Name: 세포외 소포 조직 인자 활성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: 배우세요 인간 혈장에서 세포외 소포 조직 인자 활성을 측정하는 기능 기반 분석법을. 이 방법은 기존 항원 기반 검사보다 높은 민감도와 특이성을 제공하여 질병 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH NHLBI R35HL155657(N.M.)과 John C. Parker 교수직(N.M.)의 지원을 받았습니다. 도움이 되는 의견을 주신 Ms. Sierra J. Archibald에게 감사드립니다

이 연구는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐(University of North Carolina at Chapel Hill)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호: 14-2108).
1. 헌혈자의 혈액 채취
<ol><li>깨끗한 정맥 천자를 사용하여 21G 바늘로 전방 정맥에 전혈을 채취합니다. 혈액의 처음 3mL는 혈관 주위 세포의 TF를 포함할 수 있으므로 폐기하십시오.</li>
	<li>2.7 또는 1.8mL(튜브 크기에 따라 다름)의 혈액을 3.2% 구연산나트륨(0.109mol/L)이 포함된 바큐테이너에 넣습니다. 튜브를 과도하게 채우거나 부족하게 채우지 마십시오. 채혈 직후 튜브를 부드럽게 뒤집어 시트르산나트륨을 분산시킵니다.</li>
	<li>가공 전에 튜브를 운반하는 경우 교반을 피하십시오. 채혈 후 2시간 이내에 혈장을 준비합니다.</li>
</ol>2. 네거티브 대조군 혈장의 제조
알림: samples는 최종 동결 전에 얼음 위에 놓아서는 안 됩니다.
<ol><li>건강한 지원자의 전혈을 사용하여 음성 대조 혈장을 준비합니다. 채혈 직후 다음과 같이 무혈소판 혈장을 준비합니다.<ol><li>혈액 샘플을 vacutainer 튜브에서 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>브레이크 없이 실온(20-24°C)에서 15분 동안 2,500× g 에서 혈액 샘플을 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액(혈소판 부족 혈장)을 새 튜브로 옮기고 동일한 조건에서 스핀을 반복합니다.</li>
		<li>상층액(혈소판 고갈 혈장)을 새 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>샘플을 ≥100 μL 부분 표본으로 분취합니다. 튜브 바닥에 약 100μL를 남겨 둡니다.</li>
		<li>혈소판이 고갈된 혈장을 -80°C에서 즉시 동결합니다(그림 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 양성 대조 혈장의 제조
참고: 지질다당류에 대한 반응은 개인마다 다릅니다.
<ol><li>혈액 샘플을 vacutainer에서 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>대장균 O111:B4(10μg/mL)의 지질다당류(LPS)로 자극된 건강한 지원자의 전혈을 사용하여 37°C에서 5시간 동안 교반하면서 양성 대조 혈장을 준비합니다.</li>
	<li>5시간 배양 후 2.1.2에서 2.1.6 단계를 따르십시오.</li>
</ol>4. 혈장에서 세포외 소포체의 분리
알림: EV 펠릿이 보이지 않을 수 있습니다. 해동 시간은 시료량에 따라 다르지만 일반적으로 37°C에서 30분 동안 100μL 혈장을 해동합니다.
<ol><li>혈장 시료를 37°C에서 해동합니다.</li>
	<li>1.5mL 튜브에 있는 각 100μL의 혈장 샘플에 칼슘[HBSA-Ca(-)] 완충액[137mM NaCl, 5.38mM KCl, 5.55mM 포도당, 10mM HEPES, 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민]이 없는 HBSA 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>플라즈마 시료를 20,000 × g 에서 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>EV 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20μL까지 흡입합니다.</li>
	<li>각 튜브에 HBSA-Ca(-) 완충액 1mL를 첨가하여 EV 펠릿을 재구성하고, EV 펠릿 위치에서 피펫팅을 위아래로 하고, 각 튜브를 소용돌이친 후 4°C에서 15분 동안 20,000× g 에서 두 번째로 원심분리합니다.</li>
	<li>EV 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20μL까지 흡입합니다.</li>
	<li>80μL의 HBSA-Ca(-)에서 EV 펠릿을 재구성하고 EV 펠릿 위치에서 위아래로 피펫팅합니다(그림 2).</li>
</ol>5. 선택권: ultracentrifuge를 사용하여 작은 extracellular 소포의 고립
<ol><li>4.3단계 후 상층액과 초원심분리기를 100,000× g 에서 4°C에서 70분 동안 수집합니다.</li>
	<li>EV 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20μL까지 흡입합니다.</li>
	<li>각 튜브에 1mL의 HBSA-Ca(-) 완충액을 첨가하여 EV 펠릿을 재구성하고 각 튜브를 소용돌이친 후 4°C에서 70분 동안 100,000× g 에서 두 번째로 초원심분리합니다.</li>
	<li>EV 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 20μL까지 흡입합니다.</li>
	<li>EV 펠릿을 80μL의 HBSA-Ca(-)로 재구성합니다.</li>
</ol>6. 세포외 소포체 조직 인자 활성 측정
알림: EV 샘플은 웰에 추가하기 전에 잘 피펫팅하고 볼텍싱하여 혼합해야 합니다. EDTA-디소듐은 FXa가 발색 기질을 절단하는 능력을 억제합니다. 따라서 EDTA-디소듐은 6.7단계에서 EDTA-테트라소듐의 대체품으로 사용할 수 없습니다.
