Name: Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 학습하세요 단층 그래핀 코팅 그리드 제작 방법을 통해 초저온 전자 현미경에서 배경 소음을 최소화하고 생물학적 샘플의 무결성을 향상시키는 기술을. 이 프로토콜은 연구실에서 하루에 고품질 그래핀을 대량 생산할 수 있게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Scripps Research에서 이러한 방법을 확립하는 동안 유용한 토론을 해주신 Xiao Fan 박사님께 감사드립니다. B.B.는 Hewitt Foundation for Medical Research의 박사 후 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. WC는 국립 과학 재단 박사 전 펠로우십의 지원을 받습니다. D.E.P는 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 NS095892 G.C.L.의 지원을 받습니다. 이 프로젝트는 또한 NIH 보조금 GM142196, GM143805 및 S10OD032467 G.C.L.의 지원을 받았습니다.

TEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

유리질 얼음의 얇은 층에서 생물학적 시료를 보존하는 것은 고분해능 CryoEM 구조 측정에 매우 중요한 단계입니다. 그러나 연구자들은 AWI와의 상호 작용으로 인해 발생하는 문제에 자주 직면하는데, 이는 선호 방향, 복잡한 분해, 변성 및 응집을 유발합니다. 더욱이, 샘플은 창호 필름의 구멍에 매달려 있는 얇은 얼음을 채울 수 있을 만큼 항상 충분히 농축될 수 없습니다. 여러 연구 그룹은 이러한 한계 24,25,26,27,28,29,30 중 일부를 극복하는 데 도움이 되도록 그래핀의 단층으로 EM 그리드를 코팅하는 방법을 개발했으며 그래핀 그리드는 큰 성공을 거두었습니다. 여기에서는 사내에서 그래핀 그리드 배치를 효과적으로 준비하고 TEM으로 그래핀 그리드의 품질을 검사하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 아래에 요약된 몇 가지 중요한 단계에서 특별한 주의를 기울여야 함을 강조합니다.
그래핀은 공기 중 오염 물질을 끌어들이는 경향이 강합니다. 따라서 그래핀 그리드 제조 과정에서 그래핀/Cu 시트 또는 그리드와 접촉하는 모든 도구가 깨끗하고 먼지가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 그래핀을 옮기는 데 사용되는 유리 커버슬립은 에탄올과 탈이온수로 헹구거나 에어 더스터를 사용하여 청소할 수 있습니다. 또한 흄 후드 아래에서 작업하고 그래핀 시트와 그리드를 항상 호일이나 깨끗한 유리판으로 덮은 상태로 유지하는 것이 좋습니다. 그리드의 먼지나 오염 물질은 그래핀이 EM 그리드에 완전히 부착되는 것을 방해할 수 있습니다. 그래핀 또는 그래핀 코팅 그리드를 취급할 때는 정전기 방전으로 인한 그래핀 필름의 손상을 방지하기 위해 전기적으로 접지하는 것이 중요합니다. 정전기 방전은 손목 접지 스트랩을 사용하거나, 그래핀 또는 그래핀 그리드를 취급할 때마다 접지된 금속 물체를 만지거나, 및/또는 핀셋(24)을 잡는 손에 장갑을 착용하지 않음으로써 피할 수 있다.
그래핀의 단층은 매우 얇기 때문에(탄소 원자의 너비) 그래핀을 그리드로 옮기는 동안 MMA 또는 폴리-MMA(PMMA)와 같은 유기층으로 그래핀을 지지하는 것이 중요합니다. PMMA는 그래핀 전달에 가장 널리 사용되는 재료입니다. 그러나 PMMA는 그래핀과 강한 친화력을 가지며 종종 그래핀 필름에 폴리머 오염을 초래할 수 있습니다. MMA는 잔류 오염을 덜 남기기 때문에 이 프로토콜에서 사용된다25. 그러나 PMMA와 MMA는 모두 그래핀 필름의 일부 영역에서 관찰할 수 있는 주름과 균열을 형성하는 단점이 있습니다(그림 3B). 이러한 주름을 피하는 것은 CVD 방법(31)에 의해 그래핀 성장 동안 일반적으로 발생하기 때문에 어려울 수 있다. 주름 없이 울트라 플랫 그래핀을 성장시키기 위한 방법이 최근에 개발되었는데, 이에 의해 동박은 성장 기질(32)로서 Cu(111)/사파이어 웨이퍼로 대체된다.
당사의 경험에 비추어 볼 때, 구리 에칭 후 부서지기 쉽고 후속 단계에서 다루기 어려운 고분자로 덮인 Cu-그래핀 시트를 제조업체에서 구입하는 것보다 그래핀/Cu 시트를 사내에서 구매하여 MMA로 그래핀을 지지하는 것이 좋습니다. MMA 코팅에 사용한 스핀 코터는 앞서 설명한 대로 로컬 컴퓨터/철물점의 부품을 사용하여 저렴하게 제작할 수 있습니다25.
MMA 코팅 단계에서, Cu-graphene 시트의 그래핀 표면 전체를 MMA로 덮는 것이 중요하다. Cu가 에칭된 후 MMA-그래핀은 반투명해지고 MMA 커버리지가 없는 영역은 빈 구멍처럼 보입니다. 구리 쪽의 MMA 코팅을 방지하려면 코팅하는 동안 CVD 필름에서 회전하는 과도한 MMA를 흡수하도록 그 아래에 작은 압지를 놓는 것이 중요합니다.
에칭 및 헹굼 후 MMA/그래핀 시트는 수위를 제어하기 위해 주사기 또는 연동 펌프가 있는 상업용 또는 수제 트로프 시스템을 사용하여 EM 그리드로 옮길 준비가 됩니다. 이송 단계 전에 클로로포름, 아세톤 및 IPA의 연속 수조에서 그리드를 철저히 헹구는 것이 중요합니다. 그래핀 코팅된 그리드를 65°C에서 베이킹하면 그래핀 무결성을 보존하고 그래핀이 그리드에 흡착되는 것을 촉진합니다. 마지막으로, 그리드의 MMA 오염을 방지하려면 아세톤 수조에서 MMA를 완전히 제거하고 IPA에서 그리드를 청소하는 것이 중요합니다. 세척되지 않은 MMA 잔류물은 EM 그리드에서 관찰되어 이미지의 신호 대 잡음비를 감소시킵니다(그림 3C). 아세톤-IPA 세척 공정을 반복하여 그래핀 표면을 추가로 청소할 수 있습니다.
그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하기 위해 그리드를 UV/오존에 노출시켰습니다. UV/오존 클리너의 다양한 모델은 그래핀을 손상시키지 않고 CryoEM 시료 전처리를 위해 그래핀 층에 충분한 산소를 공급하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 시스템에 관계없이 UV/오존 처리 직후 CryoEM 시료 응용 분야에 이러한 그리드를 사용하는 것이 중요합니다. 그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하는 대안적인 방법은 다른 연구들(33,34)에 기술되어 있다.

