Name: 광변환을 사용한 폐 전이에서 종양 세포 전파 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 배우세요 광변환 기술을 이용해 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 추적하는 방법을. 이 기술은 살아있는 생체 내에서 종양 세포 역학을 연구하고 전이 진행을 늦추는 새로운 치료법 개발에 기여합니다.

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저자는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(S10RR029545)에 도움을 준 Wade Koba, 현미경 검사에 대한 교육과 지원을 제공한 Analytical Imaging Facility의 Vera DesMarais 및 Hillary Guzik, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute(P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, 암 연구를 위한 통합 이미징 프로그램, Henry Wellcome 경 박사후 연구원(221647/Z/20/Z) 및 METAvivor 경력 개발 상.

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
수술 전에 광전환/광전환 단백질을 발현하는 암세포를 사용하여 마우스에서 폐 전이를 생성해야 합니다. 폐 전이 생성에 대한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 26,27,28.
1. 수술 준비
<ol><li>마우스 준비(제모 및 삽관), 수술 및 회복을 위한 고유한 작업 영역을 준비합니다.</li>
	<li>오토클레이브의 모든 수술 기구를 멸균합니다. 참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 핫 비드 멸균기를 사용하여 후속 절차를 위해 기구를 다시 멸균할 수 있습니다.</li>
	<li>가열된 수술 플랫폼을 켜고 37-40°C에 도달하여 안정화되도록 합니다.</li>
	<li>5% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 이소플루란을 3%로 낮춘다. 마취 적합성을 평가하기 위해 시술 전반에 걸쳐 주기적으로 발가락 꼬집기 검사를 수행합니다.</li>
	<li>마취된 쥐를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다. 왼쪽 가슴/옆구리 몸통의 털( 그림 1A 참조)을 해당 부위에 제모 크림을 발라 제거합니다. 거즈나 종이 타월을 물에 적셔 머리카락과 제모 크림을 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 반복합니다. 알림: 피부를 손상시킬 수 있으므로 제모 크림을 마우스에 20초 이상 두지 마십시오.</li>
	<li>22G 카테터 바닥 위 ~3mm의 이중 매듭을 2-0 실크 봉합사로 묶습니다. 2인치 길이의 꼬리를 남겨 둡니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 이 카테터로 마우스를 삽관합니다29,30. 성공적인 삽관을 확인하려면 팽창 전구를 카테터 끝에 부착하고 부드럽게 짜십시오. 알림: 성공적으로 삽관된 마우스는 구근 압착으로 양측 흉부 상승을 경험하게 됩니다.</li>
	<li>삽관 카테터를 제자리에 고정하기 위해 이중 매듭으로 쥐의 주위에 2-0 실크 봉합사를 단단히 고정합니다.</li>
</ol>2. 폐를 노출시키는 수술
알림: 수술 필드의 오염을 방지하기 위해 후드 또는 층류 캐비닛에서 광변환을 포함한 수술의 모든 단계(그림 1)를 수행합니다.
<ol><li>소독 비누로 손을 씻고 새 멸균 장갑을 착용하십시오. 참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 비멸균 장갑도 사용할 수 있습니다. 비멸균 장갑은 알코올 기반 소독제로 소독하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>부프레노르핀 0.1mg/kg(0.03mg/mL)을 준비하고 진통을 위해 피하 주사합니다. 참고: 국소 통증 차단제 및 비스테로이드성 항염증제를 포함한 복합 진통제는 관심 있는 생물학을 방해하지 않을 것으로 예상되는 경우 부프레노르핀과 함께 사용해야 합니다.</li>
	<li>각막 손상을 방지하기 위해 양쪽 쥐 눈에 안과 연고를 바릅니다.</li>