<ol><li>40μL의 EV 샘플을 96웰 플레이트의 웰 2개에 추가합니다.</li>
	<li>11μL의 억제성 마우스 항인간 TF IgG[(36.4μg/mL, 최종 농도 7.8μg/mL)]를 EV 샘플의 한 웰에 추가하고 11μL의 대조군 마우스 IgG[(36.4μg/mL, 최종 농도 7.8μg/mL)]를 다른 웰에 추가합니다.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 96웰 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>배양 시간 동안 50μL/웰의 TF 표준물질(0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20pg/mL)을 relipidated recombinant TF를 사용하여 중복으로 준비합니다.</li>
	<li>4mL의 HBSA를 칼슘[HBSA-Ca(+)][HBSA-Ca(-) + 10mMCaCl2, 최종 농도 10mM], HBSA-Ca(+)의 900nM FX 800μL(최종 농도: 146.4nM), HBSA-CA(+)의 200nM FVIIa 120μL(최종 농도: 4.8nM)와 혼합하여 인자 혼합물을 준비합니다.</li>
	<li>각 웰에 50μL의 인자 혼합 용액을 추가하고 플레이트를 필름으로 덮은 다음 37°C의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>2시간 후 HBSA 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 완충액 25μL[HBSA-Ca(-) + 25mM EDTA-테트라소듐, 최종 농도 5mM]을 첨가하여 FXa 생성을 중지하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>FXa에 의해 절단된 발색 기질을 4mM으로 재구성합니다(25mg 바이알에 증류수 8.7mL 추가).</li>
	<li>각 웰에 25μL의 발색 기질 용액을 추가하고 플레이트를 필름으로 덮은 다음 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>15분 배양 후 바늘로 기포를 제거하거나 1,500× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>판독하기 전에 한 번 혼합된 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 플레이트를 판독합니다.</li>
	<li>relipidated recombinant TF를 사용하여 생성된 표준 곡선을 사용하여 각 웰의 FXa 생성을 TF 활성으로 변환합니다.</li>
	<li>방정식 (1)을 사용하여 TF 종속 FXa 생성(EVTF 활성)을 계산합니다. TF 종속 FXa 생성(EVTF 활성[pg/mL]) = 총 FXa 생성(제어 IgG 웰) - TF 독립적 FXa 생성(항 TF IgG 웰)(그림 3)(1)</li>
</ol>

세포외 소포체(Extracellular Vesicles)의 조직 인자 활성 분석(Tissue Factor Activity Assay)에 대한 감도 향상

<ol><li>Grover, S. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor%3A+an+essential+mediator+of+hemostasis+and+trigger+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).</li>
<li>Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+phospholipid+environment+modulates+the+activation+of+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).</li>
<li>Tavoosi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+phospholipid+synergy+in+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).</li>
<li>Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+encrypts+tissue+factor%3A+ATP-induced+activation+of+A-SMase+leads+to+tissue+factor+decryption+and+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding.</a> Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).</li>
<li>Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+sphingomyelinase+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory sphingomyelinase in health and disease.</a> Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).</li>
<li>Versteeg, H. H., Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+coagulant+function+is+enhanced+by+protein-disulfide+isomerase+independent+of+oxidoreductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).</li>
<li>Reinhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+acts+as+an+injury+response+signal+that+enhances+fibrin+generation+via+tissue+factor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).</li>
<li>Langer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+monocyte+tissue+factor+by+antithymocyte+globulin+is+dependent+on+complement+and+protein+disulfide+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase.</a> Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).</li>
<li>Bogdanov, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor%3A+a+circulating%2C+soluble%2C+thrombogenic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein.</a> Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).</li>
<li>Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+tissue+factor+-+one+cut+too+many%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced tissue factor - one cut too many.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).</li>
<li>Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor+%28asHTF%29+is+not+pro-coagulant%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Osterud, B., Bjorklid, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+in+blood+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Elite+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Tissue factor in blood cells and endothelial cells.</a> Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-derived+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles%3A+biomarkers+of+thrombosis+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival.</a> Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).</li>
<li>Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxy-2-nonenal+enhances+tissue+factor+activity+in+human+monocytic+cells+via+p38+mitogen-activated+protein+kinase+activation-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).</li>
