Name: 실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 학습하세요 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 척수와 뇌의 염증, 탈수초화, 축삭 손상을 채점하는 방법을. 혈청 신경사경단백 경량 측정을 통해 중추신경계 손상을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

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Raymond Sobel 박사(Stanford University)가 뇌와 척수 절편을 고치는 방법을 알려주셔서 감사합니다. 토론토 현상유전체학 센터(Toronto Centre for Phenogenomics)의 카일 로버턴(Kyle Roberton)과 밀란 강굴리(Milan Ganguly)에게 임베딩 방법을 배우고 뇌와 척수 절편을 많이 잘라낸 것에 대해 감사를 표합니다. 척수의 뇌수막하 및 혈관 주위 염증을 평가하기 위한 프로토콜을 공유해 주신 Matthew Cussick 박사와 Robert Fujinami 박사(유타 대학교)에게 감사드립니다. CD45 항체 클론을 공유해 주신 Shalina Ousman에게 감사드립니다. St. Michael's Hospital의 Keenan Research Centre of Biomedical Research에서 조직 처리기 및 조직 삽입 스테이션에 대한 교육을 제공하고 이 장비를 유지 관리해 주신 Xiofang Lu에게 감사드립니다. 이 연구는 MS Canada(SED)의 생물의학 보조금으로 지원되었습니다. 카르멘 우치페리(Carmen Ucciferri)는 캐나다 정부의 지원을 받고 있습니다. Nuria Alvarez-Sanchez는 Keenan의 박사후 연구원의 지원을 받고 있습니다.

EAE 질병 중증도를 평가하기 위한 척수의 조직학적 염색

<ol><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li>
<li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+%27homeostatic%27+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li>
<li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li>
<li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+animal+models%3A+A+clinical+and+histopathological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2%2B+monocytes+and+licenses+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li>
<li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li>
<li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).</li>
<li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li>
<li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li>
<li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li>
<li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28%26%2334%3BI+am+D+EAE%26%2334%3B%29%3A+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&#34;I am D EAE&#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866(2022).</li>
<li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194(2019).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light%3A+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li>
<li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li>
<li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Act-1004-1239%2C+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431(2021).</li>
<li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).</li>
<li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Mouse spinal brain map. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html">Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html</a> (2023).</li>
<li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li>
<li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis%3A+A+retrospective+modelling+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li>
<li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGR1%2FGPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).</li>
<li>Imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html">Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html</a> (2023).</li>
<li>Openmicroscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads">Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads</a> (2023).</li>
<li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425(2021).</li>
<li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
</ol>

Shannon Dunn은 FSD Lucid Psycheceuticals의 컨설팅을 담당합니다.

척수의 조직학적 염색은 EAE 질병의 중증도를 평가하는 데 중요한 도구이며, 특히 질병의 급성기 후 단계에서 질병 회복 정도에 치료 그룹 간에 차이가 있는 경우에 유용합니다. 면역 세포 침윤(CD45), 미엘린(LFB) 및 축삭 손상(SMI-32)에 대한 염색은 마우스에서 변경된 임상 점수의 근본적인 원인을 특성화하는 데 도움이 됩니다. 여기에 설명된 조직학적 염색 프로토콜은 염증의 관점과 미엘린 및 축삭 손상의 정도를 제공합니다. 또한, 표시된 결과는 EAE의 전체 신경 손상 정도를 평가하는 방법으로 sNF-L 측정을 검증합니다.
이 분석의 중요한 매개변수는 조사관이 절편의 정체를 눈멀게 하고 서로 다른 마우스에 걸쳐 척수의 각 수준에서 동일한 샘플링이 있는지 확인하는 것입니다. 이는 탯줄의 낮은 수준에서 염증의 심각성이 더 클 수 있기 때문입니다. 또 다른 중요한 매개변수는 실험 그룹의 크기입니다. 척수와 뇌는 일반적으로 종점에서 그룹당 6-8마리의 마우스에서 수집하여 치료 또는 유전자형이 적당한 효과 크기를 가진 그룹 간에 상당한 차이를 확인합니다. 또한 선택된 마우스의 평균을 구할 때 전체 그룹의 대표 평균 점수를 갖도록 하는 것도 중요합니다. 문제 해결과 관련하여 프로토콜에 익숙하지 않은 사람들이 직면하는 일반적인 문제는 척수가 불충분한 시간 동안 고정되어 있고 척추에서 쉽게 압출되지 않는다는 것입니다. 이 경우 가는 가위를 사용하여 가시 돌기를 따라 자르고 기둥을 열어 척수를 드러내는 방식으로 척수를 수동으로 절개할 수 있습니다. 또는 항체 염색의 성공을 방해하지 않고 며칠 동안 조직을 고정할 수 있습니다. 여기에 기술된 항체 클론은 포르말린에서 최대 2주까지 고정된 조직에서 작용합니다.
