Name: 종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 학습하세요 종양 미세환경에서 면역 세포의 양, 유형 및 위치를 다중 면역조직화학법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 항암 치료 효과 예측과 치료 전략 수립에 중요한 통찰을 제공합니다.

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PhenoImager HT는 Radboud University Medical Center와 Radboud Technology Center for Microscopy에서 제공하는 자금을 통해 구입했습니다. CF는 네덜란드 암 협회 보조금(10673)과 ERC Adv 보조금 ARTimmune (834618)의 재정 지원을 받습니다. JT는 NWO Vidi 보조금(VI.Vidi.192.084)으로 재정적으로 지원됩니다. 저자들은 멀티플렉스 IHC 데이터를 저장하기 위한 워크플로우를 만드는 데 도움을 준 Eric van Dinther와 Ankur Ankan에게 감사를 표하고, Bengt Phung은 ROI 도면을 위해 QuPath에서 멀티플렉스 IHC 데이터를 구현하는 방법에 대한 지침을 제공해 주었습니다.

종양 면역 환경 매핑: 심층 멀티플렉스 IHC 분석 프로토콜

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

TME의 공간 분석은 특히 면역 종양학 분야에서 면역 세포 구획에 대해 자세히 알아보고 새로운 예후 및 예측 바이오마커를 발견하기 위해 인기 있는 기법입니다16. 이러한 목적을 위해 단백질, mRNA 전사체 또는 이 둘의 조합을 검출하는 등 최대 100-1,000개의 표적을 추정하는 다양한 기술이 개발되고 있습니다. 그러나 멀티플렉싱이 높을수록 처리량이 적은 실험, 더 높은 실험 비용 및 기술적 문제가 발생하며 TME의 작은 부분만 분석할 수 있는 경우가 많습니다. 여기에서 설명하는 TSA 기반 방법을 사용하는 멀티플렉스 IHC는 6개의 서로 다른 마커 + DAPI를 동시에 검출하고, 수행 비용이 상대적으로 저렴하며, 전체 조직 절편이 20분 이내에 이미징되어 완전히 분석할 준비가 됩니다. 이 기술은 염색 절차의 자동화로 덜 복잡해졌습니다. 두 개의 추가 필터 추가를 포함한 다중 스펙트럼 현미경의 개선으로 스펙트럼 불혼합 및 스캔 시간이 크게 개선되었습니다. 최대 8개의 서로 다른 마커 + DAPI를 동시에 감지할 수 있습니다. 그러나 더 많은 마커로 멀티플렉싱을 확장하면 스펙트럼 불혼합이 더 어려워지고 전체 슬라이드의 스캔 시간이 크게 증가함에 따라 앞서 언급한 이점이 사라집니다. 진단 환경에서 보다 쉽게 구현할 수 있도록 서로 다른 기관 간의 멀티플렉스 IHC를 표준화하기 위한 노력이 진행되고 있습니다. 이러한 멀티플렉스 IHC의 표준화를 위해 사용자는 6개의 서로 다른 마커 + DAPI를 사용하여 보다 접근하기 쉬운 프로토콜을 준수하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 여전히 상당한 기술적 노하우가 필요하고 다운스트림 분석이 어려울 수 있으므로 이 프로토콜에 설명된 방법론을 개발했습니다.
