Name: 가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 가스 크로마토그래피-질량분석법을 활용한 경산호 시료의 표적 대사체학 분석 방법을. 숙주 조직과 Symbiodiniaceae 세포 분획을 분리하여 산호 홀로비온트의 대사 상호작용을 연구하고, 산호 보존 및 복원을 위한 바이오마커 발굴에 활용할 수 있습니다.

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J.L.M.은 UTS Chancellor's Research Fellowship의 지원을 받았습니다.

GC-MS를 사용한 경산호 샘플의 대사산물 프로파일링

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

숙주와 공생체의 분리는 간단한 원심분리를 통해 쉽고 빠르게 달성할 수 있으며, 여기의 결과는 분획을 분리하는 것이 특정 홀로비온트 구성원 기여를 나타내는 귀중한 정보를 제공할 수 있음을 보여주며, 이는 산호 건강의 기능적 분석에 기여할 수 있습니다. 성체 산호에서, 지질 합성은 주로 상주 조류 공생체(40)에 의해 수행되는데, 이 공생체는 지질(예를 들어, 트리아실글리세롤 및 인지질)41 및 스트레스 회복을 촉진할 수 있는 지방산을 공급한다11,42. 이 연구에서 공생체 대 숙주 프로필에서 더 풍부한 13 개의 대사 산물 중 9 개는 생물학적으로 관련된 eicosanoids DHA (C22 : 6 [ω-6]), EPA (C20 : 5 [ω-6]) 및 ARA (C20 : 4 [ω-6])를 포함하여 지방산이었으며...