단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생체 고분자의 3D 구조를 조사하는 데 점점 더 많이 사용되는 기술입니다. 지난 10년 동안 전자 현미경 광학, 직접전자 검출1 및 컴퓨터 알고리즘 2,3,4의 기술 발전으로 CryoEM 사용자는 거의 원자 분해능 5,6,7,8 까지 생화학적으로 안정적인 고분자 복합체의 구조를 결정할 수 있게 되었습니다 . 이러한 발전에도 불구하고 CryoEM 이미징을 위한 시료 보존에는 여전히 중요한 장벽이 남아 있으며, 이로 인해 대부분의 생물학적 시료가 고해상도로 분해되지 않습니다.
고분해능 CryoEM 분석을 위한 시료 전처리에는 유리화된 얼음의 얇은 층 내에 광범위한 방향으로 고르게 분포된 거대분자를 포획하는 작업이 포함됩니다. "블롯 및 플런지" 동결 방법은 CryoEM 연구를 위해 그리드에서 생물학적 샘플의 박막을 생성하는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다 9,10. 이러한 방법은 친수성으로 만들어진 창공 필름이 포함된 EM 그리드에 몇 마이크로리터의 샘플 용액을 적용한 다음 여과지로 샘플의 대부분을 제거한 다음 그리드를 액체 에탄 또는 에탄-프로판 혼합물의 극저온제에 빠르게 담그는 것을 포함합니다9.
이 방법은 광범위한 생물학적 표본의 구조를 측정하는 데 성공적으로 사용되었지만, 일반적으로 사용되는 모든 CryoEM 표본 준비 방법은 표본을 소수성 공기-물 계면(AWI)에 노출시키므로 고해상도 구조 측정을 제한하는 문제가 발생하는 경우가 많습니다. 생물학적 표본은 AWI에 노출될 때 변성되는 경향이 높으며, 이는 복잡한 응집 및 분해로 이어질 수 있음이 확인되었습니다11,12,13,14. 더욱이, 생물학적 표본의 표면 상의 소수성 패치는 입자가 얼음(12)에서 바람직한 방향을 채택하도록 한다. 많은 시나리오에서 샘플의 단일 소수성 영역은 모든 입자가 얼음에서 단일 방향을 채택하도록 강제하므로 신뢰할 수 있는 재구성을 생성하는 능력이 없어집니다. AWI의 문제점에 더하여, 시편은 구멍(15) 내의 얼음 내에 부유하는 입자의 수를 제한하는 필름의 창호층의 표면에 대한 친화력을 나타낼 수 있다.
AWI 또는 필름과의 상호 작용에서 발생하는 이러한 문제를 줄이기 위해 몇 가지 방법론적, 기술적 솔루션이 개발되었습니다16,17. 한 가지 인기 있는 접근 방식은 EM 그리드의 창공 필름을 비정질 탄소의 얇은(수십 나노미터) 층으로 코팅하는 것입니다. 이 코팅은 입자가 흡착될 수 있는 구멍에 연속적인 표면을 제공하여 AWI15,18,19,20과의 상호 작용으로부터 시료를 부분적으로 보호하는 이점이 있습니다. 그러나 추가 탄소 층은 이미징된 영역에서 배경 신호의 양을 증가시켜 특히 작은(<150kDa) 표본의 경우 달성 가능한 분해능을 손상시킬 수 있는 노이즈를 유발합니다. 최근 몇 년 동안 산화그래핀(GO) 플레이크를 사용하여 CryoEM 그리드에서 지지 필름을 생산하는 것이 기존의 비정질 탄소에 비해 장점이 있는 것으로 나타났습니다. GO 플레이크는 흑연 층의 산화를 통해 생성되며, 표면과 가장자리에 카르복실, 수산기 및 에폭시기 형태의 상당한 산소 함량으로 인해 친수성인 단층 흑연의 유사 결정질 시트가 생성됩니다. 수성 현탁액 내의 상용 GO 플레이크는 저렴하며, GO 플레이크를 EM 그리드에 적용하기 위한 수많은 공개된 방법이 있다(18,21). 그러나 이러한 방법은 종종 GO 플레이크로 부분적으로만 덮인 그리드와 여러 층의 GO 플레이크를 포함하는 영역을 생성합니다. 또한 GO 플레이크는 얇은 비정질 탄소22,23에서 관찰된 것과 유사한 CryoEM 이미지에 눈에 띄는 배경 신호를 제공합니다.
탄소 원자의 단일 2D 결정 배열로 구성된 자연 그대로의 단층 그래핀은 전자 현미경에서 위상차를 생성하지 않는다는 점에서 GO와 구별됩니다. 따라서 단층 그래핀은 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 보이지 않는 지지층을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 단층 그래핀은 또한 GO보다 강하고 EM 그리드에 단일 단층으로 적용될 수 있으며, 최근 그래핀 코팅된 EM 그리드 제조의 발전으로 고커버리지 단층 그래핀 그리드를 사내에서 제조할 수 있게 되었습니다 24,25,26,27,28,29,30. 