Name: 췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 배우세요 췌관 선암(PDAC) 세포를 다능성 줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을. 이 기법은 췌장암 진행 과정을 연구하고 조기 진단 마커를 발견하는 데 활용됩니다.

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A.S와 J.K는 자금 지원을 해주신 Cancer Research UK와 OHSU에 감사의 뜻을 전합니다(CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S는 MRC 경력 개발 상(MR/N024028/1)의 지원을 받습니다. AA는 박사 장학금(장학금 참조 1078107040)으로 자금을 지원합니다. JK는 MRF New Investigator Grant(GCNCR1042A)와 Knight CEDAR Grant(68182-933-000, 68182-939-000)의 자금 지원을 받습니다. 재프로그래밍 벡터 pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M을 제공해 주신 Keisuke Kaji 교수님께 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.

PDAC 및 췌장 세포를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

암 진행을 연구하기 위한 iPSC 재프로그래밍의 사용을 용이하게 하기 위해 췌장암 세포를 재프로그래밍하기 위한 강력한 프로토콜이 확립되었습니다. 암세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 지금까지 매우 어려운 것으로 입증되었는데, 이는 암세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성한 연구가 소수에 불과하기 때문이다 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. 이러한 연구의 대부분은 iPSC 세포주를 생성하기 위해 불멸화된 암 세포주를 사용했으며, 1차 환자 유래 세포주를 생성하지 않았다 36,37,38,40,42,43,44,46. 예를 들어, OSKM 인자의 레트로바이러스 도입을 사용하여 4개의 서로 다른 간암 세포주를 재프로그래밍하려고 시도했지만, 단 하나의 세포주만이 성공적으로 재프로그래밍되었다41. 그러나 생성된 간암 iPSC 라인은 몇 번의 통과 후 줄기 손실이 나타났으며, 이는 OSKM 재프로그래밍에 대한 암세포의 높은 내성을 강조합니다41. 이전에는 OSKM의 렌티바이러스 전달을 사용하여 PDAC 세포를 개별적으로 재프로그래밍하려는 시도가 있었습니다. 그러나, 외인성 OSKM 발현에 의존하는 단일 iPSC 라인만이 생성되었고, 따라서 완전히 재프로그래밍되지 않았다37. 또 다른 연구에서는 에피솜 벡터를 사용하여 게놈 통합 없이 OSKM 인자를 전달했지만 PDAC39에서 단일 iPSC 클론만 생성할 수 있었습니다. 암세포를 재프로그래밍하는 데 있어 제한적인 성공은 암 연구에서 iPSC 기술의 사용을 방해하는 많은 문제를 가중시킵니다.
여기에서는 두 명의 서로 다른 환자와 하나의 확립된 PDAC 세포주(BxPc3)에서 유래한 1차 PDAC 샘플에서 iPSC를 생성하는 방법을 설명합니다. 또한 iPSC는 췌관 상피 세포주인 H6c7에서도 생성되었습니다. 우리가 아는 한, 이것은 BxPc3 및 H6c7에서 성공적으로 도출된 안정적인 iPSC 라인에 대한 첫 번째 보고서입니다. 이 프로토콜에 따라 iPSC는 건강한 개인에서 유래한 1차 인간 섬유아세포에서도 성공적으로 생성되어 암 연구를 넘어 이 방법의 적용 가능성을 확장했습니다.
프로토콜의 성공의 핵심 요소 중 하나는 빅시스트로닉 렌티바이러스 벡터를 사용하여 OS 및 KM 인자를 함께 발현하는 것입니다. 이 벡터는 내부 리보솜 진입 부위 2(IRES2)를 포함하여 한 벡터에서 OCT4 및 SOX2를 발현하고 다른 벡터에서 KLF4 및 cMYC를 발현합니다. 각 재프로그래밍 인자를 개별적으로 전달한 monocistronic 벡터를 사용한 여러 연구에서 각 벡터의 흡수가 다르고 OSKM 화학량론과 재프로그래밍 효율에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다47. bicistronic 벡터를 사용하면 이 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 더욱이, 렌티바이러스 벡터에서 IRES를 사용하는 것은 재프로그래밍 효율의 현저한 증가를 보여주었다48. 이 렌티바이러스 시스템에서 OS 발현은 EF1a promoter에 의해 유도되는 반면, KM 발현은 CMV promoter에 의해 제어됩니다. CMV 프로모터는 EF1a49,50과 달리 DNA 메틸화 및 히스톤 탈아세틸화에 의해 매우 효율적인 침묵을 받을 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 리프로그래밍 중 OS 이전에 KM을 조기에 침묵시키는 것이 프로토콜의 성공에 중요한 요소가 될 수 있습니다. 이는 51,52,53,54,55를 다시 프로그래밍하는 동안 OSKM 발현 역학의 중요성을 보여주는 이전 연구와 일치합니다. 따라서, bicistronic 벡터는 또한 polycistronic 벡터보다 더 유리한데, 여기서 모든 OSKM 인자는 단일 프로모터(56)로부터 발현된다. 프로토콜의 성공에 기여하는 다른 요인으로는 렌티바이러스 감염의 선량과 각 세포 유형에 맞게 맞춤화된 재프로그래밍에 사용되는 감염된 세포의 수가 있습니다.
요약하면, 다른 세포주 및 정상 세포와 함께 일차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 최적화된 방법이 제시됩니다. 이 방법은 암 진행을 모델링하고 이 경우 초기 PDAC 바이오마커를 발견하기 위해 iPSC 재프로그래밍의 사용을 확대하는 데 도움이 될 것입니다.