표준화는 멀티플렉스 IHC 패널 개발에서 시작됩니다. 특정 단백질 표적을 검출하는 1차 항체 선택의 중요성은17년 이전부터 강조되어 왔습니다. 당사의 멀티플렉스 IHC 패널은 대부분 당사의 진단 부서에서 IHC에 사용되고 검증된 1차 항체 클론으로 개발됩니다. 그러나, 수지상세포 다중화 IHC 패널의 경우, 대부분의 항체는 진단 환경에서 사용되지 않았다(van der Hoorn et al., manuscript in submission). 특이성을 보장하고 배치 차이를 최소화하기 위해 다클론 항체보다 단클론 항체를 사용하기로 결정했으며 transfection된 세포주와 일차 세포를 사용하여 대부분의 항체를 검증했습니다. 수년에 걸쳐 Vectra 3 시스템 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32를 사용하는 수많은 연구에서 다양한 버전의 멀티플렉스 IHC 패널이 사용되었습니다.. PhenoImager HT 시스템에서 이러한 멀티플렉스 IHC 패널을 최적으로 구현하기 위해 1차 항체 및 형광단 조합에서 일부 조정이 이루어져야 했습니다. 더 나은 스펙트럼 불혼합과 전체 조직 절편의 더 빠른 스캐닝 시간을 활용하려면 최신 Opal480 및 Opal780 형광단을 구현하고 7색 다중 IHC 패널에서 Opal540 및 Opal650 형광단을 사용하지 않아야 합니다. 스캐닝 시간은 조직 절편의 크기에 따라 3~10배 더 빠릅니다. 멀티플렉스 IHC 패널 조정은 매우 쉽게 달성할 수 있었지만 몇 가지 고려 사항을 염두에 두어야 합니다. Opal480의 형광 스펙트럼은 자가형광 스펙트럼과 많이 겹치므로 적혈구 및 기타 자가형광 구조의 스펙트럼 불혼합을 방해합니다. Opal480과 함께 증가된 농도의 1차 항체를 사용하면 대부분의 경우 이 문제가 해결되었습니다. PhenoImager HT에 독점적인 샘플 AF 필터를 구현하면 Opal480과 자가형광의 언믹스가 용이해집니다. 그러나 Opal480과 함께 사용할 때 명확한 신호를 생성하는 1차 항체를 사용하여 신호가 자가형광보다 높도록 하는 것이 가장 좋습니다.
이러한 멀티플렉스 IHC 패널이 구축되더라도 배치 간 변동을 고려해야 합니다. 전체 멀티플렉스 IHC 실험을 시작하기 전에 모노플렉스 IHC 대조군을 수행함으로써, 우리는 때때로 1차 항체가 실험마다 더 강하거나 더 약하게 수행되는 것을 관찰했습니다. 그 이유는 피펫팅 오류, 최적화되지 않은 시약 보관 조건 및 보관 수명일 수 있습니다. 우리는 우리의 경험을 바탕으로 1차 항체 용액을 조정하여 이 문제를 해결했습니다. 앞서 언급한 조정 중 어느 것도 할 필요가 없는 경우에도 모든 멀티플렉스 IHC 배치 실험에서 모노플렉스 IHC 염색 대조군 슬라이드를 기반으로 노출 시간을 설정하는 것이 중요합니다.
우리의 연구는 초기에 다양한 유형의 암종과 흑색종에 초점을 맞추었기 때문에 최소한의 조정으로 종양 유형 간에 상호 교환할 수 있는 멀티플렉스 IHC 패널이 필요했습니다. 따라서 우리는 항상 최적화 과정에 여러 (종양) 조직 유형을 포함시켰고 면역 세포 마커에 대한 1차 항체에 대한 희석이 서로 다른 종양 유형 간에 유사하게 유지될 수 있음을 관찰했습니다. 그러나 암종과 흑색종 사이의 종양 조직 검출에는 다른 종양 마커가 필요합니다. 따라서, 종양 마커는 항상 각 멀티플렉스 IHC 패널의 끝에서 작동하도록 최적화되었으며, 현재 항상 Opal780과 함께 사용되며, 이는 공교롭게도 멀티플렉스 IHC 염색 절차에서 마지막 형광단에 있어야 합니다. 결과적으로 멀티플렉스 IHC의 말단에 종양 마커를 사용함으로써, 이러한 멀티플렉스 IHC 패널은 교모세포종(즉, GFAP) 및 호지킨 림프종(즉, CD30)과 같은 다른 종양 유형으로 쉽게 교환될 수 있습니다. 혈관육종의 경우, 적혈구 형질전환 특이적 유전자(ERG)가 있는 이 림프구 다중성 IHC 패널을 종양 마커로 사용했으며, 단 두 번의 최적화 실험으로25. 최적화에는 ERG 1차 항체의 적정과 끝에 ERG가 있는 멀티플렉스 IHC 패널 테스트가 포함되었습니다.