<li>Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles+in+plasma%3A+strengths+and+weaknesses+of+current+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods.</a> Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).</li>
<li>Lee, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+variables+affecting+the+measurement+of+plasma-derived+microparticle+tissue+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity.</a> Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Claussen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicle-associated+tissue+factor+procoagulant+activity+for+the+preoperative+diagnosis+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer.</a> Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).</li>
<li>Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+and+its+procoagulant+activity+on+cancer-associated+thromboembolism+in+pancreatic+cancer%3A+Comment+by+Mackman+et+al%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al.</a> Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+four+commercial+ELISAs+to+measure+tissue+factor+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133(2023).</li>
<li>Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+bead-based+assay+to+measure+levels+of+human+tissue+factor+antigen+in+extracellular+vesicles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677(2022).</li>
<li>Tatsumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+commercial+assay+to+measure+microparticle+tissue+factor+activity+in+plasma%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).</li>
<li>Hisada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+microparticle+tissue+factor+activity+in+clinical+samples%3A+A+summary+of+two+tissue+factor-dependent+FXa+generation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays.</a> Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).</li>
<li>Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+severe+orthohantavirus+cardiopulmonary+syndrome+due+to+Sin+Nombre+Virus+infection+have+increased+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+and+an+activated+coagulation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system.</a> Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).</li>
<li>Schmedes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Extracellular+Vesicle+Tissue+Factor+Activity+During+Orthohantavirus+Infection+Is+Associated+With+Intravascular+Coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).</li>
<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-Brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+coagulopathies+associated+with+COVID-19+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525(2021).</li>
<li>Guervilly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+extreme+levels+of+extracellular+vesicles%3A+tissue+factor+activity+in+patients+with+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19.</a> Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor+activity+in+extracellular+vesicles+from+human+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+of+small+and+large+extracellular+vesicles+in+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124(2023).</li>
<li>Bom, V. J., Bertina, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+Ca2%2B%2C+phospholipids+and+tissue-factor+apoprotein+to+the+activation+of+human+blood-coagulation+factor+X+by+activated+factor+VII%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII.</a> Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+is+increased+in+a+combined+platelet+and+microparticle+sample+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+journey%3A+from+biogenesis+to+uptake+and+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47(2021).</li>
<li>Garnier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induced+to+express+mesenchymal+phenotype+release+exosome-like+extracellular+vesicles+carrying+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).</li>
<li>Park, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor-bearing+exosome+secretion+from+human+mechanically+stimulated+bronchial+epithelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).</li>
</ol>

공개할 상충되는 이해관계가 없습니다.

여기에서는 자체 EVTF 활성 분석의 프로토콜이 제시됩니다. 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. EV 펠릿을 재구성할 때, EV 펠릿이 보이지 않더라도 EV 펠릿의 위치에서 위아래로 피펫팅하는 것이 중요합니다. EV 펠릿의 불완전한 재구성은 샘플의 EVTF 활성 값의 위음성 또는 과소 평가를 초래합니다. 둘째, 칼슘 없이는 FXa 생성이 불가능하기 때문에 프로토콜 단계 6.5에서 HBSA-Ca(+)를 사용하는 것이 중요합니다. 셋째, EDTA-테트라소듐을 사용하지만 EDTA-디소듐을 사용하지 않고 FXa 생성을 막는 것은 FXa가 발색 기질을 절단하는 능력을 억제하기 때문에 매우 중요합니다.
각 시약에 대해 다음과 같은 보관 및 사용 방법을 권장합니다. 분석 완충액과 재구성 된 기질을 4 °C에 보관하고 다 떨어질 때까지 반복적으로 사용합니다. 2-3주 이내에 기판이 떨어지지 않으면 노랗게 변하기 때문에 버립니다. 재조합 TF, 항체, FVIIa 및 FX는 -80°C에...