대사 산물은 세포 과정의 최종 산물을 나타내며, 대사체학(metabolomics)은 특정 유기체 또는 생태계에서 생산되는 대사 산물 모음에 대한 연구로 유기체 기능의 직접적인 측정을 제공할 수 있습니다1. 이는 생태계, 공생적 상호작용 및 복원 도구를 탐색하는 데 특히 중요한데, 대부분의 관리 전략의 목표는 특정 생태계 서비스 기능을 보존(또는 복원)하는 것이기 때문이다2. 산호초는 공생적 상호작용을 규명하고 산호의 생리적 반응을 군집 수준 및 생태계 수준의 영향과 연결하기 위한 대사체학의 잠재적 가치를 보여주는 하나의 수생 생태계이다3. 고처리량 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)의 응용 분야는 높은 선택성과 감도로 광범위한 대사산물 클래스를 동시에 신속하게 분석하고, 스펙트럼 라이브러리를 사용할 수 있을 때 신속한 화합물 식별을 제공하며, 상대적으로 낮은 시료당 비용으로 높은 수준의 재현성과 정확도를 제공할 수 있기 때문에 특히 가치가 있습니다.
산호는 산호 동물, 광합성 와편모충 내공생체(과: Symbiodiniaceae4) 및 복잡한 마이크로바이옴 5,6으로 구성된 홀로비온트입니다. 전반적으로, 홀로비온트의 적합성은 주로 각 구성원의 대사 기능을 지원하기 위해 작은 분자와 요소의 교환을 통해 유지된다 7,8,9,10. 대사체학 접근법은 산호의 공생 특이성(symbiosis specificity)9,11, 열 스트레스에 대한 표백 반응(bleaching response)7,8,12,13, 질병 반응(disease response)14, 오염 노출 반응(pollution exposure response)15, 광순응(photo-aclimation)16 및 화학적 신호전달(chemical signalling)17의 대사 기초를 밝히고 바이오마커 발견(biomarker discovery)18을 돕는 데 특히 강력한 것으로 입증되었다,19. 또한, 대사체학은 DNA 및 RNA 기반 기술에서 추론된 결론에 대한 귀중한 확인을 제공할 수 있습니다 9,20. 따라서 스트레스의 대사 바이오마커 검출18,19 및 영양 보조금 21과 같은 적극적인 관리 전략의 잠재력을 조사하는 것과 같이 산호초의 건강을 평가하고 산호초 보존을 위한 도구를 개발하기 위해 대사체학을 사용할 수 있는 상당한 잠재력이 있다21.
숙주 세포와 공생 세포를 분리하고 홀로비온트로 함께 하지 않고 독립적으로 대사 산물 프로파일을 분석하면 파트너 상호 작용, 독립적인 생리학적 및 대사 상태, 적응을 위한 잠재적 분자 메커니즘에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다 11,12,22,23,24. 산호와 공생충과(Symbiodiniaceae)를 분리하지 않고, 복잡한 게놈 재구성 및대사 모델링을 제외하고는 산호 및/또는 공생충과(Symbiodiniaceae)의 기여와 신진대사를 독립적으로 설명하는 것은 거의 불가능하지만, 이는 산호-와편모충 공생에 아직 적용되지 않았다. 또한, 홀로비온트의 대사 산물 프로필에서 숙주 또는 조류 공생체의 개별 대사에 대한 정보를 추출하려고 시도하면 오해가 발생할 수 있습니다.
예를 들어, 최근까지, 산호 및 홀로비온트 조직으로부터의 추출물에서 C18:3n-6, C18:4n-3 및 C16 고도불포화 지방산의 존재는 조류 공생체로부터 유래된 것으로 생각되었는데, 이는 산호가 오메가-3(ω3) 지방산의 생산에 필수적인 ωx 탈포화효소를 가지고 있지 않다고 가정했기 때문이다. 그러나, 최근의 게놈 증거에 의하면, 다수의 자포동물은 ω3 PUFA de novo를 생산하고 ω3 장쇄 PUFA26을 추가로 생합성할 수 있는 능력을 가지고 있다. GC-MS를 안정 동위원소 표지(예: 13C-중탄산염, NaH 13CO3)와결합하면 제어 조건과 외부 스트레스 요인에 대한 반응으로 산호 홀로비온트 대사 네트워크를 통해 광합성으로 고정된 탄소의 운명을 추적하는 데 사용할 수 있습니다27,28. 그러나, 13 C 운명의 추적에 있는 긴요한 단계는 조류 세포에서 산호 조직의 분리이다 그 때 산호 숙주 분획에 있는 13C 표지된 화합물의 존재는 산호에 전이된 Symbiodiniaceae 파생한 대사 산물 또는 전위된 레테르를 붙인 화합물의 하류 제품으로 명백하게 할당될 수 있다. 이 기술은 글리세롤이 광합성이 공생체에서 숙주로 전위되는 주요 형태라는 오랜 가정에 도전하고(29), 표백27,28 및 양립할 수 없는 Symbiodiniaceae 종11에 대한 반응으로 파트너 간 영양 플럭스가 어떻게 변하는지 설명함으로써 그 힘을 입증했습니다.
조직을 분리하는 결정은 주로 연구 질문에 의해 결정되지만, 이 접근법의 실용성, 신뢰성 및 잠재적인 대사 영향을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서는 홀로비온트에서 대사 산물을 추출하기 위한 상세하고 입증된 방법과 별도의 숙주 및 공생체 분획을 제공합니다. 우리는 숙주와 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 비교하고 이러한 프로필이 홀로비온트 대사 산물 프로필과 어떻게 비교되는지 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>100% LC 등급 메탄올</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>LC 등급 필수</td></tr><tr><td>2 mL 마이크로 원심분리 튜브, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Polypropylene은 화학물질, 기계적 응력 및 극한의 온도에 대한 높은 저항성을 제공합니다.</td></tr><tr><td>2030 Shimadzu 가스 크로마토그래프</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 &micro; m 산 세척 유리 구슬</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>이 크기는 Symbiodiniaceae 세포를 파괴하는 데 최적입니다</td></tr>. <tr><td>AOC-6000 Plus 다기능 자동 샘플러</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>모든 단백질 비색 시약이 허용됩니다</td></tr><tr><td>압축 공기총</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>유사한 디자인이 허용됩니다. 1mL 팁을 맞을 수 있는 피팅을 갖추는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>&nbsp; 0.25mm 내경의 컬럼과 1 &micro를 포함한 DB-5 컬럼; m 필름 두께</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C 및/또는 13C5&ndash; 15N 발린</td><td>, 머크</td><td>605514/ 600148</td><td>메탄올에 내부 표준물질 중 하나 또는 둘 다를 첨가할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>평평한 바닥 96웰 플레이트</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>유리 섬광 바이알</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20mL, 비플라스틱 씰 포함</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>사용할 수 없는 경우 소 혈청 알부민 허용</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu LabSolutions Insight 소프트웨어</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>펠릿 1 M 용액</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R 패키지</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>TQ8050NX 삼중 사중극자 질량 분석기</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pak 샘플 백</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>샘플 수집 백; 크기 : ~ 5cm 산호 조각을 수용 할 수있을만큼 충분히 크지 만 물이 너무 퍼질 정도로 크지 않습니다</td></tr></tbody></table>.

