Name: 2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 저렴하고 간단한 방법으로 3D 피부 모델을 구축하는 세포 배양 기술을. 교각세포, 섬유아세포, 멜라닌세포를 활용하여 다양한 세포 유형을 포함하는 현실적인 피부 모델을 만들 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>유연한 연구 응용을 위한 효율적인 3D 피부 모델

피부는 다세포 상호 작용이 있는 연속적인 구조로, 이 복잡한 기관의 적절한 기능과 항상성을 드러냅니다. 그것은 형태 학적으로 다른 층으로 만들어집니다 : 내부 층 - 진피와 외부 층 - 표피. 표피 위에, 우리는 외부 환경에 대한 가장 큰 보호를 제공하는 각질층 (평평한 죽은 세포 - 각막 세포로 구성)을 추가로 구별합니다. 피부의 가장 중요한 수동적 및 능동적 기능 중 일부는 외부 요인에 대한 신체 보호, 면역 과정 참여, 분비, 흡수, 체온 조절 및 감지 1,2,3입니다. 신체에서 가장 큰 장기 중 하나로 간주되기 때문에 다양한 병원체, 알레르겐, 화학 물질 및 자외선(UV)과의 접촉을 피할 수 없습니다. 따라서 특정 기능을 가진 많은 유형의 세포로 구성됩니다. 표피에 존재하는 주요 유형의 세포는 각질 형성 세포(모든 세포의 거의 90%가 표피의 깊은 부분에서 구조적 및 면역학적 기능을 하지만 나중에 표피의 최상층에서 각막 세포로 전환하기 위해 각질화 과정을 거치음), 멜라닌 세포(표피 세포 집단의 3%-7%에 불과하며 UV 보호 색소 멜라닌을 생성함) 및 랑게르한스 세포(면역 체계에서). 진피의 경우 주요 세포는 섬유아세포(성장 인자 및 단백질 생성), 수지상 세포 및 비만 세포(면역 체계의 두 세포 유형)입니다4,5,6. 또한, 피부는 여러 세포외 단백질(예: 콜라겐 유형 I 및 IV, 피브로넥틴 및 라미닌; 그림 1) 단백질 섬유(콜라겐 및 엘라스틴)는 피부의 특정 구조를 보장할 뿐만 아니라 세포 결합, 세포 접착 및 기타 상호 작용을 촉진합니다7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig01.jpg"> 그림 1: 스킨 구조를 보여주는 개략도. 피부 구조는 개별 층에서 발생하는 4가지 기본 세포 유형과 세포외 기질의 구별된 단백질을 표시했습니다. 이 그림은 MS PowerPoint로 만든 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
화장품 및 의약품의 안전성은 매우 중요한 문제이며 소비자와 환자의 건강을 보호하는 것이 최우선 과제입니다8. 얼마 전까지만 해도, 그것은 동물을 대상으로 한 연구를 포함하여 수많은 실험에 의해 보장되는 것으로 여겨졌다. 불행히도, 이러한 방법은 종종 과감한 방법을 사용해야 했으며, 연구 목적으로 사용되는 동물(종종 생쥐, 쥐, 돼지)에게 고통과 고통을 유발했습니다. 1959년, 인도적 실험기법의 원칙(3R 원칙)이 도입되었다: (1 - 대체) 연구 중인 동물을 in vitro, in sillico 또는 ex vivo 모델로 대체, (2 - 환원) 연구에 사용되는 동물의 수를 줄이고, (3 - 개선) 여전히 연구에 필요한 동물의 복지를 개선하고 동시에 개발된 대체 방법을 개선한다9. 또한 유럽 연합(EU)에서는 화장품 동물 실험을 법으로 규제하고 있습니다. 2004년 9월 11일부터 동물 실험 화장품 사용 금지령이 발효되었습니다. 2009년 3월 11일, EU는 화장품 성분에 대한 동물 실험을 금지했습니다. 새로 동물 실험을 거친 성분으로 만든 화장품의 판매는 허용되지 않았습니다. 그러나 반복 투여 독성, 생식 독성 및 독성 동태학과 같은 복잡한 인간 건강 문제에 대해 동물을 대상으로 제품을 테스트하는 것은 여전히 허용되었습니다. 2013년 3월 11일부터 EU에서는 완제품 또는 그 성분이 동물 실험을 거친 화장품의 판매는 불법이다10. 따라서 현재 미용에서는 in vitro (세포), ex vivo (실제 조직) 및 in vivo (지원자)의 세 가지 수준에서 연구가 수행됩니다11. 의약품의 경우 동물 실험의 필요성은 여전히 남아 있습니다. 그러나 현저히 줄어들고 엄격하게 통제됩니다12.
동물 실험의 대체 방법 및 새로운 활성 성분의 효과에 대한 초기 평가를 위해 체외 피부 세포 배양이 사용됩니다. 다양한 유형의 피부 세포를 분리하고 멸균 실험실 조건에서 배양하면 활성 물질의 안전성과 독성을 평가할 수 있습니다. 피부 세포주는 또한 인증된 회사에서 세포를 판매하고 그 결과를 다른 실험실에서 비교할 수 있기 때문에 널리 인정받는 연구 모델입니다. 이러한 테스트는 일반적으로 인간 피부 세포 단일 배양의 간단한 2D 모델에서 수행됩니다. 보다 발전된 모델 중 일부는 공동 배양(예: 섬유아세포가 있는 각질형성세포 및 멜라닌세포가 있는 각질형성세포)뿐만 아니라 스캐폴드가 없는 배양(구체) 및 표피, 진피 또는 피부의 전체 두께 대체물인 스캐폴드 기반 피부에 등가물을 포함하는 3차원 모델입니다(13). 마지막 유형(피부 등가물)을 제외하고 나머지는 상업적으로 이용 가능하지 않으며 필요한 경우 과학자가 직접 준비해야 한다는 점을 언급할 가치가 있습니다.
이러한 모델 중 상당수가 유지 관리되어 오늘날 일상적으로 판매되고 있지만(표 1), 대부분의 결과를 검증하기 위해 추가 모델이 지속적으로 필요합니다. 따라서 새롭게 엔지니어링된 모델은 인체에서 발생하는 실제 상호 작용을 더 잘 재현해야 합니다. 상이한 유형의 세포의 혼합물이 이러한 모델을 형성하는 데 사용될 때, 생체 내 조직의 다세포 측면의 재현이 달성될 수 있다. 그 결과, 유기형 배양(organotypic culture)이 개발됩니다(그림 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">이름</td>
			<td colspan="4">묘사</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">중성 피부</td>