	<li>가열된 수술 플랫폼의 오른쪽 측면 욕창 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>인공호흡기를 삽관 카테터에 연결합니다. 카테터를 약간만 움직여도 카테터 배치를 방해하고 환기가 잘 되지 않을 수 있으므로 카테터를 안정적으로 유지하도록 주의하십시오.</li>
	<li>안정적이고 인공호흡기로 제어되는 양측 흉부의 상승 및 하강을 관찰합니다.</li>
	<li>라벨링 테이프로 팔다리를 수술 플랫폼에 고정합니다. 쥐의 등을 따라 다른 테이프를 붙이고 등쪽 피부와 털을 수술 플랫폼에 고정하여 수술 부위를 안정화합니다(그림 1A).</li>
	<li>멸균된 수술 기구를 엽니다.</li>
	<li>클로르헥시딘 용액을 쥐의 피부에 도포하여 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>흉골 왼쪽 ~7mm, 늑골하 가장자리 ~7mm 위 영역을 식별합니다. 집게로 이 부위의 피부를 들어 올리고 날카로운 미세 해부 가위를 사용하여 ~10mm의 원을 절개하고 피부만 자르도록 주의합니다.</li>
	<li>흉곽 위의 연조직을 제거합니다(그림 1B). 소작 펜으로 양쪽 끝의 주요 혈관을 소작합니다. 참고: 피부의 10mm 원형 절개 아래에 있는 모든 연조직을 절제하는 것 외에도 주변에서 일부 비근육 연조직을 추가로 제거하면 시술의 향후 단계가 용이합니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로는 뭉툭한 미세 해부 가위의 단일 날(흉벽과 평행하게 기울어지고 둥근 모서리가 아래를 향함)을 사용하여 6번째 또는 7 번째늑간근 을 조심스럽게 뚫어 흉강으로 들어갑니다(그림 1C). 필요에 따라 가위를 부드럽게 돌리고 늑간 공간을 ~10mm 절개하도록 자르고 폐 조직을 만지거나 갈비뼈가 잘리지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>늑간 절개 부위로 압축 공기를 섬세하게 배출하여 폐와 흉벽 사이의 공간을 늘립니다. 먼저 손목이나 손으로 공기를 배출하여 적절한 유동 강도를 찾고 노즐의 이물질을 제거한 다음 절개 부위에서 짧은 분사로 폐 손상을 방지합니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로 견인기를 닫은 상태로 늑간 절개부에 삽입합니다. 견인기의 날이 흉벽과 평행이 되도록 방향을 잡고 폐 자체에 닿지 않도록 주의합니다(그림 1D).</li>
	<li>견인기가 제자리에 있으면 손잡이를 천천히 풀어 견인기가 열리고 폐가 노출되도록 합니다(그림 1E). 그림 2A 는 광시야 조명을 사용하는 동안 육안으로 보이는 모습과 FITC(녹색, 비광변환) 및 TRITC(적색, 광변환) 형광 채널에서 광변환 전에 노출된 폐 전이의 대표적인 이미지를 보여줍니다.</li>
</ol>3. 폐 전이 광변환
참고: 다음 단계에 대한 자세한 내용 및 변형은 토론에서 찾을 수 있습니다.
<ol><li>건조를 방지하기 위해 37°C로 데운 멸균 PBS 2-3방울을 노출된 폐 조직에 부드럽게 바릅니다.</li>
	<li>작은 컷아웃이 있는 멸균 알루미늄 호일 조각을 마우스 위에 놓습니다. 노출된 폐 조직 바로 위에 컷아웃을 배치하고 흉부의 열린 부분과 몇 밀리미터의 주변 연조직 및 피부만 노출되도록 크기를 조정하여 노출된 폐만 광변환되도록 합니다.</li>
	<li>마우스와 알루미늄 호일 위에 컷아웃이 있는 상자를 놓습니다. 컷아웃이 노출된 폐 바로 위에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>광변환 램프를 상자의 컷아웃 바로 위에 놓습니다(그림 1F).</li>
	<li>광변환 램프를 켜고 노출된 폐 조직을 6분 동안 계속 비추십시오. 알림: 인공호흡기의 생리학적 모니터링 프로그램을 사용하여 마우스의 활력 징후를 모니터링합니다.</li>
	<li>광변환 후 램프를 끄고 마우스에서 램프, 상자 및 알루미늄 호일 마스크를 제거합니다.</li>
</ol>4. 흉벽 봉합 절차
<ol><li>2.13단계를 반복하여 흉벽에서 폐를 분리합니다.</li>
	<li>견인기 손잡이를 조심스럽게 잡고 꽉 쥐어 블레이드를 닫습니다.</li>
	<li>닫힌 견인기를 늑간 공간 밖으로 밀어내고 폐 조직을 만지지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>5-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 부위 양쪽에 갈비뼈를 통합하는 간단한 연속 봉합사 패턴으로 늑간 절개 부위를 봉합합니다(그림 1G). 봉합사를 단단히 당겨 상처 가장자리가 정립되도록 하고 흉벽의 무결성을 다시 설정합니다(그림 1H). 늑간 근육이 찢어질 수 있으므로 봉합사를 과도하게 조이지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>봉합사의 양쪽 끝을 4번 매듭을 지어 봉합사를 고정합니다. 봉합사 꼬리를 가능한 한 매듭에 가깝게 자릅니다.</li>