그러나 CryoEM 구조 측정에 그래핀 코팅 그리드를 사용할 때의 이점에도 불구하고 상업적 옵션의 엄청난 비용과 자체 생산의 복잡성으로 인해 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 생물학적 표본의 CryoEM 구조 측정을 위해 그래핀 단층으로 덮인 EM 그리드를 효과적으로 생성하기 위한 단계별 가이드를 설명합니다(그림 1). 이 상세한 프로토콜을 따름으로써 CryoEM 연구원은 하루에 수십 개의 고품질 그래핀 지지 그리드를 재현성 있게 준비할 수 있습니다. 그래핀 코팅 그리드의 품질은 LaB6 필라멘트가 장착된 저가형 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 쉽게 검사할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄 (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>위험한; 극도의 주의를 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>클로로포름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>클램핑 TEM 그리드 홀더 블록 45 그리드용</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 팬</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>표준 커버 슬립</td></tr><tr><td>결정화 접시</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>전자 먼지 떨이 Falcon</td><td>Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off Air Duster</td><td>스테이플</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>필터 용지</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>파인 팁 핀셋</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>파이렉스</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>포크</td><td>슈퍼마켓</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>그래핀/Cu</td><td>그래피니아</td><td>N/A</td><td>CVD 단층 그래핀 cu</td></tr><tr><td>그리드 코팅 트로프</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td><td>깨지기 쉬운</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>캡톤 테이프</td><td>아마존(MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>폴리이미드 테이프</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Long twzeer</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>금속 그리드 홀더</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU 고급 재료</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>가연성</td></tr><tr><td>모델 10 실험실 오븐</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td></td><td></td>FO19013</tr><tr><td>페트리 접시</td><td>파이렉스</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 클리너 (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>표준 아날로그 오비탈 셰이커</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>홀리 골드 그리드</td></tr><tr><td>자외선 오존 세척 시스템</td><td>UVOCS</td><td>모델 T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of monolayer graphene-coated grids for cryoelectron microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작)