			<td colspan="2">에피스킨</td>
			<td colspan="4">재건된 인간 표피 - 콜라겐 막의 각질 세포</td>
		</tr><tr><td colspan="2">스킨윤리 RHE</td>
			<td colspan="4">재건된 인간 표피 - 폴리카보네이트 막의 각질 형성</td>
		</tr><tr><td colspan="2">스킨윤리 RHE-LC</td>
			<td colspan="4">인간 표피 모델 Langerhans 세포 - 폴리카보네이트 막의 각질 세포 및 Langerhans 세포</td>
		</tr><tr><td colspan="2">스킨에티컬 RHPE</td>
			<td colspan="4">Reconstructed Human Pigmented Epidermis - 폴리카보네이트 멤브레인의 각질 세포 및 멜라닌 세포</td>
		</tr><tr><td colspan="2">T스킨</td>
			<td colspan="4">재구성된 인간 전체 두께 피부 모델 - 폴리카보네이트 막에서 성장한 섬유아세포층의 각질 세포</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Phenion FT 스킨 모델</td>
			<td colspan="4">하이드로겔의 각질세포와 섬유아세포</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">질병이 있는 피부</td>
			<td colspan="2">흑색종 FT 피부 모델</td>
			<td colspan="4">인간 악성 흑색종 세포주 A375를 가진 정상 인간 유래 각질세포 및 섬유아세포</td>
		</tr><tr><td colspan="2">건선 조직 모델</td>
			<td colspan="4">정상적인 인간 각질세포 및 섬유아세포</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다양한 연구에서 가장 인기 있는 상업용 피부.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65773/65773fig02.jpg"> 그림 2: 다양한 in vitro 모델의 복잡성. 유기체를 재현하기 위한 다양한 in vitro 모델의 복잡성과 인체에서 직접 발생하는 실제 상호 작용 간의 관계. 이 그림은 Servier Medical Art의 Servier (https://smart.servier.com/)의 "Microbiology and Cell Culture"세트에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65773/65773fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
상업적 등가물의 가장 중요한 제한 사항 중 하나는 몇 가지 유형의 세포(일반적으로 1-2개, 드물게 3개)를 가진 매우 일반적인 연구 모델만 사용할 수 있다는 것입니다. 그러나 피부에는 더 많은 세포가 존재하며, 이들이 서로 상호 작용하여 다양한 성분에 대한 내성이 향상되거나 나빠질 수 있습니다14. 일부 면역 성분의 결핍은 면역 요법을 포함한 여러 종류의 연구에서 그 가치를 감소시킬 수 있습니다. 흑색종은 전이가 조기에 시작되고 적용된 치료에 대한 빈번한 내성으로 인해 생명을 위협하는 피부암이기 때문에 이는 심각한 문제이다15. 인공 피부 모델을 개선하기 위해 연구자들은 면역 세포와 세포주 및 오가노이드16의 공동 배양을 시도하고 있으며, 이는 연구 된 모델의 큰 개선으로 간주됩니다. 예를 들어, 비만세포는 피부에서 많은 생리적(상처 치유, 조직 재생) 및 병리학적(염증, 혈관신생, 종양 진행) 과정에 참여한다17. 따라서, 모델에서의 발생은 연구된 화합물에 대한 모델의 반응을 크게 변화시킬 수 있습니다. 마지막으로, 많은 피부 관련 정보가 여전히 누락되어 있으며, 이는 기초 연구를 수행해야만 발견할 수 있습니다. 그렇기 때문에 다양한 인공 피부 모델(표 2)을 만들고 개선하는 것이 매우 중요한 노력입니다. 이 문서에서는 구체 및 이에 상응하는 스킨을 포함한 고급 스킨 모델을 만드는 몇 가지 절차를 제공합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>인비트로(In vitro ) 스킨 모델</td>
			<td>조직에서 발생하는 상호 작용을 재현하려고 시도합니다.</td>
			<td>사용된 셀의 예</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">2D 또는 3D 세포 배양</td>
			<td rowspan="3">표피</td>
			<td>각질형성세포</td>
		</tr><tr><td>멜라닌 세포</td>
		</tr><tr><td>각질형성세포 + 멜라닌세포</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">피부</td>
			<td>섬유아세포(Fibroblasts)</td>
		</tr><tr><td>비만 세포</td>
		</tr><tr><td>섬유아세포 + 비만세포</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">피부</td>
			<td>각질세포 + 섬유아세포</td>
		</tr><tr><td>각질형성세포 + 비만세포</td>
		</tr><tr><td>멜라닌 세포 + 섬유아세포</td>
		</tr><tr><td>멜라닌 세포 + 비만 세포</td>
		</tr><tr><td>각질형성세포 + 섬유아세포 + 멜라닌세포</td>
		</tr><tr><td>각질형성세포 + 섬유아세포 + 비만세포</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 2D 및 3D 배양에서 피부 조직을 재현하기 위한 세포 유형 혼합물의 예.