척수 조각을 삽입하려면 기술과 연습이 필요합니다. 아이 루프를 착용하고 램프를 임베딩 스테이션 위로 향하게 하여 단면이 단면으로 떨어지는지 세로 단면으로 떨어지는지 더 잘 시각화하는 것이 좋습니다. 그로스잉 시 척수 조각의 길이를 2mm 미만으로 유지하면 단면이 떨어지는 데 도움이 됩니다. 경험이 부족한 사용자에게 발생하는 또 다른 일반적인 문제는 하룻밤 배양 중에 LFB가 증발하여 슬라이드의 절반은 얼룩지고 절반은 염색되지 않은 상태로 남는다는 것입니다. 증발을 방지하려면 유리 염색 접시를 열가소성 필름으로 밀봉한 다음 플라스틱 랩으로 밀봉해야 합니다. 증발이 발생하고 단면이 고르지 않게 염색되면 탄산리튬으로 슬라이드를 완전히 탈청색하고 밤새 LFB에서 다시 염색하는 것이 좋습니다. 또 다른 일반적인 문제는 사용자가 LFB 후 회백질을 완전히 탈청색하지 않는다는 것입니다. 프로토콜의 다른 단계를 진행하기 전에 현미경으로 개별 섹션을 검사하여 충분한 양의 청색 제거에 도달했는지 확인하는 것이 중요합니다. 또한 CD45 및 SMI-32 IHC 염색은 강력한 성능을 보이지만 새로운 항체 로트를 받을 때마다 예비 실험에서 항체 농도를 문제 해결하는 것이 여전히 중요합니다. 이는 양성 대조군(EAE 척수)에서 다양한 농도의 항체를 검사하여 수행할 수 있습니다. 1차 염색에는 1차 항체를 첨가하지 않고 2차 항체만 사용하는 음성 대조군도 포함되어야 합니다. 마지막으로, 슬라이드나 섹션에서 얼룩이 고르지 않을 수 있으므로 이미지 분석에서 개별 이미지를 임계값으로 설정하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용합니다. 프로세서, 임베더 또는 마이크로톰에 액세스할 수 없는 경우 이러한 단계를 이러한 서비스를 제공하는 병원 기반 병리학 코어에 제공할 수 있습니다. 또한 슬라이드 스캐너를 사용할 수 없는 경우 비디오 카메라가 장착된 광학 현미경을 사용하여 척수 또는 뇌 영역의 TIFF 이미지를 저장할 수 있습니다. 현미경 기반 워크플로우의 경우 LFB 또는 LFB/H&E 절편을 저배율(40x 배율)로 캡처하고 CD45 및 SMI-32 염색의 경우 척수의 복부, 등쪽 및 측면 부분의 중앙에 있는 최소 4개의 창을 이미징합니다(CD45의 경우 200배 확대, SMI-32의 경우 400배 확대). 이러한 이미지에 대해 이미지 분석을 수행하여 설명된 것과 유사한 방식으로 염색을 정량화할 수 있습니다.