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

극저온 전자 현미경(cryoEM)은 고분자 복합체의 원자 구조를 조사하기 위한 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM을 위한 시료 전처리는 일반적으로 천공된 지지 필름의 구멍 내에 부유하는 유리질 얼음의 얇은 층에 검체를 보존해야 합니다. 그러나 CryoEM 연구에 일반적으로 사용되는 모든 시료 전처리 접근법은 시편을 공기-물 계면에 노출시켜 시료에 강한 소수성 효과를 발생시켜 종종 변성, 응집 및 복잡한 해리를 초래합니다. 또한, 시료의 영역과 공기-물 계면 사이의 바람직한 소수성 상호 작용은 거대분자가 채택한 방향에 영향을 미쳐 이방성 방향 분해능으로 3D 재구성을 가능하게 합니다. 
CryoEM 표본을 그래핀 단층에 흡착하면 배경 노이즈의 유입을 최소화하면서 공기-물 계면과의 상호 작용을 완화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 그래핀 지지체는 또한 CryoEM 이미징에 필요한 단백질 농도를 크게 낮추는 이점을 제공합니다. 이러한 지지대의 장점에도 불구하고 그래핀 코팅 그리드는 상업적 옵션의 엄청난 비용과 대규모 자체 생산과 관련된 문제로 인해 CryoEM 커뮤니티에서 널리 사용되지 않습니다. 이 논문은 단층 그래핀을 거의 완전히 커버하는 CryoEM 그리드 배치를 준비하는 효율적인 방법을 설명합니다.