	<li>수술용 스테이플로 피부를 닫으십시오.</li>
	<li>28G 바늘이 부착된 1mL 인슐린 주사기로 흉강에서 과도한 공기를 제거합니다. 시포이드 돌기를 촉각적으로 찾고 바늘을 바로 아래에 삽입하고 왼쪽 어깨 쪽으로 전진하여 횡격막을 통해 흉강으로 들어갑니다. 주사기를 ~1mL로 다시 뺍니다. 마우스에서 바늘을 제거하고 주사기에서 공기를 배출합니다. 이 과정을 3-4회 반복합니다. 알림: 내부 장기에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오. 또한 더 큰 부피의 주사기를 사용하여 한 번에 모든 공기를 제거하려고 하는 것보다 1mL 주사기를 사용하고 절차를 3-4회 반복하는 것이 중요합니다. 더 큰 부피의 주사기를 사용하면 흉강의 진공이 너무 커져 폐 조직이 팽창하고 손상될 수 있습니다.</li>
	<li>이소플루란을 끕니다.</li>
	<li>쥐가 깨어날 기미가 보일 때까지 100% 산소로 환기를 계속하십시오.</li>
	<li>쥐가 깨어날 기미가 보이면 인공호흡기에서 삽관 카테터를 분리하고 주변의 봉합사를 자른 다음 쥐를 발관합니다.</li>
	<li>마우스의 테이프를 풀고 열 램프 아래 ~2피트에 위치한 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오. 쥐가 호흡 곤란이나 움직임 부족의 징후를 보이면 5% 이소플루란으로 5분 동안 마취하고, 발가락을 꼬집을 때 반사 신경이 사라지는 것을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시킵니다.</li>
	<li>쥐가 마취에서 완전히 깨어나 움직이기 시작하면 부프레노르핀 0.1mg/kg을 추가로 준비하고 수술 후 진통을 위해 피하 주사합니다.</li>
	<li>수술 후에는 쥐가 개별적으로 수용되었는지 확인하십시오. 식수에 항생제(엔로플록사신, 최종 농도 0.4mg/mL)를 제공합니다.</li>
	<li>수술 후 3일 동안은 하루에 두 번 마우스에 통증의 징후가 있는지 확인하십시오. 통증 관리를 위해 4-6시간마다 0.1mg/kg 부프레노르핀(0.03mg/mL)을 피하 투여합니다. 쥐가 감염, 부동성 또는 호흡 곤란의 징후를 보이면 안락사시킵니다. 3일째 이후에는 하루에 한 번 마우스를 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 시료 처리 및 조직 투명화를 이용한 광변환 세포 검출
<ol><li>광전환 수술 후 3 내지 5일(또는 원하는 기간) 사이에, 마우스를 5% 이소플루란으로 마취하고, 유도 후 이소플루란을 5%에서 2.5%로 감소시키고, 발가락 꼬집음 시 반사의 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 10mL의 실온 PBS로 말단 심경 관류를 수행한 후, 앞서 설명한 바와 같이 4% 파라포름알데히드 10mL를 4°C로 냉각시킨다31.</li>
	<li>관심 장기를 수집하고 앞서 설명한 대로 광학적으로 투명하게 합니다31.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 광시트 현미경으로 투명화된 조직을 이미지화합니다31. 또는 투명화된 조직을 유리 바닥 접시에 넣고 FITC 및 TRITC 채널의 이미지를 배치하여 컨포칼, 회전 디스크 또는 다광자 현미경을 사용하여 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다.</li>
</ol>6. 시료 처리 및 조직 분해를 이용한 광변환 세포 검출
<ol><li>5분 동안 5% 이소플루란으로 마우스를 마취하고, 발가락 꼬집음 시 반사 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 광변환 후 3-5일 후에 자궁 경부 탈구를 통해 희생합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 관심 기관을 수집하고 소화합니다13.</li>
	<li>소화된 조직을 도금하고 인큐베이터에 넣어 앞서 설명한 대로 하룻밤 동안 부착합니다13.</li>
	<li>다음 날, FITC 및 TRITC 채널에서 도금된 세포를 이미지화하여 앞서 설명한 대로 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다13.</li>
</ol>

