Name: Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 학습하세요 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소를 정제하는 간단하고 비용 효율적인 친화성 정제법을. 아르기닌 또는 라이신 기반 칼럼을 사용하여 효소 활성을 효과적으로 분리하고 분석하는 방법을 배울 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 샤먼시 과학기술국(3502Z20227197)과 푸젠성 과학기술국(No. 2019J01070, No.2021Y0027)의 지원을 받았습니다.

1. 준비
<ol><li>시료 처리<ol><li>신선한 S. nudus (100g)를 조심스럽게 해부하고 장과 그 내부 액체를 수집하십시오.</li>
		<li>균질화(1,000rpm, 60초)를 위해 300mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)을 추가합니다.</li>
		<li>균질액을 3x 동결-해동합니다.</li>
		<li>시료를 원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하고 상층액을 수집한다. 추가 사용이 있을 때까지 샘플을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 침전<ol><li>상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합하고 혼합물을 4°C에서 12시간 동안 방치한다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.</li>
		<li>원심분리(10,956 × g, 0.5 h, 4°C)하여 단백질 침전물을 얻는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 4 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단백질 재현탁<ol><li>단백질 침전물을 30mL의 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 7.4)으로 재현탁합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 조단백질 용액을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 친화성 크로마토그래피
<ol><li>용액 여과<ol><li>조단백질 용액을 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과합니다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>컬럼 패킹<ol><li>아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 매트릭스 크로마토그래피 컬럼을 5 mL 빈 크로마토그래피 컬럼에 적정량의 라이신-아가로스 매트릭스 배지와 아르기닌-아가로스 매트릭스 배지를 로딩하여 압축한다. 참고: 컬럼은 2-8°C에서 보관할 수 있으며 매트릭스는 저장 완충액(20% 에탄올)에 담글 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>친화성 정제<ol><li>친화성 크로마토그래피 컬럼을 먼저 ddH2O(1mL/분, 10컬럼 부피)로 평형화한 다음 Tris-HCl 완충액(0.02M, pH 8.0, 1mL/분, 5컬럼 부피)으로 평형을 이룹니다.</li>
		<li>단백질 용액 샘플을 사전 평형화된 컬럼(1mL/분, 1/3컬럼 부피)에 로드합니다. 참고: 샘플 로딩의 부피는 sFE의 농도에 따라 다릅니다.</li>
		<li>컬럼을 Tris-HCl 완충액(0.02 M, pH 8.0, 5컬럼 부피)으로 세척합니다.</li>
		<li>0.15 M, 0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M 및 0.65 M NaCl(1 mL/min, 5 컬럼 부피)로 컬럼을 순차적으로 용리합니다.</li>
		<li>0.15M NaCl 용출에 나타나야 하는 용출 피크를 찾은 다음 5mL 튜브에서 분획을 수집합니다.</li>
		<li>용출 시료를 3 kD 초원심 필터(3,944 × g, 1.5 h, 4°C)를 사용하여 농축한다. 나중에 사용할 수 있도록 이 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 순도 평가
<ol><li>소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 제조<ol><li>5% 농축 겔 및 12% 분리 겔을 사용하여 Laemmli's 방법에 따라 SDS-PAGE 겔을 제조하였다13.</li>
	</ol></li>
	<li>전기영동<ol><li>샘플(15μL)을 5x SDS-PAGE 단백질 로딩 버퍼(1/4 부피)와 혼합하고, 끓는 물에서 5분 동안 가열하고, SDS-PAGE 젤에 로드하고, 80V, 60mA에서 1.5시간 동안 겔을 실행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>전기영동 후 제조사의 프로토콜에 따라 Silver Stain Kit로 겔을 염색하고 화학발광 이미징 시스템을 이용하여 염색된 겔을 관찰합니다.</li>
		<li>다음 공식을 사용하여 표적 단백질의 순도를 분석합니다: 표적 단백질의 순도 = 표적 단백질의 강도 값/총 단백질의 강도 값.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 혈전용해 활성 평가
<ol><li>피브린 플레이트 준비<ol><li>피브리노겐 25mg과 생리식염수 1.25mL를 혼합하여 피브리노겐 용액을 준비합니다.</li>
		<li>트롬빈 100U와 생리식염수 1.05mL를 완전히 혼합하여 트롬빈 용액을 준비한다.</li>
		<li>22.5mL의 Tris-HCl 완충액(0.02mol/L, pH 7.4)에 0.5g의 아가로스를 첨가하여 아가로스 용액을 준비합니다. 완전히 용해될 때까지 100°C에서 아가로스 용액을 혼합하고 가열한다.</li>
		<li>아가로스 용액을 약 50°C로 냉각하고 피브리노겐 용액을 첨가한다. 그런 다음 즉시 트롬빈 용액을 넣고 빠르게 혼합한 다음 60mm 배양 접시에 붓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>로드<ol><li>멸균 천공을 사용하여 준비된 피브린 플레이트에 3mm 웰을 펀칭하고 웰에 10μL 샘플을 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>37°C에서 18시간 배양한 후, 이들의 분해 구역의 크기를 계산하여 혈전용해 활성을 측정한다. 섬유소 용해 활성 = (샘플의 구역 크기/유로키나아제의 구역 크기) x 100U. 구역 크기 = 직경 x 직경. 참고: 생리 식염수 완충액, 조단백질(프로토콜 단계 1.3.1에서 얻은 샘플) 및 유로키나아제를 각각 블랭크, 음성 대조군 및 양성 대조군에 사용했습니다. 유로키나아제와 비교하여 정제된 sFE의 섬유소 용해 활성이 ~19,200U/mL임을 발견했습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