가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 기반 접근법은 자포동물-와편모충 공생의 대사 기초와 산호가 스트레스에 어떻게 반응하는지(즉, 온도로 인한 표백 중)를 설명하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 자포동물 숙주와 관련 미생물(Symbiodiniaceae 및 기타 원생생물, 박테리아, 고세균, 곰팡이 및 바이러스)로 구성된 산호 홀로비온트의 정상 상태 대사 산물 프로파일링은 산호의 전체적인 대사 상태를 특성화하기 위해 주변 및 스트레스 조건에서 성공적으로 적용되었습니다.
그러나 공생 상호 작용을 둘러싼 질문에 답하려면 산호 숙주와 조류 공생체의 대사 산물 프로필을 독립적으로 분석해야 하며, 이는 조직의 물리적 분리 및 분리에 의해서만 달성될 수 있으며 독립적인 추출 및 분석이 뒤따릅니다. 대사체학의 적용은 산호 분야에서 비교적 새로운 것이지만, 연구 그룹의 지속적인 노력으로 산호 숙주 조직과 조류 공생체의 분리를 포함하여 산호의 대사 산물을 분석하는 강력한 방법이 개발되었습니다.
이 백서는 고려해야 할 주요 최적화 단계를 포함하여 GC-MS 분석을 위한 홀로비온트 분리 및 대사 산물 추출에 대한 단계별 가이드를 제공합니다. 우리는 일단 독립적으로 분석되면 두 분획(산호 및 공생충과)의 결합된 대사 산물 프로필이 전체(홀로비온트)의 프로필과 유사하지만 조직을 분리함으로써 전체만으로는 얻을 수 없는 두 파트너의 대사 및 상호 작용에 대한 주요 정보를 얻을 수 있음을 보여줍니다.

이 작업 중에 생성된 모든 데이터는 보충 정보에서 사용할 수 있습니다.
숙주-공생체 분리
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> 그림 1: 산호 숙주 조직과 Symbiodiniaceae 세포의 분리 설정 및 검증. (A) 산호 골격에서 산호 조직을 제거하기 위한 에어건 설정. 피펫 팁은 전기 테이프로 에어건에 부착되고 팁에서 작은(~5mm) 섹션이 절단되어 팁을 빼지 않고 더 많은 공기가 빠져나갈 수 있습니다. (B) 홀로비온트와 분리된 숙주 조직(상등액) 및 공생충과(S...

여기에서는 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석을 위해 산호 홀로비온트에서 극성 및 반극성 대사 산물의 추출 및 준비와 분리된 산호 숙주 조직 및 Symbiodiniaceae 세포 분획을 제시합니다.