폐 전이로부터의 종양 세포 전파 검사

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 논문에서는 폐에서 종양 세포의 선택적 광변환을 위한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 폐의 종양 세포를 선택적으로 표시하고 나중에 전신에서 종양 세포를 재식별하여 폐 전이에서 전이 연구를 용이하게 함으로써 그 운명을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 광변환 수술을 받은 마우스의 뇌, 간 및 광변환되지 않은 오른쪽 폐에서 광전환 세포를 시각화할 수 있었으며, 이는 이러한 세포가 광변환된 폐 전이에서 이러한 3차 부위로 재분해되었음을 나타냅니다. 광변환을 거치지 않은 쥐의 장기에서는 적혈구가 발견되지 않았는데, 이는 세포의 자연적인 자가형광이 광전환된 종양 세포와 혼동될 만큼 밝지 않다는 것을 나타낸다.
실험의 특정 측면에 세심한 주의를 기울이면 이 절차의 성공률을 높일 수 있습니다. 첫째, 폐 전이를 생성할 때 전이 생성 및 광전환/광전환 가능한 단백질에 대한 프로토콜을 고려해야 합니다. 일부 형광 단백질은 면역원성 33,34,35,36인 것으로...

전이는 암 관련 사망의 주요 원인이다1. 전이성 암은 원발성 종양의 세포가 몸 전체로 퍼져 멀리 떨어진 장기에서 임상적으로 검출 가능한 종양으로 증식할 때 발생한다 2,3.
전이는 일반적으로 종양 세포가 원발성 종양에서 퍼져 멀리 떨어진장기를 식민지화하는 단방향 과정으로 생각되지만4 임상 및 실험적 증거가 증가함에 따라 더 복잡하고 다방향적인 과정이 작용하고 있음을 시사한다. 순환 종양 세포는 원발성 종양(아직 제자리에 있는 경우)을 재파종할 수 있으며5,6,7,8,9 기존 전이성 병소의 종양 세포는 3차 부위로 이동하여 새로운 병변을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다 10,11,12,13. 실제로, 최근 게놈 분석의 증거에 따르면 일부 전이성 병변은 원발성 종양이 아니라 다른 전이에서 발생하며, 이러한 현상은 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려져 있습니다14,15,16. 전이-전이 파종은 원발성 종양을 제거한 후에도 질병 진행을 지속시켜 전이성 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 전이에서 전이로의 파종 과정을 이해하는 것은 전이성 질환 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
잠재적으로 심각한 임상적 영향에도 불구하고, 부분적으로 물류 및 기술적 한계로 인해 전이-전이 파종에 대해 알려진 바가 거의 없습니다. 사람을 대상으로 한 연구는 임상 샘플의 부족으로 인해 한계가 있습니다. 전이성 병변의 임상적 절제와 생검은 드물며, 겉보기에 건강해 보이는 장기의 생검도 드물며, 단일 파종된 종양 세포가 숨어 있을 수 있습니다. 즉, 인간 대상 연구는 일반적으로 원발성 종양이 아직 제자리에 있거나 이전에 절제되었지만 연구자가 여전히 사용할 수 있는 개인의 부검 샘플을 사용해서만 가능합니다. 이러한 샘플을 이용할 수 있는 경우, 암 진행에 대한 계통 분석은 염기서열 분석 방법14을 사용하여 수행되어야 한다. 그러나 일치하는 원발성 종양 및 전이의 대량 염기서열 분석은 포괄적인 계통 추적에 필요한 민감도를 가지고 있지 않습니다. 예를 들어, 하나의 병변에 대한 대량 염기서열 분석은 일치하는 병변 중 어느 것에서도 검출할 수 없는 서브클론을 드러낼 수 있습니다. 이 경우 이 서브클론의 기원을 확인할 수 없습니다. 원발성 종양 또는 다른 전이에서 검출 한계 이하의 빈도로 존재했을 수도 있고, 발견된 전이성 병변의 초기 집락화 이후에 발생했을 수도 있습니다. 단일 세포 염기서열분석은 향상된 감도를 제공하지만 높은 비용으로 인해 이 기술의 대규모 적용이 제한됩니다. 이러한 연구의 후향적 특성은 또한 일시적인 전이성 사건과 서로 다른 시점의 질병 환경에 대한 제한된 통찰력을 제공한다는 것을 의미합니다.