EAE를 점수화하기 위해 어떤 조직학적 접근 방식을 취해야 하는지에 대한 결정은 임상 점수가 그룹 간에 얼마나 다른지에 따라 달라집니다. 예를 들어, EAE 임상 점수에 급격한 차이가 있는 경우(한 그룹은 EAE를 얻었고 다른 그룹은 그렇지 않음), 이는 일반적으로 말초 매개 염증의 차이와 관련이 있습니다. 이 경우 LFB/H&E 염색 절편에 탈수초성 병변의 존재에 대한 점수는 충분하며 그룹 간의 차이를 드러낼 것입니다. 발병 시 임상 점수가 더 유사하고 임상적 회복 정도에 차이가 있는 경우(예: 그림 5A의 실험), 뇌간과 소뇌의 뇌 염증 점수를 포함하여 여기에 설명된 전체 조직학적 워크플로우를 적용하여 질병 만성의 차이가 염증 또는 조직 손상의 차이와 관련이 있는지 여부를 구별하는 것이 가장 좋습니다.  CD45 계수로 평가한 바와 같이 염증의 차이가 발견되면 T 세포(항-CD3), 침윤성 단핵구/대식세포(Mac3) 및 미세아교세포(Iba-1/TMEM119)에 대한 염색을 위해 추가 IHC 연구를 수행할 수 있습니다(권장 항체 클론은 보충 표 3 참조). 미세아교세포 활성화는 이중 표지된 Iba-1+TMEM-19+ 미세아교세포에 대한 Iba-1 염색 강도의 증가와 섹션32에 대한 Sholl 분석으로 평가할 수 있는 미세아교세포 과정의 수축 증가에 의해 반영됩니다. 또한 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 염기서열 분석과 같은 기술을 적용하여 뇌와 척수에서 면역 집단의 빈도와 표현형을 보다 심층적으로 특성화할 수 있습니다.
SMI-32+ 축삭돌기의 계수는 EAE 32,33 및 MS34에서 축삭돌기 손상을 감지하는 민감한 방법입니다. SMI-32는 transected 뉴런의 end-bulbs에 축적된 neurofilament heavy 또는 medium의 non-phosphorylated 형태를 검출합니다. 손상된 축삭돌기를 검출하는 대안은 방해된 축삭 수송의 결과로 축삭에 축적될 수 있는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 염색하는 것이다33. SMI-32 및 APP에 대한 염색 패턴은 둘 다 축삭 손상을 반영하지만, 일반적으로 겹치지 않으며, 이는 서로 다른 병리학을 검출하고 있음을 나타낸다33. 또한 척수와 뇌 모두에서 진행 중인 축삭 손상의 빠르고 민감한 측정인 sNF-L을 측정하여 축삭 손상의 조직학적 측정을 보완할 수 있습니다. 살아있는 쥐에서 반나절 만에 할 수 있다는 장점이 있습니다. 이 방법의 단점은 키트가 비싸고 기계가 고도로 전문화되어 있다는 것입니다. sNF-L 키트를 판매하는 회사는 SIMOA 기계에 액세스 할 수없는 사람들을 위해 서비스 요금을 제공합니다. 축삭 손상을 평가하는 대안은 척수12의 톨루이딘 청색 염색 부분에서 축삭을 계산하거나 척수 백질32 영역에서 SMI-31에 의해 검출된 신경 필라멘트 다발을 계산하여 축삭 손실에 대한 점수를 매기는 것입니다. 이 두 가지 모두 SMI-32 또는 sNF-L 측정보다 더 힘든 접근 방식입니다.
EAE 임상 점수가 그룹 간에 다르지만 염증, 탈수초화 및 축삭 손상에 대한 점수가 그룹 간의 차이를 나타내지 않는 경우 GFAP를 사용하여 성상세포 활성화를 위해 염색하는 것이 유용할 수 있습니다(권장 항체 클론에 대한 보충 표 3 참조). 성상세포(astrocyte) 활성화는 GFAP 염색의 증가와 연관되어 있으며, 이는 DA 랫트(35)의 만성 EAE를 포함한 일부 EAE 모델에서 EAE 진행과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
결론적으로, 이 프로토콜은 방법을 설명하고 EAE의 조직학적 스코어링을 수행하기 위한 분석 워크플로우를 제공합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 질환인 다발성 경화증(MS)1에 대한 가장 흔한 쥐 모델입니다. IFN-γ(감마) 및 IL-17 생성 T도우미 세포2의 침윤, 염증성 단핵구의 침윤3, 혈관 주위 및 수막하 염증성 탈수초성 병변4의형성, 중추신경계(CNS)의 축삭 손상4 발생을 포함한 전형적인 다발성경화증 염증 병리학도 EAE 5,6,7,8,9에서 관찰된다. EAE와 다발성경화증 사이 면역 기계장치에 있는 유사성은 EAE를 나탈리주맙, fingolimod, 디메틸 fumarate 및 glatiramer 아세테이트를 포함하여 다발성 경화증을 위한 다수 승인되는 면역 근거한 치료의 효험 그리고 작용의 기계장치 시험을 위한 적당한 전임상 모형 만들었습니다 (1,5에서 검토됨). 특정 EAE 식이요법은 뇌의 수막하 염증, 만성 탈수초화, 척수 위축, 시냅스 및 뉴런 손실의 발달을 포함하여 축삭 손상을 넘어 진행성 다발성경화증 병리학의 다른 측면을 모델링합니다 6,10,11,12. 따라서 EAE는 다발성경화증에 대한 신경 보호 요법의 효능을 선별하는 데 유용합니다.