췌관 선암(PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이며, 질병의 무증상 특성으로 인해 조기 진단이 여전히 어렵습니다. PDAC 환자의 대다수는 매우 제한된 치료 옵션을 이용할 수 있는 진행성 전이성 단계에서 진단됩니다 1,2. 이는 주로 혈류로 방출되는 단백질로 편리하게 검출될 수 있는 것과 같은 초기 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문입니다.
PDAC는 진행 중 매우 초기에 퍼질 수 있으며, PDAC가 췌장에 국한되어 있을 때 더 나은 예후가 암 조기 발견과 관련이 있다3. 그러나 PDAC 환자의 10분의 1 미만이 예후가 양호하여 외과적 절제가 가능하다는 진단을 받습니다. 그럼에도 불구하고 절제 가능한 종양이 있는 소수의 종양은 12개월 이내에 재발하기 쉽다4.
지난 50년 동안 수술 기법, 환자 치료 및 치료 방식에서 괄목할 만한 개선이 이루어졌다 5,6. 그러나 수술로 절제된 PDAC 환자의 5년 생존율은 17%로 거의 증가하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이는 거의 변하지 않은 비절제 환자(0.9%)보다 여전히 양호합니다4,7. 화학 요법은 유일한 대체 PDAC 치료법입니다. 그러나 대다수의 PDAC 환자가 젬시타빈 7,8과 같은 화학요법 약물에 강한 내성을 보이기 때문에 이 옵션은 매우 제한적입니다. 엘로티닙(Erlotinib)과 같은 다른 약물은 특정 돌연변이를 가진 소수의 PDAC 환자에게만 제공되며, 이들 중 대부분은 엘로티닙 내성을 보인다9. 대부분의 PDAC 환자에서 화학요법과 관련된 부작용은 이 치료법의 또 다른 단점이다10. 최근에는 면역관문억제제(ICI)와 저분자 키나아제 억제제(SMKI)가 PDAC 치료에 효과적일 수 있다는 유망한 전략이 제시되었지만, 이러한 표적 치료제에 대한 지속적인 반응은 여전히 소수의 환자로 제한되어 있다11,12. 전반적으로, PDAC 특이적 초기 바이오마커의 발견은 조기 진단 및 치료를 위한 새로운 길을 열 수 있습니다.
PDAC는 비침습적 췌관 상피 증식(non-invasive pancreatic tulatial epithelial proliferations)으로 인한 췌장 상피내 신생물(panIN) 전구체 병변에서 발생한다13,14. PanIN의 형성은 KRAS와 같은 종양유전자 돌연변이에 의해 시작되지만, PDAC로 진행되기 위해서는 추가적인 유전적 및 후성유전학적 변형이 필요합니다. PanIN이 여러 단계를 거쳐 침습적 PDAC로 진행되는 데는 약 10년이 걸릴 것으로 예상됩니다 13,15,16,17. 이 기간은 조기 PDAC 진단의 이점을 누릴 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 따라서 PDAC 진행을 연구하기 위해 종양 이종이식 동물 모델 및 오가노이드 배양을 확립하기 위한 광범위한 연구가 수행되었습니다 18,19,20,21. 이러한 모델은 PDAC의 침습 단계를 연구하는 데 매우 유용하지만 초기 PanIN 단계로부터의 전환은 아닙니다. 따라서 조기 검출 바이오마커를 발견할 수 있도록 PanIN 단계의 초기 진행을 재현할 수 있는 실험 모델을 개발하는 것이 중요합니다.
4개의 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC(OSKM)를 사용하여 체세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 것은 세포 가소성의 정도를 보여줍니다22. 암세포 가소성은 잘 문서화되어 있으며, 인간 암세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 것은 세포를 원래의 세포 상태로 재설정하는 데 성공적으로 사용되어 암 진행 중에 축적된 많은 후성유전학적 모욕을 제거했습니다 23,24,25,26,27,28,29. 따라서 암세포 정체성을 조작하기 위해 이 재프로그래밍 전략을 사용할 수 있는 가능성은 암 치료에 큰 가능성을 제시했다30,31. 실제로, PDAC에서 유래한 iPSC의 분화가 초기 PanIN 단계(32)를 통해 PDAC 진행을 재현할 수 있음을 이전에 보여주었습니다. PDAC의 초기에서 중간 단계에 특이적인 유전자 및 경로를 식별함으로써 조기 PDAC 진단에 임상적으로 사용할 수 있는 후보 바이오마커를 식별했습니다32,33. 그러나, 단일 iPSC 라인을 사용하여 발견된 바이오마커는 PDAC 환자의 대다수에서 제한된 커버리지를 보였다32. 다른 PDAC 환자로부터 iPSC 세포주를 생성하는 데 따르는 어려움으로 인해 보다 신뢰할 수 있는 바이오마커를 발견하는 능력이 중단되었습니다. 이는 OSKM 전달의 이질성을 포함한 많은 기술적 요인 때문인데, 인간 1차 PDAC 세포의 극히 일부만이 4가지 요인을 모두 포함하고 재프로그래밍에 성공적으로 반응했기 때문입니다. 여기에서는 OSKM의 보다 효율적이고 일관된 이중 렌티바이러스 전달을 사용하여 1차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올 (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 반인간 TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물 (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Vibrio cholerae에서 콜레라 독소</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐, 쥐 꼬리 Merck의 타입 I 용액</td><td>;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Defined K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td> 완성<td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple Well Plates</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Corning 주사기 필터</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLS431231 코닝 조직 배양 처리 배양 접시</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>데이 임펙스&nbsp; Virkon 소독제 바이러스 정제</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>송아지 태아 혈청 (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD 트랜스펙션 시약&nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 용액, 타입 B, H2O</td><td>Merck에</td> 2%;<td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>글래스고 최소 필수 매체 (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>인간 EGF 재조합 단백질</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>인간 FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) 재조합 단백질, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>인간 췌장 덕트 상피 세포주 (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF 피더 세포&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>각질세포 무혈청 미디어(KSFM)&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 세럼 교체&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu; M 주사기 필터 유닛 (멸균)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM 리듀스 세럼 미디엄&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)&nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>일회용 멸균 주사기 (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