동물 모델에서, 최근의 기술 발전은 이제 높은 공간 및 시간 해상도 17,18,19,20을 갖는 전향적 계통발생 매핑을 가능하게 한다. 이러한 기술은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 활용하여 시간이 지남에 따라 축적되는 유전 가능한 돌연변이인 진화하는 바코드로 세포를 엔지니어링합니다. 염기서열분석 시 각 세포의 계통은 바코드 17,18,19,20의 돌연변이 프로파일을 기반으로 추적할 수 있습니다. 실제로, 이러한 기술은 이미 전이-전이 파종을 매핑하는 데 사용되고 있습니다. 최근 논문에서 Zhang 등은 뼈 전이의 유방암 및 전립선암 세포가 뼈에서 재확산되어 여러 장기의 2차 전이를 종자한다는 것을 입증했습니다21.
이러한 새로운 방법은 암 진행에 대한 상세한 고해상도 계통발생 지도를 생성할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있지만, 전이에서 전이로의 파종 사건의 정확한 시기와 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 사람들에게는 매우 비실용적입니다. 이러한 지식 격차를 해소하는 것은 전이성 암에 대한 이해와 치료를 개선하는 데 매우 중요하지만 이러한 연구를 촉진하는 기술이 눈에 띄게 부족합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 최근에 전이 부위(폐)에서 광변환을 통해 종양 세포를 특이적으로 표시한 후 3차 장기에서 재식별할 수 있는 새로운 기술을 개발하여 여기에 제시합니다. 이 기술을 사용하여 우리는 최근 유방암 세포가 폐 전이와 종자 3차 장기에서 재증식한다는 것을 보여주었다13. 이 기술은 또한 좁은 창 내에서 재확산 사건의 타이밍을 결정하고 재확산된 종양 세포를 정량화하는 데 사용할 수 있으며, 재확산된 세포의 유기 영양성 및 재확산을 촉진/방지하는 요인에 대한 연구를 용이하게 합니다.
하나의 형광 단백질을 다른 형광 단백질로 영구적으로 대체하는 광변환 및 국소 유도 cre/lox 시스템은종양 세포를 표시하고 추적하는 데 이전에 사용되었지만, 우리가 아는 한, 종양 세포의 시공간 표시에 대한 접근 방식은 가장 흔한 14가지 암 중 하나로 진단된 남성과 여성에게 가장 흔한 전이 부위 중 하나인 폐를 표적으로 삼도록 최적화되지 않았습니다24. 모든 암세포 유형과 폐 전이 생성을 위한 모든 프로토콜을 당사 절차와 함께 사용할 수 있으므로 전이 연구자에게 광범위하게 유용합니다. 폐 전이를 생성하는 데 사용되는 모든 암세포는 광전환 또는 광전환 가능한 단백질을 발현해야 하며, 연구자들은 특정 필요와 자원에 따라 사용할 단백질을 선택할 수 있습니다. 이 연구에서는 히스톤 H2B에 태그된 광변환 가능한 녹색-적색 형광 단백질 Dendra2(6DT1-Dendra2 세포)25를 안정적으로 발현하는 6DT1 유방암 세포를 사용했습니다. 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 세포를 암컷 Rag2-/- 마우스의 네 번째 유방 지방 패드에 주입했습니다. 원발성 종양은 주사 후 12일에서 16일 사이에 만져질 수 있었고 실험 기간 동안 절제되지 않았습니다. 자발적 폐 전이는 종양 세포 주입 후 19일에서 26일 사이에 발생했습니다. 광전환 수술은 종양 세포 주입 후 26일에서 29일 사이에 수행되었습니다. 마우스는 폐 전이 부담으로 인해 수술 후 72시간 이내에 희생되었습니다.