EAE는 여러 가지 방법으로 설치류에서 유도됩니다. 능동 면역은 가장 일반적인 유도 방법이며, 열사멸 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)이 보충된 CFA에서 유화된 미엘린 항원(전체 단백질 또는 펩타이드)으로 설치류를 면역화하는 것을 포함한다 13. 마우스의 균주에 따라 백일해 독소(PTX)도 면역 0일차와 2일차에 투여하여 질병의 침투율을 높인다13. EAE는 또한 미엘린/CFA-프라임 마우스로부터 수득한 미엘린-특이적 T 세포를 건강한 마우스로 입양하여 전달함으로써 유도될 수 있거나, 14 또는 주요 미엘린 항원에 특이적인 T 세포 수용체를 과발현하는 마우스에서 자발적으로 발생할 수 있다5.
EAE 질병의 중증도 및 진행은 일반적으로 1 – 꼬리 절뚝거림, 2 – 뒷다리 또는 발 약화, 3 – 한쪽 또는 양쪽 뒷다리의 완전 마비, 4 – 앞다리 약화, 5 – 사망 또는 사망13. 이 임상 점수 시스템은 질병 발병 시 발생하는 상행 마비의 진행을 문서화하는 데는 건전하지만 중추신경계 염증 발작으로부터의 회복 정도를 포착하는 데는 덜 민감합니다. 예를 들어, 어렵게 보행하는 생쥐와 쉽게 보행하지만 발을 잡는 데 약점을 보이는 생쥐 모두 EAE 척도에서 2점이 할당됩니다. 염증 반응이 해결되었음에도 불구하고 영구적인 축삭 손상 또는 손실이 있기 때문에 EAE의 급성 후 단계에서 점수가 높게 유지될 수 있다9. EAE 9,16,17,18에서 임상적 결함의 차이를 더 잘 포착하기 위해 보다 정교한 채점 시스템, 행동 테스트, 뒷다리 및 악력 측정, 적외선 모니터링 시스템을 개발하기 위한 다양한 시도가 있었습니다. 그러나 이러한 더 복잡한 점수 측정은 근본적인 신경학적 결손에 대한 염증 대 조직 손상의 기여도를 구별하지 못합니다. 따라서 EAE의 중증도를 점수화하는 황금 표준 접근 방식은 임상 및 조직학적 점수를 모두 수행하는 것입니다.
여기에서는 EAE에서 발생하는 병변 형성의 확률적 과정을 포착하는 방식으로 생쥐 척수 및 뇌 표본을 파라핀에 해부하고 삽입하는 방법에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한 중추신경계에서 미엘린을 검출하는 Kluver와 Barrera19가 처음 만든 Luxol fast blue(LFB)로 절편을 염색하는 방법에 대한 프로토콜도 제시됩니다. 절편은 LFB만으로 염색하거나(탈수초화 분석용) 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 역염색하여 염증성 병변을 시각화하고 점수를 매기는 데 도움이 됩니다. 또한 상업적으로 이용 가능한 항체, 면역조직화학(IHC) 기술 및 공개적으로 액세스할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 척수에서 총 백혈구(CD45)의 존재, 미엘린 손실 및 손상된 축삭(SMI-32)의 수를 정량화하기 위한 프로토콜도 제공됩니다. 척수의 백혈구를 정량화하는 데 사용되는 프로토콜은 뇌의 백혈구를 정량화하는 데에도 적용할 수 있습니다.