전사 인자를 사용한 유도만능줄기세포(iPSC)의 생성은 거의 모든 분화된 세포 유형에서 이루어졌으며 연구 및 임상 응용 분야에서 매우 가치 있는 것으로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 암세포의 iPSC 재프로그래밍은 침습성 PDAC 표현형을 되돌리고 암 후성유전체를 무시하는 것으로 나타났습니다. PDAC 유래 iPSC의 분화는 초기 췌장 상피내 종양(PanIN) 전구체에서 PDAC 진행을 재현하여 PDAC 진행 초기에 발생하는 분자 및 세포 변화를 밝힐 수 있습니다. 따라서 PDAC에서 파생된 iPSC는 조기 검출 진단 마커를 발견하기 위해 PDAC의 초기 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 초기 PanIN 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문에 일반적으로 후기 전이성 단계에서 진단되는 PDAC 환자에게 특히 중요합니다. 그러나 PDAC를 포함한 암 세포주를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 여전히 어렵고 노동 집약적이며 서로 다른 세포 주 간에 매우 가변적입니다. 여기서는 bicistronic 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 인간 PDAC 세포주에서 iPSC를 생성하기 위한 보다 일관된 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과 iPSC 라인은 안정적이며, 재프로그래밍 인자 또는 유도성 약물의 외인성 발현에 의존하지 않습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 광범위한 PDAC 유래 iPSC의 생성을 용이하게 하며, 이는 PDAC 사례를 보다 구체적이고 대표하는 초기 바이오마커를 발견하는 데 필수적입니다.