이러한 멀티플렉스 IHC 패널에 대한 다른 조정은 특정 면역 세포 마커를 다른 면역 또는 기능 마커로 교환함으로써 이루어질 수도 있습니다. 모든 변화에는 최적화가 필요합니다. 최적화를 위한 프로토콜은 앞서 설명한 바와 같이 따를 수 있다17. 제안된 멀티플렉스 IHC 패널에 대한 특정 변경 사항은 우리가 만든 ImmuNet 알고리즘을 방해할 것입니다. 이러한 변경 사항을 알고리즘에 구현하기 위해 충분한 데이터가 생성되어야 하며 시간이 소요되어야 합니다(모든 새로운 마커 및/또는 세포 표현형에 대해 최소 750개의 주석, 이전에 훈련된 마커의 검증을 위한 150개의 주석). 여기에 제시된 패널에는 기능성 마커가 포함되어 있지 않지만, PD-1 및 PD-L1과 같은 면역 관문 마커를 다중 IHC 패널에 구현하는 작업이 우리 실험실에서 수행됩니다. 그러나 음수 신호와 양수 신호에서 덜 이분법적인 마커를 분석하는 것은 더 어려운 것으로 입증되었으며 우리 그룹에서 활발한 연구 영역입니다.
멀티플렉스 IHC로 동시에 평가할 수 있는 마커의 수는 다른 새로운 기술에 비해 제한적입니다. FFPE 블록의 연속된 슬라이스에서 서로 다른 패널을 분석하여 이를 피할 수 있지만 이러한 슬라이스를 공간적으로 비교하는 것은 어렵습니다. 방향과 접힌 아티팩트는 슬라이드 준비 후에 동일하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 멀티플렉스 IHC는 접근성이 뛰어나 더 많은 기관과 연구자에게 매력적인 도구가 될 수 있으므로 향후 진단 환경에서 구현하기에 더 적합합니다. 여러 종양 유형 및 다운스트림 분석 파이프라인에 대한 멀티플렉스 IHC 면역 세포 패널의 표준화를 통해 환자와 종양 유형 간의 TME의 차이에 대해 더 많은 지식을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 이는 특정 치료에 대한 항종양 반응에서 TME의 역할에 대한 더 많은 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 이는 치료에 대한 반응 및 예상 생존과 같은 요인을 예측하기 위한 새로운 바이오마커를 발생시킬 수도 있습니다. 전반적으로, 이를 통해 멀티플렉스 IHC는 맞춤형 의료 접근 방식에서 임상 의사 결정을 지원하는 임상 도구가 될 수 있습니다. 물론, 분석 절차의 더 많은 단계를 자동화하고 표준화하여 일상적인 진단 환경에서 사용할 수 있도록 해야 하므로 아직까지는 대부분 미래 지향적인 관점입니다.
단일 샘플 슬라이드에서 여러 마커를 분석하는 것은 기술적 어려움에도 불구하고 매우 강력한 도구가 될 수 있습니다. 여기에서 ImmuNet을 사용하여 설명한 바와 같이 표준화된 실험 프로토콜과 강력한 분석 방법을 사용하면 여러 마커의 정량화가 기존 IHC보다 더 많은 정보를 제공하는 반면, 멀티플렉스 IHC는 새로운 고플렉스 실험 방법에 비해 상대적으로 높은 처리량을 유지합니다.