Affinity Chromatography를 통한 Sipunculus nudus 의 Fibrinolytic Enzyme 정제

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

sFE의 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없기 때문에, 현재 사용되는 sFE는 신선한 S. nudus14로부터 추출되었다. 더욱이, 문헌에 보고된 sFE의 정제 절차는 분자량, 등전점, 이온 강도 및 극성과 같은 sFE의 몇 가지 일반적인 특징을 기반으로 하기 때문에 복잡하고 비용이 많이 들었습니다15,16. 현재까지 sFE의 친화성 정제 프로토콜은 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 sFE의 결정구조에 대한 지식을 바탕으로 sFE의 친화성 정제 프로토콜을 성공적으로 개발하였다. 보고된 정제 방법과 비교할 때 이 친화성 정제 방법은 작동하기 쉽고 저렴하며 사용자 친화적이었습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 활성 sFE의 상당히 높은 회수율이 관찰되었습니다.
혈전용해효소의 친화성 정제 방법은 많은 것이 보고되었지만, 항...

혈전증은 특히 Covid-19 세계적 대유행 이후 공중 보건에 대한 주요 위협입니다 1,2. 임상적으로, 조직형 플라스미노겐 활성제(tPA) 및 유로키나제(UK)와 같은 많은 플라스미노겐 활성제(PA)가 혈전용해제로서 널리 사용되어 왔다. PA는 환자의 플라스미노겐을 활성 플라스민으로 활성화하여 피브린을 분해할 수 있습니다. 따라서, 이들의 혈전용해 효율은 환자의 플라스미노겐 상태에 의해 크게 제한된다 3,4. 메탈로프로테이나제 플라스민(metalloproteinase plasmin) 및 세린 플라스민(serine plasmin)과 같은 섬유소용해제는 혈전을 직접 용해시킬 수 있지만 다양한 플라스민 억제제에 의해 빠르게 비활성화되는 플라스민과 같은 섬유소용해효소(FE)를 포함하는 또 다른 유형의 임상 혈전용해제이다5. 그 후, 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킬 뿐만 아니라 고대 땅콩 벌레 Sipunculus nudus(sFE)6의 섬유소 용해 효소인 피브린을 직접 분해하여 혈전을 용해시킬 수 있는 새로운 유형의 섬유소 용해제가 보고되었습니다.6. 이 이중기능은 특히 비정상적인 플라스미노겐 상태 측면에서 전통적인 혈전용해제에 비해 sFE에 다른 이점을 부여합니다. 다른 이관능성 혈전용해제7,8,9와 비교하여, sFE는 약물 개발, 특히 경구 약물에 대한 비식품 유래 제제에 비해 안전성을 포함한 몇 가지 이점을 나타낸다. 이는 Sipunculus nudus의 생체 안전성과 생체 적합성이 잘 확립되어 있기 때문입니다10.
미생물, 지렁이 및 버섯으로부터 분리된 다른 천연 섬유소용해제와 유사하게, S. nudus로부터의 sFE의 정제는 매우 복잡하며, 조직 균질화, 황산암모늄 침전, 담수화, 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 분자체10,11,12와 같은 여러 단계를 포함한다. 이러한 정화 시스템은 숙련 된 기술과 값 비싼 재료에 의존 할뿐만 아니라 전체 절차를 완료하는 데 며칠이 걸립니다. 따라서 sFE의 간단한 정화 프로그램은 sFE의 추가 개발에 매우 중요합니다. 다행히 sFE의 두 결정(PDB: 8HZP; PDB: 8HZO)를 성공적으로 획득했습니다(보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조). 구조 분석 및 분자 도킹 실험을 통해 sFE의 촉매 코어가 아르기닌 또는 라이신 잔기를 포함하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있음을 발견했습니다.
여기서, sFE의 결정구조에 기초한 친화성 정제 시스템이 최초로 제안되었다. 이 프로토콜을 따르면, 단일 친화성 정제 단계에서 미정제 추출물로부터 고순도 및 고활성 sFE를 정제할 수 있습니다. 여기에서 개발된 프로토콜은 sFE의 대규모 제조에 중요할 뿐만 아니라 다른 혈전용해제의 정제에도 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>30% 아크릴아미드-비사아크릴아미드 (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스 G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>과황산암모</td>늄 <td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산암모</td>늄 <td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아르기닌-세파로스 4B</td><td>Solarbio</td><td>아르기닌-아가로스 매트릭스</td><td></td></tr><tr><td>브로목시레놀 블루(BPB)</td><td>솔라바이오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>패스트 실버 스테인 키트</td>, <td>베이요타임</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td>, <td>머크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>, 솔라바이오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>, 시노팜</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>키나아제</td>, <td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>라이신-세파로스 4B</td><td>Solarbio</td><td>라이신-아가로스 매트릭스</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염색 색상 단백질 마커(10-170 kD)</td><td>베이요타임</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설포네이트(SDS)</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화</td><td>나트륨SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸) 