여기에 설명된 그래핀 그리드 제조 프로토콜을 성공적으로 실행하면 그래핀의 단일 단층으로 완전히 코팅된 EM 그리드가 생성됩니다. 그리드의 그래핀 커버리지는 모든 TEM을 사용하여 확인할 수 있습니다. 깨끗한 그래핀의 단층은 TEM에서 거의 보이지 않기 때문에 현미경의 회절 모드를 사용하여 검사하고 그래핀을 구성하는 탄소 원자의 육각형 조직에 해당하는 브래그 스폿을 관찰해야 합니다(그림 3A). MMA 코팅 중에 발생하는 단층 그래핀의 일부 주름이 가끔 관찰되는 것은 정상입니다(그림 3B). 또한 그래핀으로 덮인 구멍 중 하나의 중앙에서 고배율 이미지를 획득하여 그래핀에 존재하는 오염 수준을 확인할 수 있습니다(그림 3C). 고해상도 검출기로 획득한 경우 이 이미지의 푸리에 변환에는 2.14Å에서 탄소-탄소 간격에 해당하는 브래그 스폿이 포함되어야 합니다(그림 4C). 탄소 원자의 단층은 위상차를 생성하기에 충분한 전자 산란을 생성하지 않으므로 깨끗한 그래핀의 이미지는 이미지의 푸리에 변환에서 대비 전달 함수와 관련된 톤 고리를 나타내지 않습니다. 그러나 그래핀 그리드가 생성된 후 오염을 방지하는 것은 매우 어려우며, EM 그리드를 충분히 세척하지 않거나 그래핀 코팅 후 MMA를 제거하면 실제 공간 이미지에서 볼 수 있는 그리드에 현저한 오염 물질이 발생합니다(그림 3C). 그림 4에서 볼 수 있듯이 그래핀 그리드는 0.5mg/mL의 아포페리틴을 그래핀 지지체가 있는 경우(그림 4A)와 없는 구멍이 있는 금 그리드에 적용할 때 관찰되는 바와 같이 샘플에 집중 효과가 있습니다(그림 4B). 유사한 그래핀 제조 프로토콜은 고분해능25,27에서 아포페리틴과 같은 단백질의 CryoEM 구조를 해결하기 위해 이전에 설명되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> 그림 1: 그래핀 코팅 CryoEM 그리드를 준비하기 위한 개략도. 그래핀 그리드 제조 과정의 주요 단계가 설명되어 있습니다. 약어: cryoEM = cryogenic electron microscopy; MMA = 메틸 메타크릴레이트; APS = 과황산암모늄. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> 그림 2: 그래핀 그리드를 만드는 데 필요한 재료. (A) Cryo-EM 그리드를 코팅하는 데 필요한 재료는 그에 따라 라벨이 부착됩니다. (B) 그래핀/Cu 시트를 유리 슬라이드의 압지에 테이프로 붙인 코터의 클로즈업 보기. 스핀 코터는 지역 컴퓨터/철물점에서 부품을 구입하여 조립할 수 있습니다. (C) 수위를 제어하는 데 사용할 수 있는 주사기에 부착된 그리드 코팅 트러프의 클로즈업 보기. 그리드는 스테인리스 스틸 메쉬의 압지 위에 배치됩니다. 압지는 그래핀 시트가 그리드와 일치할 수 있도록 그리드의 위치를 조작하는 데 도움이 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> 그림 3: 주름 또는 MMA 오염을 보여주는 그래핀 그리드의 대표적인 회절 패턴 이미지 및 명시야 이미지. (A) 그래핀 단층으로 덮인 EM 그리드는 회절 모드의 TEM에서 이미지화할 때 그래핀의 육각형 격자에 해당하는 브래그 피크를 보여줍니다. 2.14 Å 탄소-탄소 간격에 해당하는 브래그 피크는 원으로 표시되고 화살표로 표시됩니다. (B) 그래핀 단층에 약간의 주름(화살표로 표시)이 있는 단층 그래핀 그리드의 명시야 이미지. (C) MMA 오염이 있는 단층 그래핀의 명시야 이미지(화살표로 표시). 척도 막대 = 100nm(B,C). 약어: EM = 전자 현미경; MMA = 메틸 메타크릴레이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> 그림 4: 그래핀으로 덮인 금 격자의 아포페리틴: (A) 그래핀으로 덮인 금 격자에 있는 0.5mg/mL 아포페리틴의 CryoEM 현미경 사진. (B) 동일한 농도로 이미징된 아포페리틴은 그래핀이 없는 구멍이 뚫린 금 격자를 사용하여 제조할 때 실질적으로 더 낮은 농도에서 볼 수 있습니다. (C) 그래핀으로 덮인 금 격자에 0.5mg/mL 아포페리틴의 CryoEM 현미경 사진의 FFT, 브래그 피크는 육각형 그래핀 격자에 해당합니다. 척도 막대 = 100nm(A,B). 약어: cryoEM = cryogenic electron microscopy; FFT = 고속 푸리에 변환. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 그래핀의 단일 단층을 전자 현미경 그리드에 적용하기 위한 프로토콜과 CryoEM 구조 결정에 사용하기 위해 이를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작)