면역 세포는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체뿐만 아니라 암세포에 대한 보호에도 중요한 역할을 합니다1. 따라서 종양미세환경(tumor microenvironment, TME) 내의 면역체계는 예후 및 예측 바이오마커를 발견하는 데 많은 가능성을 가지고 있다2. 면역 세포 침윤은 다양한 유형의 암에서 예후와 상관 관계가 있지만 아직 임상 치료에서 구현되지 않았습니다 3,4. 대부분의 종양 유형에서 세포독성 T 세포와 T helper 1 세포의 수가 많거나 조절 T 세포의 수가 적으면 예후가 양호합니다. 소위 "면역 점수"를 대장암의 TNM 병기에 통합하여 TNM-I 병기 5,6으로 전환하기 위한 노력이 진행 중입니다. 면역 점수는 서로 다른 두 종양 영역, 즉 종양 코어와 종양의 침습적 가장자리(IM)에 있는 T 세포(CD3로 검출)와 세포독성 T 세포(CD8로 검출)의 총 수에서 파생됩니다. 면역 점수는 또한 흑색종, 폐암 및 유방암과 같은 다른 유형의 암에서 예후 가치가 있는 것으로 제안되었습니다 6,7,8,9. 또한, 면역세포 침투는 관문봉쇄면역요법에 대한 반응과도 상관관계가 있을 수있다 10. 그러나 이러한 예측 바이오마커는 임상 실습에서 일상적으로 구현되기 전에 전향적 연구에서 검증되어야 합니다. 또한, 단일 바이오마커가 의미 있는 예측에 불충분하다는 것도 제안되었다11. 따라서 서로 다른 바이오마커를 결합하여 환자 샘플의 완전한 맵을 생성하는 것이 소위 "암 면역도"12에서 보다 포괄적인 예측 바이오마커로 제안되었습니다.
TME 내에서 면역 세포를 연구하는 방법 중 가장 오래되고 가장 잘 알려진 기술은 면역조직화학(IHC)으로, 여러 질병, 특히 암의 진단 검사에 일상적으로 사용된다13. 이 기법은 오랫동안 하나 또는 소수의 마커(14 )의 사용으로 제한되었기 때문에, 유세포분석 및 유전자 발현 프로파일링(GEP)과 같은 다른 기법에 의해 연구 환경에서 경쟁에서 뒤처졌다. 그러나 일상적인 진단 및 연구에 일반적으로 사용되는 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 종양 조직은 유세포 분석 및 GEP에 (최적으로) 적합하지 않습니다. 또한 GEP 및 유세포 분석은 세포 표현형 및 기능에 대한 많은 통찰력을 제공하지만 공간 정보가 부족하다는 것이 주요 단점입니다. 따라서 종양의 면역 세포 침투 영역과 면역 세포 배제 영역의 차이와 같은 샘플 내 이질성은 감지되지 않을 수 있습니다15. 조직 절편16 내에서 여러 마커를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 멀티플렉스 IHC, 이미징 질량 세포 분석 및 CO-Detection by indEXing(CO-Detection by indEXing)과 같은 FFPE 조직의 다중 분석을 위해 새로운 플랫폼이 개발되었습니다. TME의 면역 세포는 면역 요법을 위한 최상의 바이오마커를 찾기 위해 널리 연구되고 있습니다. 그러나 멀티플렉스 기술과 자동화된 이미지 분석은 그 자체로 장애물이 있습니다.
우리 실험실은 Opal/Tyramide 신호 증폭(TSA) 방법을 사용한 멀티플렉스 IHC 염색에 대한 광범위한 경험을 보유하고 있으며 IHC 플랫폼(재료 표 참조)에서 이를 자동화했습니다.17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. 당사는 림프구, 골수성 세포 및 수지상 세포(DC)의 다양한 하위 집합을 검출하기 위해 면역 세포 패널을 최적화했습니다. 림프구 또는 복잡한 세포 형태(즉, 골수성 세포 및 DC)와 같은 조밀한 면역 세포 영역을 포함하는 조직은 존재하는 면역 세포의 수를 과대평가하거나 과소평가할 위험이 있어 분석이 특히 까다롭습니다. 이 문제를 극복하기 위해 그룹32는 ImmuNet 분석 소프트웨어를 개발했으며, 이 머신 러닝 파이프라인은 이러한 다양한 유형의 면역 세포의 검출 품질을 크게 향상시켰습니다. FFPE 물질을 얻는 것부터 다양한 조직 구획의 면역 세포 밀도 및 면역 세포 유형 간의 거리 분석에 이르는 자세한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다.
이 프로토콜은 2022년 디지털 병리학 이미저가 구현된 이후 Radboud University Medical Center에서 멀티플렉스 IHC 패널이 어떻게 수행되는지 간략하게 설명합니다. 설명된 멀티플렉스 IHC 패널은 종양 마커로서 팬-사이토케라틴 항체를 사용하는 다양한 암종(예를 들어, 폐, 전립선, 결장직장, 방광, 유방)에 사용할 수 있으며, 멜라닌 세포 관련 항체를 종양 마커로 사용하는 흑색종에 사용할 수 있다. 이러한 멀티플렉스 IHC 프로토콜은 1차 항체 농도, 형광단 조합 및 염색 절차의 순서 측면에서 신중하게 최적화되었습니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 17,33,34,35 년에 멀티플렉스 IHC 패널 최적화에 대해 설명했습니다. 멀티플렉스 IHC 패널은 조정할 수 있지만, 설명된 분석 파이프라인을 평가하고 그에 따라 잠재적으로 조정하거나 재교육해야 합니다. 설명된 7색 멀티플렉스 IHC 프로토콜은 Opal 형광단 Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 및 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 사용하므로 "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence"(MOTiF)를 통해 이미저에서 쉬운 혼합 해제 및 빠른 스캔이 가능합니다. 9색 염색 및 스캐닝은 실험 설정을 더욱 미세 조정하고 액정 조정 가능 필터를 사용하는 이미저에서 다른 스캐닝 모드를 더 세밀하게 조정해야 하기 때문에 이 프로토콜에서는 설명되지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>anti-CD14</td><td>세포 마르크&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>섹션 3, 클론 EPR3653</td></tr><tr><td>안티-CD163</td><td>셀 마르크&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>섹션 3, 클론 MRQ-26</td></tr><tr><td>안티 CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>섹션 3, 클론 EPR5906</td></tr><tr><td>안티 CD1c (BDCA1)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>섹션 3, 클론 OTI2F4</td></tr><tr><td>안티 CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>섹션 3, 클론 L26</td></tr><tr><td>안티 CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>섹션 3, 클론 sp7</td></tr><tr><td>안티 CD303/ </td><td>Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td> 섹션 3을 통한 BDCA2 Dendritics<td>, 클론 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>섹션 3, 클론 MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>섹션 3, 클론 G10F5</td></tr><tr><td>안티-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>섹션 3, 클론 PG-M1</td></tr><tr><td>안티-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>섹션 3, 클론 C8/144B</td></tr><tr><td>안티-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>섹션 3, 클론 236A/E7</td></tr><tr><td>안티-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>단면도 3, 복제품 HMB45</td></tr><tr><td>반대로 HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>단면도 3, 복제품 CR3/43</td></tr><tr><td>반대로 MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>단면도 3, 복제품 A103</td></tr><tr><td>반대로 pan cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>단면도 3, 복제품 AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>시그마 Aldrich</td><td>383R</td><td>단면도 3의 복제품 EP268</td></tr><tr><td>항 티로시나아제</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>섹션 3, 클론 T311</td></tr><tr><td>항 XCR1</td><td>세포 신호 기술 Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>섹션 3, 클론 D2F8T</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>섹션 3, Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 슬라이드 (선택적으로 10% BSA를 함유한 TBST로 교체 가능)</td></tr>본<tr><td>드 흡입 프로브</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드 흡입 프로브 세척</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드 왁스 솔루션</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드 오브젝트유리 라벨 + 인쇄 린트</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드 연구 탐지 시스템 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드 RX 자동 염색기&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-section</td><td></td> <td>3, 자동화 플랫폼</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>section 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>section 3</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>본드(TM) 적정 키트</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>커버슬립 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>섹션 2</td></tr><tr><td>커버슬립 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>섹션 2</td></tr><tr><td>DAPI 플루오로마운트-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>섹션 3, monoplex 슬라이드를 빠르게 확인해야 할 때마다, 공식 분석을 위해서가 아니라, DAPI는 더 나은 결과를 위해 별도로 염색됩니다</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>섹션 2, 집에서 만든</td></tr><tr><td>에탄올 99.5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>섹션 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>섹션 3&nbsp;</td></tr><tr><td>haematoxyline</td><td></td> <td>-</td> <td>섹션 2, 집에서 만든</td></tr><tr><td>ImmuNet</td><td></td> <td>-</td> <td>면역 세포 검출 및 표현형 파이프 라인</td></tr><tr><td>inForm 소프트웨어 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences</td> <td>-</td> <td>섹션 4 & 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 시약 팩</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 슬라이드</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>섹션 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>섹션 4, 슬라이드 뷰어 및 이미징 소프트웨어가 있는 디지털 병리학 이미저(이전의 Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Quick-D 마운팅 미디어</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>섹션 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>전체 슬라이드 이미지 분석 소프트웨어 플랫폼</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 박스</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>섹션 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific through VWR</td><td>631-9483</td><td>섹션 1</td></tr><tr><td>Vectra Polaris 소프트웨어 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>제2</td></tr></tbody></table>부