<table><tbody><tr><td>0-30V, 0-3A 전원 공급 장치</td><td>MPJA</td><td>9616 PS</td><td></td></tr><tr><td>12VDC, 1.2A 비조절 플러그 공급</td><td>MPJA</td><td>17563 PD</td><td></td></tr><tr><td>28G 1mL BD 인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>400nm 발광 다이오드 어레이 램프</td><td>LedEngin Inc.</td><td>897-LZPD0UA00</td><td>광변환 램프, 맞춤형 (아래 개별 부품 포함)</td></tr><tr><td>RB-1 절단 바늘이 있는 5-0 꼰 실크 봉합사</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>774B</td><td></td></tr><tr><td>9cm 2-0 실크 넥타이</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>LA55G</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacin)</td><td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td><td>sc-362890Rx</td><td>식수에 사용되는 항생제</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Hospira</td><td>0409-2012-32</td><td>진통제</td></tr><tr><td>케이블(케이블 어셈블리) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD</td><td>Mouser</td><td>172-0250</td><td></td></tr><tr><td>클로르헥시딘 용액</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>클로르헥시딘 소독제 용액</td></tr><tr><td>압축 공기 용기</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td></td></tr><tr><td>엑스트라 파인 마이크로 해부 가위 4" 스트레이트 샤프/샤프 24mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>샤프 마이크로 해부 가위</td></tr><tr><td>광섬유 조명기</td><td>O.C. White Company</td><td>FL3000</td><td>마우스 삽관 중 사용</td></tr><tr><td>쌍둥이 자리 소추 키트</td><td>하버드 장치</td><td>726067</td><td>카테리 펜</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>비드 살균기</td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>고출력 LED - 단색 자외선 90</td>와트 <td>Mouser</td><td>LZP-D0UA00</td><td></td></tr><tr><td>적외선 열램프</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane SOL 250 mL PVL</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>SurgiVet</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>잠금 장치가 있는 제이콥슨 바늘 홀더</td><td>Kalson Surgical</td><td>T1-140</td><td></td></tr><tr><td>라벨링 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68702</td><td></td></tr><tr><td>LED 조명 반사판 CREE MP-L SNGL 렌즈 반사판 및 반사판 LOC PIN</td><td>Mouser</td><td>928-C11395TM</td><td></td></tr><tr><td>긴 면 팁 애플리케이터</td><td>Medline Industries</td><td>MDS202055</td><td></td></tr><tr><td>Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron 최대 3.4GHz / 볼 베어링 / 구리 코어 / CPU 냉각 팬</td><td>CompUSA</td><td>#S457-1023</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위 4" 스트레이트 블런트/블런트</td><td>Roboz 수술</td><td>RS-5980</td><td>블런트 마이크로 해부 가위</td></tr><tr><td>쥐 인공호흡기</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>PS-02</td><td>PhysioSuite</td></tr><tr><td>Nair 제모 로션</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>제모 크림</td></tr><tr><td>Personnet 미니 견인</td>기 <td>Roboz</td><td>RS-6504</td><td>견인</td></tr>기 <tr><td>인산염 완충 식염수 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W</td><td>Addgene</td><td>51005</td><td>Dendra2 렌티바이러스</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>008897</td><td>눈 윤활제</td></tr><tr><td>설치류 삽관 스탠드</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>작은 동물 폐 팽창 전구</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-9083</td><td></td></tr><tr><td>SurgiSuite 다기능 수술 플랫폼, 온난화 포함</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M02</td><td>가열 수술 플랫폼</td></tr><tr><td>테스트 리드 48" 테스트 리드 바나나 - 블랙</td><td>Mouser</td><td>565-1440-48-0</td><td></td></tr><tr><td>테스트 리드 48" 테스트 리드 바나나 - 레드</td><td>Mouser</td><td>565-1440-48-2</td><td></td></tr><tr><td>기관 카테터&nbsp;</td><td>Exelint International</td><td>26746</td><td>22 G 카테터</td></tr><tr><td>상처 폐쇄 시스템 수의학 키트</td><td>Clay Adams</td><td>IN015</td><td>수의학 외과 스테이플링 키트</td></tr></tbody></table>