<table><tbody><tr><td>부착 세포 배양을 위한 24-웰 플레이트</td><td>Biologix Europe GmbH</td><td>07-6024-35</td><td></td></tr><tr><td>%&ndash; 38%</td><td>HCL Chempur</td><td></td> <td>115752837-60</td></tr> <tr><td>mm 세포 배양 페트리 접시&nbsp;</td><td>둥지</td><td></td> <td>705001-Avidin</td></tr><tr><td>&minus; Sulforhodamine 101</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2348-5MG-</td><td></td></tr><tr><td>명시야 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX41-Calcium</td><td></td></tr> <tr><td>chloride</td><td>Avantor</td><td>부착</td> 세포용 874870116<td>-</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크 T75</td><td>Genoplast</td><td>G77080033-Centrifuge</td><td></td></tr> <tr><td>tube 15 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td>G66010522-CO2</td><td></td></tr> <tr><td>인큐베이터</td><td>Heal Force</td><td>Galaxy 170R-Col1A2</td><td></td></tr> <tr><td>항체 토끼</td><td>Novus</td><td>NBP2-92790-Corning</td><td></td></tr><tr><td>(R) Transwell(R) 폴리카보네이</td>트 <td>Corning</td><td>CLS3422-48EA-Cytokeratin</td><td></td></tr> <tr><td>14 항체</td><td>마우스 Novus</td><td>NBP1-79069-DPX</td><td></td></tr> <tr><td>조직학용 마운트런</td>트 <td>Sigma Aldrich</td><td>06522-100ML</td><td>-</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>VWR Chemicals</td><td>L0102-500-Eosine</td><td></td></tr> <tr><td>Y</td><td>Kolchem-0.5</td><td></td> <td>% 수용액</td></tr><tr><td>Eppendorf tube 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001-Eppendorf</td><td></td></tr> <tr><td>tube 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.691-Ethyl</td><td></td></tr> <tr><td>alcohol absolute 99.8%</td><td>Avantor</td><td>396480111</td><td>초순수에 희석하여 필요한 경우 농도&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco 10270106</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>형광 반전 현미경&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>95% 에탄올에서</td>FITC<td></td></tr> <tr><td>Sigma Aldrich</td><td>F0257-1mL</td><td></td>염소 항토끼 2차 항체와 결합된 Olympus IX71-Goat 항-마우스 <td>2차</td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570-Laminar</td><td></td></tr><tr><td> 챔버</td><td>Heal Force</td><td>HFSafe-1200-Melan-A</td><td></td></tr> <tr><td>항체는 생쥐</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td>에서 생산되었습니다. <td>sc-20032-Microtome</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microm</td><td>HM355S-NaOH</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Avantor</td><td></td> <td>810981997-Paraffin</td></tr> <tr><td>pastilles</td><td>시그마 Aldrich</td><td>1.07164</td><td>-</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>1581227</td><td>-</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4333</td><td>-</td></tr><tr><td>피펫 팁, 1000 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>-</td></tr><tr><td>피펫 팁, 20 &마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3021</td><td>-</td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 & 마이크로; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.303-Pluronic</td><td></td></tr> <tr><td>F-127</td><td>BASF</td><td></td> <td>50401036-</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 10 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td>G33270011</td><td>-</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 25 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td>G33280011</td><td>-</td></tr><tr><td>혈청학적 피펫 5 mL</td><td>GoogLab Scientific</td><td>G33260011</td><td>-</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5761-Sodium</td><td></td></tr> <tr><td>bicarbonate</td><td>Chempur</td><td>118105307</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% 용액, 페놀 레드</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td> <td>25200072-Type</td></tr> <tr><td>1 콜라겐</td><td>IBIDI</td><td>50201-U-bottom</td><td></td></tr> <tr><td>96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925500-Xylene</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>534056</td><td>-</td></tr></tbody></table>