뇌의 축삭돌기 손실과 손상에 대한 조직학적 평가는 뇌 백질관이 서로 평행하게 흐르지 않기 때문에 척수보다 상대적으로 어렵습니다. 혈청 신경 필라멘트 빛(sNF-L)의 측정은 MS20,21에서 신경 손상에 대한 유망한 바이오마커로 부상했습니다. 최근 연구에서는 이 기술을 EAE 22,23,24로 확장했습니다. 여기에서는 SIMOA(Small Molecule Assay) 분석을 사용하여 살아있는 마우스에서 혈청 신경필라멘트 광(sNF-L)을 측정하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 소량의 혈청만 필요하며 살아있는 쥐에서 단 반나절 만에 수행할 수 있어 테스트된 치료법이 전체 CNS 손상에 어떤 영향을 미치는지에 대한 신속한 피드백을 제공합니다. 여기에 설명된 모든 방법은 모든 성별 또는 균주의 마우스에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>시그마 알드리치</td><td>HT501128-4L</td><td>척수 및 뇌 표본을 고정하는 데 사용</td></tr><tr><td>1000 mL 유리 비커</td><td>파이렉스</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>스타스테트</td><td>62.554.100</td><td>척수 및 뇌 고정 및 보관</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer 플라스크</td><td>파이렉스</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 유리 비커</td><td>파이렉스</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>92 mm x 16 mm 페트리 접시</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>조직 그로스 절차에 사용</td></tr><tr><td>95 % 에틸 알코올</td><td>상업용 알코올</td><td>P016EA95</td><td>탈수 및 재수화 단계</td></tr><tr><td>ABC Elite Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>PK6100</td><td>면역 조직 화학 라벨링에 사용</td></tr><tr><td>Aqua Hold 2 PAP Pen</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>면역 조직 화학 염색</td></tr><tr><td>Avidin/Biotin 차단 키트</td><td>벡터 Labratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated rabbit anti-rat IgG</td><td>Vector labratories</td><td>BA-4000</td><td>CD45 염색에 사용</td></tr><tr><td>C57BL6/J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Stock # 664</td><td>이 마우스는 실험에 사용되었습니다. 종이에 표시됩니다.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>디왁싱에 사용됩니다. 자일렌</td></tr><tr><td>DAB Kit</td><td>Vector Labratories</td><td>SK-4100</td>의 대안입니다 <td>면역 조직 화학</td></tr><tr><td>ddH2O</td> 개발에 사용 <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>일회용 메스</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>척수 및 뇌 총체에 사용</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) 유리 염색 접시</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>조직 화학적 염색 및 세척에 사용</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences (Wheaton) 유리 염색 랙</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>면역 조직 화학 및 조직 화학에 사용</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>염색 세포질</td></tr><tr><td>깃털 마이크로 톰 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>파라핀 절단에 사용</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td>1001110</td><td>포르말린을 여과하는 데 사용됩니다 (그로스 중) 그리고 luxol 빠른 파란색</td></tr><tr><td>미세 외과 용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14160-10</td><td>뇌와 두개골을 자르는 데 사용</td></tr><tr><td>Fumehood</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>luxol 빠른 파란색 염색 절차에 사용</td></tr><tr><td>Histoplex 조직학 용기</td><td>Starplex Scientific</td><td>565-060-26</td><td>척수 및 뇌 고정</td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>조직에서 내인성 과산화효소를 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>면역 조직 화학에 사용</td></tr><tr><td>렌즈 종이</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>처리 중 카세트에 척수 종을 가두는 데 사용</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄산 리튬</td><td>시그마 Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>룩솔 빠른 청색 염색 후 탈청화</td></tr><tr><td>Luxol 블루</td><td>시그마 Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>염색 CNS 미엘린</td></tr><tr><td>M.O.M 면역 검출 키트</td><td>벡터 Labratories</td><td>BMK-2202</td><td>사용 stain SMI-32</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 화학물질</td><td>A454.2</td><td>고정에 사용됨</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxylin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26381-02</td><td>염색</td></tr><tr><td>핵 Micro-Adson 펜치와 이빨</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>해부 중 두개골 반사에 사용됨</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette Capillary Tubes CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>혈액 수집에 사용</td></tr><tr><td>Micrscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>커버 슬립에 사용</td></tr><tr><td>Mini Shaker</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>버퍼 NF</td></tr><tr><td>라이트 