아미노메탄</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(하이드록시메틸) 아미노메탄 하이드로클로라이드</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Aprotein 정제 시스템 순수</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 수직 압력 증기 살균기 MLS-3750</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학 발광 이미징 시스템</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정류 펌프 BT-100</td><td>QITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항온 인큐베이터</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 냉장 원심 분리기 3-30KS</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DHG 시리즈 가열 및 건조 오븐 DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 유리 균질화기 DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 분석 저울</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 온도 조절 수조 DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수평 탈색 셰이커</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제빙기 AF 103</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E 초음파 세척기</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 교반기</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 냉장 원심 분리기 H1650-W</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Reference</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정밀 데스크탑 pH 미터</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소형 소용돌이 발진기</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수직 전기 영동 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumable Material&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; L PCR 튜브(200 &마이크로; L)</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(1.5mL)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(5mL)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(50mL)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(7mL)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>배양 접시(60mm)</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 멤브레인(0.22 &마이크로; m)</td><td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>베미스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (1 mL )</td><td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (10 &마이크로; L)</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁(200 &마이크로; L)</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>특수 지시자 종이</td><td>TZAKZY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심 필터 장치(15mL 3 KDa)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초원심 필터 장치(4mL 3 KDa)</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>범용 pH 지시기</td><td>SSS 시약</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Sipunculus nudus(sFE)의 섬유소 용해 효소는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화하고 피브린을 직접 분해할 수 있는 새로운 혈전용해제로 기존 혈전용해제에 비해 큰 이점을 보여줍니다. 그러나 구조 정보가 부족하기 때문에 sFE의 모든 정제 프로그램은 너무 복잡하고 비용이 많이 드는 다단계 크로마토그래피 정제를 기반으로 합니다. 여기서, sFE의 친화성 정제 프로토콜은 sFE의 결정 구조를 기반으로 최초로 개발되었습니다. 여기에는 미정제 시료 및 라이신/아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼의 준비, 친화성 정제 및 정제된 sFE의 특성 분석이 포함됩니다. 이 프로토콜에 따라 sFE 배치를 1일 이내에 정제할 수 있습니다. 또한 정제된 sFE의 순도와 활성은 각각 92% 및 19,200U/mL로 증가합니다. 따라서 이것은 sFE 정제를 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 sFE 및 기타 유사한 제제의 추가 활용에 매우 중요합니다.