PDAC, BXPc3, H6C7 및 hFib 세포에서 유래한 iPSC 콜로니의 형태를 보여주는 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. PDAC-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 25일째에 형성되기 시작했다. 보다 확립된 ESC 유사 형태를 가진 견고한 iPSC 콜로니는 재프로그래밍 40일째에 확인되었습니다(그림 1). 마찬가지로, BxPc3-iPSC의 형성은 23일째에 시작되어 35일째에 더 확립되었습니다. H6C7-iPSC 형성은 PDAC-iPSC와 유사했으며 45일째에 확립되기 시작했습니다. hFib-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 15일째에 형성되기 시작했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> 그림 1: iPSC 콜로니의 대표 이미지. 이미지는 (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 및 (D) hFib에서 파생된 확립된 hESC 유사 형태를 보여줍니다. 재프로그래밍 날짜는 각 이미지 위에 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
클론 iPSC 라인은 PDAC, BxPc3, H6C7 및 hFib 세포의 각 재프로그래밍으로부터 확립되었습니다. 확립된 모든 iPSC 라인은 미분화 hESC 세포 표면 마커인 TRA-1-60에 대해 양성으로 염색되어 다능성으로의 재프로그래밍을 확인했습니다(그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> 그림 2: 클론 iPSC 라인의 대표 이미지. 이미지는 (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 및 (D) hFib에서 파생되어 ESC 유사 형태(상단 패널) 및 TRA-1-60(하단 패널)에 대한 양성 염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 췌관 선암종(PDAC)과 정상 췌관 상피세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 당사는 렌티바이러스 준비부터 안정적인 iPSC 라인 구축에 이르기까지 최적화되고 상세한 단계별 절차를 제공합니다.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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Research

연구

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췌장암 줄기세포(CSC)는 CSC 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구이며 새로운 CSC 표적 치료법을 개발하기 위한 첫 번째 단계 역할을 할 수 있는 앵커리지 독립 구 배양 기술을 사용하여 체외에서 확장할 수 있습니다. 여기에서는 췌장 CSC의 확장, 분석 및 표적화를 위한 방법론이 제공됩니다.

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여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

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효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

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효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

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췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍

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