키트</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>이 키트는 혈청</td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>안전</td></tr><tr><td>일반 염소 혈</td>청 <td>벡터 labratories</td><td>S-1000</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>일반 토끼 혈청</td><td>벡터 labratories</td><td>S-5000</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>OmniSette 조직 카세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>척수 및 뇌</td></tr><tr><td>p1000 피펫 및 팁</td><td>임</td>베딩에 사용 다양한 <td></td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫 및 팁</td><td>다양한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 스테이션</td><td>Leica Biosystems</td><td>모델 EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 조직 침투 / 매립 매체</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>척수 및 뇌 Permount 마운팅 임베딩에 사용</td></tr><tr><td> Medium</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td> 슬라이드 pH 미터<td>에 커버 슬립을 장착하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>pHing 버퍼에 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 이송 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>pHing 버퍼에 사용</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>PBS</td></tr><tr><td>인산칼륨 모노 베이</td><td>직을 만드는 데 사용BioShop</td><td>7778-77-0</td><td>PBS</td></tr><tr><td>압력솥</td><td>북유럽 도자기</td><td>텐더 쿠커</td><td></td></tr><tr><td>정제 쥐 안티 마우스 CD45</td><td>벡터 Labratories</td><td>553076</td><td>백혈구 검출</td></tr><tr><td>시약 등급 알코올 100%</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>탈수 및 재수화 단계</td></tr><tr><td>시약 등급 알코올 70%</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>탈수 및 재수화 단계</td></tr><tr><td>로터리 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>모델 RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 기계</td><td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 마우스 IgG1 항체</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>손상된 축삭 감지</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>PBS 제조에 사용</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>PBS</td></tr><tr><td>표준 Adson 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td>해부 단계</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td>에 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>절편 수집에 사용</td></tr><tr><td>Surgical Tough Cuts</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td>척추, 체벽 및 피부 조직 프로세서를 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>모델 TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Tri-soldium citrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>항원 검색에 사용</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>섹션 세척에 사용</td></tr><tr><td>X-P Pierce XP-100 플레이트 씰</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>sNF-L 분석에 사용</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>디왁싱 및 클리어링 섹션에 사용</td></tr><tr><td>퍼넬</td><td>콜 파머</td><td>RK-63100-64</td><td>조직을 만들기 전에 포르말린을 여과하는 데 사용</td></tr><tr><td>Stir Plate</td><td>Any</td><td></td><td>용액을 만드는 데 사용</td></tr> 오븐 Any <tr><td></td><td></td><td></td> Parafilm Bemis 13-374-10 절단 후 조직 섹션을 굽는 데 사용 <td>LFB 염색 접시를 밀봉하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>전자레인지 Any <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>타이밍은 마이크로파 모델에 따라 다를 수 있습니다:</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>블로킹 버퍼</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td>를 만드는 데 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>마우스 혈청 샘플을 저장하는 데 사용</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Any</td><td></td><td>sNF-L 분석을 위한 샘플을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Any</td><td></td><td>sNF-L 분석을 위한 효소 기질을 가온하는 데 사용</td></tr></tbody></table>

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 일반적인 면역 기반 모델입니다. 이 질병은 미엘린 수초의 단백질 성분과 완전한 프로인트 보조제(CFA)를 사용한 적극적인 면역에 의해 또는 미엘린 단백질/CFA를 프라이밍한 설치류에서 미엘린 특이적 T 효과기 세포를 순진한 설치류로 전달하여 설치류에서 유발될 수 있습니다. EAE의 중증도는 일반적으로 상행 마비의 정도를 측정하는 5점 임상 척도로 점수가 매겨지지만 이 척도는 EAE에서 회복 정도를 평가하는 데 최적이 아닙니다. 예를 들어, 일부 EAE 모델(예: EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질[MOG] 펩타이드 유도 모델)에서 임상 점수는 높은 수준을 유지합니다. 따라서 중추 신경계(CNS)에서 세포 손상의 기본 메커니즘을 연구하는 수단을 제공하는 EAE의 조직학적 점수로 임상 점수를 보완하는 것이 중요합니다.
