에 기반한 추진 여부(go/no-go) 결정과 자본 효율적인 포트폴리오 관리를 지원합니다.
- 포트폴리오 영향: 후성유전학적 표적 및 프로그램의 위험 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
구현 시 고려 사항
- 질량 분석법, 크로마토그래피 및 프로테오믹스 데이터 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 첨단 LC-TIMS-ToF MS/MS 장비 및 지원 소프트웨어에 대한 접근이 필요합니다.
- 시료 준비 및 데이터 해석 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 서로 다른 생물학적 매질이나 히스톤 소스에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 재현성과 민감도를 위해 기기 교정 및 방법 최적화가 매우 중요합니다.