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

현재 생물학적 시료를 최적으로 보존하는 것은 고분해능 CryoEM 구조를 얻는 데 있어 주요 과제입니다. 시료 전처리 과정에서 시료는 소수성 공기-물 계면에 노출되어 시료에 변성 효과가 있고 안정적인 시료가 얼음에서 우선적인 방향을 채택하게 하여 고해상도 구조 결정을 방해할 수 있습니다. CryoEM 그리드를 연질 산화그래핀과 같은 얇은 탄소 층으로 코팅하는 것은 일반적으로 공기-물 계면과의 상호 작용과 관련된 문제를 해결하는 데 사용되었습니다.그러나 이 레이어는 종종 이미지의 배경 노이즈를 증가시켜 구조의 해상도를 손상시킵니다. 그래핀의 단층으로 그리드를 코팅하면 심각한 배경 소음을 유발하지 않고 유사한 보호가 가능합니다. 그래핀 코팅 CryoEM 그리드를 사용하면 공기-물 계면과의 상호 작용과 관련된 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있지만, 상업용 그래핀 그리드는 비용이 많이 들고 많은 실험실에서 그래핀 그리드가 사내에서 준비하기에는 너무 복잡하다고 생각합니다.CryoEM 분야의 연구원들은 이제 이 단계별 프로토콜을 사용하여 하루에 완전히 생산된 수십 개의 고품질 그래핀을 재현할 수 있습니다.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.

고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용

이 비디오에서 우리는 플라즈마 결합하지 않고 신경 세포 microfluidic 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다.

Microfluidic 장치의 저렴한 제작에 대한 PDMS의 비 플라즈마 본딩

이 프로토콜은 탄소 섬유 전극을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 전극은 이후 탄소 섬유 amperometry와 vesicles에서 카테 릴리스를 감지하는 데 사용됩니다.

Amperometric 전극 제작

6 잘 판의 공간 및 시간적 산소 이상의 향상된 제어를 제공하는 추가 기능에 대한 플랫폼의 제작 및 검증. 이 디바이스는 문화 시스템의 숫자로 적용할 수 있으며, 상처의 치유에 대한 산소의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기에 제시된 프로토콜은 새로운 로봇 시스템인 Spotiton의 사용을 설명하며, 액체 저온기에서 진동하기 전에 최소 90ms를 혼합하는 나노 와이어 그리드에 관심 있는 두 샘플을 전달합니다.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

학습하세요 단층 그래핀 코팅 그리드 제작 방법을 통해 초저온 전자 현미경에서 배경 소음을 최소화하고 생물학적 샘플의 무결성을 향상시키는 기술을. 이 프로토콜은 연구실에서 하루에 고품질 그래핀을 대량 생산할 수 있게 합니다.

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작)

더 많은 동영상 탐색