이 프로토콜에 따라, 조조직 용해물을 추출하고, 아르기닌-아가로스 매트릭스 및 라이신-아가로스 매트릭스 친화성 크로마토그래피 컬럼을 구축하고, 정제된 sFE를 얻고, 정제된 sFE의 순도 및 섬유소 용해 활성을 각각 SDS-PAGE 및 피브린 플레이트에 의해 측정하였다.
원심분리 후, 수집된 상층액은 투명한 황갈색 점성 액체였다. 침전은 이 상청액을 포화 황산암모늄 용액(9 부피)과 혼합했을 때 시작되었다. 12시간 동안 방치한 후, 튜브의 바닥에 무거운 침전물이 형성되었다. Tris-HCl 완충액으로 재현탁하면 단백질 침전물이 빠르게 사라지고 완충액에 용해되어 투명한 옅은 노란색 액체로 나타납니다.
단백질 용액을 아르기닌-아가로스 매트릭스 친화성 컬럼에 로딩했을 때, ~40분에 명백한 피크(피크 1, 플로우스루 피크)가 나타났고 ~66분에 용리가 멈췄습니다. 그래디언트 용출 단계에서 0.15M NaCl로 용리하면 ~94분에 명백...

여기에서는 간단하고 저렴하며 효율적인 Sipunculus nudus 의 섬유소 용해 효소의 친화성 정제 방법을 제시합니다.

Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

우리의 연구는 주로 섬유소 용해 효소의 정제에 관한 것입니다. 본 연구는 혈전용해효소에 대한 간단한 정제방법을 확립하고자 한다. 이 연구에서는 혈전용해효소의 아르기닌 또는 라이신 최적 친화성 정제 시스템을 처음으로 보고합니다.기존의 정제 방법과 비교할 때, 이것은 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소를 정제하기 위한 간단하고 저렴하며 효율적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜의 개발은 Sipunculus nudus 및 기타 유사한 제제의 섬유소 용해 효소의 추가 활용에 더 큰 의미가 있습니다.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

엄마가 magnetosome 활성화에 참여하는 표시되었습니다 독특한 Magnetosome 관련된 단백질이다. 여기에서 엄마가 삭제 돌연변이의 정화 프로토콜 (MamAΔ41)을...

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

이 프로토콜은 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인 함유 단백질 1(FAHD1)을 추출하는 방법을 기술한다. 열거된 방법들은 관심있는 다른 단백질에 적응될 수 있고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다.

돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

여기에서는 Sipunculus nudus의 섬유소 용해제를 신속하게 분리하고 표시하기 위한 피브리노겐-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 프로토콜을 제시합니다.

Fibrinogen-Polyacrylamide Gel Electrophoresis를 통한 Sipunculus nudus 의 활성 Fibrinogenolytic Agents의 신속한 분리 및 표시

이 기사에서는 C41(DE3) 발현 시스템에서 독성 뉴클레아제인 재조합 Nsp15를 과발현한 다음 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 태그가 지정된 단백질을 정제하는 방법론에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 다른 까다로운 독성 단백질에 적용될 수 있습니다.

대장균에서 독성 뉴클레아제를 과발현 및 정제

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

학습하세요 Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소를 정제하는 간단하고 비용 효율적인 친화성 정제법을. 아르기닌 또는 라이신 기반 칼럼을 사용하여 효소 활성을 효과적으로 분리하고 분석하는 방법을 배울 수 있습니다.

Sipunculus nudus에서 섬유소 용해 효소의 친화성 정제

더 많은 동영상 탐색