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

종양 미세환경의 면역 세포 환경에는 예후 및 예측 바이오마커의 발견을 위한 정보가 포함될 수 있습니다. Multiplex immunohistochemistry는 공간 정보를 유지하면서 종양 조직에서 다양한 유형의 면역 세포를 시각화하고 식별할 수 있는 유용한 도구입니다. 여기에서는 조직 절편에서 림프구, 골수성 및 수지상 세포 집단을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 포르말린 고정 파라핀이 포매된 절편 절단, 자동화된 플랫폼에서의 자동 멀티플렉스 염색 절차, 다중 스펙트럼 이미징 현미경으로 슬라이드 스캔, 자체 개발한 머신 러닝 알고리즘 ImmuNet을 사용한 이미지 분석에 이르기까지. 이러한 프로토콜은 단순히 종양 마커를 전환하여 샘플의 다른 구획(종양 대 침습적 가장자리)에 있는 면역 세포를 분석하고 가장 가까운 이웃 분석을 적용함으로써 다양한 종양 검체에 적용할 수 있습니다. 이 분석은 종양 샘플에 국한되지 않고 다른 (비)병원성 조직에도 적용할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 장비 및 작업 흐름이 개선되어 처리 시간이 크게 단축되었으며, 이는 향후 진단 환경에서 이 절차를 쉽게 적용할 수 있도록 합니다.

이 프로토콜은 다중 면역조직화학을 사용하여 종양 미세환경의 면역 세포 특성 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

우리의 목표는 종양 미세환경 내에서 면역 세포의 양, 유형 및 위치를 식별하는 것입니다. 면역 화학 분야에서는 최근 몇 년 동안 기술이 크게 발전했습니다. 멀티플렉스 면역화학 기술의 발전으로 더 많은 마커를 신뢰성 있게 연구할 수 있습니다.현재의 실험적 과제는 종양 샘플 내에서 특정 유형의 면역 세포를 시각화하는 것인데, 이는 다중 면역 화학 방법을 사용하여 극복되었습니다. 그러나 이러한 이미지의 정확한 자동 분석은 여전히 우리가 작업하고 있는 과제입니다. 원발성 종양과 전이성 종양 사이의 면역 세포 환경 차이는 어떤 종양 내재적 특성이 이러한 차이를 유발하는지, 그리고 이러한 차이가 면역 체계를 표적으로 하는 치료법에 어떤 의미가 있는지와 같은 질문을 생성합니다.우리의 탐색적 연구와 더불어, 우리는 종양의 면역 세포 환경이 다양한 유형의 항암 요법에 의해 어떻게 영향을 받는지, 면역 세포 환경이 치료 결과를 예측할 수 있는지 여부와 같은 임상적으로 관련된 질문에 초점을 맞출 것입니다.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

이 기사에서는 이미지 분석 및 공간 분석과 결합된 수동 티라마이드 신호 증폭(TSA) 다중 면역형광(mIF)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 실험실에서 사용할 수 있는 슬라이드 스캐너에 따라 슬라이드당 2-6개의 항원을 염색하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 섹션과 함께 사용할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

다중 순환 면역조직화학은 반복적인 항원-항체 배양, 이미지 스캐닝, 이미지 정렬 및 통합을 사용하여 여러 마커를 동시에 현장에서 검출할 수 있습니다. 여기에서는 폐암과 쌍을 이루는 뇌 전이 샘플에서 이 기술로 면역 세포 기질을 식별하기 위한 운영 프로토콜을 제시합니다.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry(다중 순환 형광 면역조직화학)

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

낮은 분야 (L-밴드, 1.2 g h z) 전자 상자성 공명 녹는 nitroxyl 및 trityl 프로브를 사용 하 여 유방암의 마우스 모델에서 종양 microenvironment에 생리 적으로 중요 한 매개 변수 평가 대 한 시연입니다.

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

학습하세요 종양 미세환경에서 면역 세포의 양, 유형 및 위치를 다중 면역조직화학법으로 분석하는 방법을. 이 기술은 항암 치료 효과 예측과 치료 전략 수립에 중요한 통찰을 제공합니다.

종양 미세환경의 공간 면역 세포 풍경에 대한 다중 면역조직화학적 분석

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