여기에서는 생쥐의 척수 및 뇌 절편을 준비하고 염색하고 척수의 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 점수화하기 위한 간단한 프로토콜이 제시됩니다. 척수에서 백혈구 침윤을 채점하는 방법은 EAE에서 뇌 염증을 채점하는 데에도 적용될 수 있습니다. SIMOA(Small Molecule Assay) 분석을 사용하여 마우스의 혈청에서 용해성 신경필라멘트 광(sNF-L)을 측정하기 위한 프로토콜도 설명되며, 이는 살아있는 마우스의 전체 CNS 손상 정도에 대한 피드백을 제공합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증의 동물 모델 역할을 합니다. 이 기사에서는 EAE에서 척수 염증, 탈수초화 및 축삭 손상을 채점하는 접근 방식을 설명합니다. 또한, 생쥐 혈청에서 용해성 신경 필라멘트 광 수준을 정량화하는 방법이 제시되어 살아있는 생쥐의 축삭 손상 평가를 용이하게 합니다.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

우리는 자가면역과 다발성 경화증 또는 다발성 경화증이 어떻게 시작되는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 이 연구는 다발성경화증과 관련된 위험 요인을 연구하기 위해 다양한 접근 방식을 사용합니다. 자가면역의 발달로 이어집니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다양한 위험 요인이 자가면역에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있는 다발성경화증의 마우스 모델입니다.우리는 최근 다발성경화증 위험 인자 중 하나가 어떻게 생쥐의 자가면역 염증을 증가시키는지에 대한 생물학적 경로를 발견했습니다. EAE 모델에 대한 연구는 이러한 메커니즘을 밝히는 데 중요했습니다. EAE 질병 중증도는 종종 5점 임상 척도로 점수가 매겨집니다.그러나 이 척도는 민감도가 제한되어 있어 임상적 결손이 염증 또는 조직 손상에 의한 것인지 구별할 수 없습니다. 척수와 뇌의 조직학은 EAE의 염증 및 조직 손상을 평가하는 황금 표준 방법입니다. 이 프로토콜은 EAE 동안 척수와 뇌의 염증 및 조직 손상을 측정하는 간단한 방법을 제공합니다.당사의 프로토콜은 EAE의 중증도를 더 잘 특성화하기 위해 임상 규모와 함께 사용할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 면역 침윤, 탈수초화, 척수의 축삭 손상 및 뇌 염증을 포함한 EAE의 주요 조직학적 특징을 측정합니다. 또한 쥐 혈청의 신경 필라멘트 광선을 측정하여 중추신경계 손상 정도를 나타내는 것도 포함됩니다.이 포괄적인 프로토콜은 하나의 마커만 사용하는 것보다 EAE에 대한 더 자세한 특성을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

DA 쥐에서 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 encephalomyelitis :이 비디오는 여러 경화증의 동물 모델의 유도 및 임상 채점을 보여줍니다. 전체 쥐의 척수하고 완전한 프로 인드의 도움이되는가 포함된 유제와 immunizing 쥐가 유도된 질병은, 인간의 질병을 닮은 임상 징후를 보여줍니다.

유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 다발성 경화증의 설립 동물 모델입니다. C57BL / 6 마우스는 중추 신경계 자기 반응성 면역 세포에 의해 야기 오름차순 이완성 마비를 초래 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) 펩티드 35-55 (MOG 35-55)로 면역화된다. 질병 유도 및 모니터링을위한 프로토콜이 논의 될 것이다.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

학습하세요 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 척수와 뇌의 염증, 탈수초화, 축삭 손상을 채점하는 방법을. 혈청 신경사경단백 경량 측정을 통해 중추신경계 손상을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

실험적 자가면역 뇌척수염에서 중추신경계 염증, 탈수초화 및 축삭 손상 채점

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