2차원(2d) 단일 배양에서 3차원(3d) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

building-up-skin-models-for-numerous-applications-from-two

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 보고서에서는, 우리는 3 차원의 피부 구조와 구성에 인간의 피부를 모방 모델을 재구성 설명합니다. Melanocyte 생리, 흑색증의 진행 및 피부 줄기 세포의 운명은 피부 모델을 재구성 사용하여 조사되었습니다. 모델은 또한 약물 평가를위한 잠복기 도구로 유용합니다.

3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

이 비디오는 흑색종 진행을 연구하기 위해 체외 3D 유기형 피부 재건을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 피부 모델은 생체 내 장기의 구조와 다세포 복잡성을 모두 모방합니다.

유기형 전체 피부 재구성 생성: 인간 피부 샘플을 사용하여 3D 피부 모델을 구축하는 절차

우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

이 프로토콜은 재현 가능하고 견고한 방식으로 3차원 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단한 방법을 설명합니다. 또한 표피 장벽 모델의 구조 기능 관계를 특성화합니다. 선동적인 자극에 재구성된 인간 표피의 생물학 반응은 또한 제시됩니다.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

전도성 금속 잉크의 평면 및 입체 인쇄가 설명되어 있습니다. 우리의 접근 방식은 fabricating 인쇄 전자, 광전자, 그리고 microscale에서 비정상적인 레이아웃에 생물 의학 장치를위한 새로운 길을 제공합니다.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.

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