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

모든 유기체와 마찬가지로 산호는 면역과 번식을 위해 산호초를 성장시키고 건설하며 변화하는 환경 조건을 견디기 위해 최상의 영양에 의존합니다. 그러나 우리는 정상 또는 변화하는 조건에서 산호를 위한 최적의 영양과 산호 홀로비온트의 각 구성원이 이러한 영양 상태에 어떻게 기여하는지에 대해 거의 알지 못합니다. 산호는 숙주와 다양한 공생 미생물로 구성된 홀로비온트입니다.여기에는 Symbiodiniaceae, 원생 생물, 박테리아, 바이러스 및 곰팡이가 포함됩니다. 홀로비온트의 적합성은 이러한 구성원 간의 대사 상호 작용에 달려 있습니다. 예를 들어, Symbiodiniaceae는 숙주의 신진대사를 지원하고 변화하는 조건에 적응하는 데 도움이 되는 광합성을 제공합니다.이 중요한 파트너십을 이해하려면 각 파트너의 화학적 및 대사 구성을 별도로 연구해야 합니다. 이러한 발견은 대사 분석을 위해 숙주와 공생체 분획을 분리하여 더 많은 정보를 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 홀로비온트와 비교하여 별도의 분획을 분석하는 결정은 궁극적으로 연구 질문에 의해 좌우됩니다.따라서 홀로비온트 분석이 바람직한 경우, 홀로비온트 대사산물 추출을 위한 방법론과 분석 중에 가능한 한 많은 정보를 얻기 위한 제안을 제공했습니다. 이 연구에서 사용된 방법은 연구의 새로운 길을 열어줍니다. 여기에는 잠재적인 바이오마커 공개, 특정 생애 단계 또는 스트레스 조건 동안 주요 대사 산물 식별, 특정 종과의 연관성의 이점 이해, 홀로비온트 내 상호 작용 탐색이 포함됩니다.향후 연구는 산호초 보존 및 복원에 적용되는 바이오마커 검출을 포함하여 여기에서 확립된 프로토콜을 여러 연구 분야에 적용하는 데 중점을 둘 것입니다. 이 방법론은 다른 생리학적 측정을 위해 분획 분리가 불가능한 경우에도 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 산호 군락에서 배출되는 휘발성 대사 산물을 분석할 때.

gas-chromatography-mass-spectrometry-based-targeted-metabolomics-hard

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

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비행 시간 형 질량 분석과 2D 가스 크로마토 그래피를 사용하여 조류의 열수 액화에서 수성 분수의 질적 특성

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석법에 의해 복어 종 유전형하는 개선 된 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 단편 길이 다형성 방법을 설명한다. 역상 실리카 모노리스 컬럼 절단 증폭 산물의 분리에 이용된다. 이 방법은 기본 구성을 식별하는 데 유용 올리고 뉴클레오티드의 모노 이소 ​​토픽 질량을 규명 할 수 있습니다.

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이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.

가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

원고는 고체 위상 미세 추출과 인간의 뇌 종양의 현장 샘플링을 제시하고 바이오 마커의 발견을 향해 자신의 생화학 프로파일링 에 이어.

메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석을 위한 뇌종양의 현장 샘플링 및 추출

보리의 대사체 분석 방법이 제시됩니다. 이 방법은 대사 산물의 분별 및 유도체화와 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)에 의한 분석을 수반합니다. 대사체 분석은 곡물에 대한 간작 및 가뭄 스트레스의 영향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

가스 크로마토그래피/질량 분석법을 통한 보리의 대사체학 분석

배우세요 가스 크로마토그래피-질량분석법을 활용한 경산호 시료의 표적 대사체학 분석 방법을. 숙주 조직과 Symbiodiniaceae 세포 분획을 분리하여 산호 홀로비온트의 대사 상호작용을 연구하고, 산호 보존 및 복원을 위한 바이오마커 발굴에 활용할 수 있습니다.

가스 크로마토그래피 - 경산호 시료의 질량분석법 기반 표적 대사체학

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