광변환을 사용한 폐 전이에서 종양 세포 전파 추적

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

암의 전신 확산인 전이는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 전이는 일반적으로 원발성 종양의 세포가 퍼져나가 종자 전이가 되는 단방향 과정으로 생각되지만, 기존 전이의 종양 세포도 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려진 과정을 통해 3차 부위에 새로운병변을 일으키고 재파종할 수 있습니다. 전이-전이 파종은 전이 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 이 현상의 이면에 있는 과정을 이해하는 것은 전이성 암 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
전이에서 전이로의 파종에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 이는 부분적으로 물류 및 기술적 한계 때문입니다. 전이-전이 파종에 대한 연구는 주로 염기서열 분석 방법에 의존하는데, 이는 전이-전이 파종 사건의 정확한 시기나 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 연구자에게는 실용적이지 않을 수 있습니다. 이는 전이-전이 파종 연구를 촉진하는 방법론이 부족하다는 것을 강조합니다. 이 문제를 해결하기 위해 폐 전이의 선택적 광전환을 위한 쥐 수술 프로토콜을 개발하여 폐에서 3차 부위로 재분해하는 종양 세포의 특이적 표시 및 운명 추적을 가능하게 합니다. 우리가 아는 한, 이것은 게놈 분석이 필요하지 않은 폐에서 종양 세포 재확산 및 전이-전이 파종을 연구하는 유일한 방법입니다.

이 프로토콜에 설명된 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서 쥐를 마취하고 왼쪽 흉부에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 마우스를 삽관하고 환기시켜 흉강이 열려 있는 동안 마우스가 산소를 공급받을 수 있도록 합니다. 흉곽을 노출시키기 위해 연조직을 제거하고 6번째 또는 7번째 늑간근을 절개합니다. 늑간 틈새에 견인기를 삽입하고 방출하여 인접한 갈비뼈를 벌리고 왼쪽 폐와 그 위에 광전환 가능한 전이를 노출시킵니다. 그런 다음 폐와 전이를 청색광에 노출시켜 노출된 병변을 광변환합니다. 광변환 후 견인기를 제거하고 갈비뼈를 다시 봉합하고 그 위에 놓인 피부를 닫습니다. 마지막으로, 흉강에서 과도한 공기를 제거하여 폐에 가해지는 압력을 완화하고 쥐가 독립적이고 자발적인 호흡을 재개할 수 있도록 합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 다양한 광전환성/광전환성 단백질에 적용할 수 있습니다...

폐 전이의 선택적 광전환을 위한 수술 프로토콜과 함께 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 연구한 후 3차 장기에서 재분해된 종양 세포를 식별하는 방법을 제시합니다.

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

최근의 증거에 따르면 기존의 전이성 병변은 새로운 병변을 유발하는 종양 세포를 퍼뜨리는 원천으로 작용할 수 있습니다. 이 과정을 전이에서 전이로의 파종이라고 하며, 종양 부담을 증가시키고 암 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 우리의 방법은 전이에서 전이 시드와 이에 영향을 미치는 요인을 연구하기 위해 개발되었습니다.이 기술은 우리 연구실에서 유방암 세포가 폐 전이에서 퍼질 수 있음을 확립하는 데 도움이 되었으며 전이를 촉진하거나 예방하는 요인을 조사할 수 있었습니다. 이러한 발견은 전이성 암의 진행을 늦추는 것에 대한 향후 연구의 지침이 될 수 있습니다. 폐는 흔한 전이 부위이지만, 생체 내에서 종양 세포 역학을 연구할 수 있는 기술은 거의 없습니다.이 기술을 사용하면 살아있는 쥐의 종양 세포를 추적할 수 있어 폐 전이 특이적 전파 경로 및 치료법에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 전이성 암은 종종 불치의 치명적인 질병입니다. 이 기술은 환자의 생명을 연장하는 치료법으로 이어지는 확산을 줄이는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

tracking-tumor-cell-dissemination-from-lung-metastases-using

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

미만성 형광 tomography는 잠복기로 높은 걸쳐 상대적으로 저렴한 비용과 잠재적인 접근 방식을...

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

우리는 녹색 형광 단백질과 루시 페라 제 기자를 발현하는 렌티 바이러스 입자 환자 유래의 이종 이식 (PDXs)의 안정적인 표시하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주 사이트 PDXs의 성장을 추적뿐만 아니라, 생체 내 이미징 시스템에서 사용 자발 실험 전이 검출을 허용한다.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

배우세요 광변환 기술을 이용해 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 추적하는 방법을. 이 기술은 살아있는 생체 내에서 종양 세포 역학을 연구하고 전이 진행을 늦추는 새로운 치료법 개발에 기여합니다.

광변환을 사용한 폐 전이에서 종양 세포 전파 추적

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