혈액 응고는 인자 (F) VII/VIIa와 조직 인자(TF)1의 결합으로 시작됩니다. TF/FVIIa 복합체는 FIX와 FX를 모두 활성화하여 혈액 응고를 활성화한다1. 전체 길이, 멤브레인 결합 TF에는 암호화와 활성의 두 가지 형태가 있습니다. 또한, 대안적으로 접합된 형태의 TF(asTF)가 있습니다. 세포막의 바깥쪽 엽단에 있는 스핑고미엘린과 포스파티딜콜린은 TF를 암호화된 상태로 유지합니다 2,3,4. 세포가 활성화되거나 손상되면 인지질 스크램블라제는 포스파티딜세린 및 기타 음전하를 띤 인지질을 바깥쪽 전단으로 전달합니다1. 세포의 활성화는 또한 산성 스핑고미엘라아제를 외부 전단지로 전위시켜 스핑고미엘린을 세라마이드로 분해합니다5. 이 두 메커니즘은 암호화된 TF를 활성 형식으로 변환합니다. 또한 단백질 이황화 이소머라제가 암호화된 TF에서 Cys186과 Cys209 사이의 이황화 결합 형성을 매개하여 TF 6,7,8의 해독을 초래하는 것으로 제안되었습니다. asTF는 순환에도 존재하지만 막관통 도메인이 부족하므로 용해성 9,10입니다. 중요한 것은 asTF가 전장 활성 TF10,11에 비해 매우 낮은 수준의 응고제 활성을 가지고 있다는 것입니다.
세포외 소포체(EV)는 암세포뿐만 아니라 휴지기, 활성화 및 죽어가는 숙주 세포에서 방출된다12. EV는 부모 세포에서 단백질을 발현한다12. 활성 TF 함유 EV는 활성화된 단핵구, 내피 세포 및 종양 세포로부터 순환 13,14,15로 방출된다. 혈장 내 TF 수치는 활성 및 항원 기반 분석으로 측정할 수 있습니다. 항원 기반 분석에는 ELISA 및 유세포 분석이 포함됩니다16. 활동 기반 분석에는 1단계 및 2단계 TF 활동 분석의 두 가지가 있습니다. 1단계 분석은 혈장 기반 응고 분석을 기반으로 합니다. TF 함유 샘플을 혈장에 첨가하고 재석회화 후 응고를 형성하는 시간을 측정합니다. 2단계 분석은 FVII 또는 FVIIa, FX 및 칼슘을 추가하여 샘플의 FXa 생성을 측정합니다. FXa 레벨은 FXa에 의해 절단된 기판을 사용하여 결정됩니다.
1단계 및 2단계 TF 활성 분석 모두에서 TF 농도는 재조합 TF로 생성된 표준 곡선을 사용하여 측정됩니다. 2단계 분석은 1단계 분석보다 민감도와 특이도가 높습니다. 많은 연구에서 활성 기반 분석이 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높다는 것을 확인했습니다 17,18,19,20,21. 또한, 당사의 자체 활성 분석은 상용 활성 분석보다 더 높은 민감도와 특이성을 가지고있습니다 22. 건강한 사람은 혈장에서 EVTF 활성이 매우 낮거나 검출할 수 없는 수준입니다. 대조적으로, 암, 간경변, 패혈증 및 바이러스 감염과 같은 병리학적 상태가 있는 개인은 EVTF 활성이 검출 가능한 수준이며 이는 혈전증, 파종성 혈관 내 응고, 질병 중증도 및 사망률과 관련이 있습니다 23,24,25,26,27,28. 여기에서는 이 사내 2단계 EVTF 활성 분석에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>20,000 x g 원심분리기용 1.5mL 튜브</td><td>모든 회사</td><td>N/A</td><td>Fisher Scientific(카탈로그 번호: 05-408-129)의 튜브를 사용합니다.</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브, 초원심분리기,</td><td>모든 회사</td>, <td>N/A</td>, <td>우리는 Beckman Coulter의 것을 사용합니다 (카탈로그 번호: 357448)</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>, 모든 회사</td>, <td>N/A</td><td>우리는 VWR (카탈로그 번호: 89039-666)의 것을 사용합니다</td></tr><tr><td>. BD Vacutainer Safety-Lok 혈액 수집 세트 12 인치. 튜빙 및 루어 어댑터</td><td>BD</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>모든 회사</td><td>N / A</td><td>우리는 Globe Scientific (카탈로그 번호 : 120338)의 것을 사용합니다.</td></tr><tr><td>BD Vacutainer 구연산염 튜브</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브 용 원심 분리기</td><td>모든 회사</td><td>N / A</td><td>우리는 Centrifuge 5417R (Eppendorf)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>15 mL 튜브용 원심분리기</td><td>모든 회사</td><td>N/A</td><td>Centrifuge 5810R (Eppendorf)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 이수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Human FVIIa</td><td>효소 연구소</td><td>HFVIIa</td><td>용액은 HBSA-Ca(+)로 희석해야 합니다.</td></tr><tr><td>Human FX</td><td>Enzyme Research Laboratory</td><td>HFX1010</td><td>용액은 HBSA-Ca(+)로 희석해야 합니다.</td></tr><tr><td>억제성 마우스 항-인간 조직 인자 IgG, 클론 HTF-1</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>550252</td><td></td></tr><tr><td>대장균 O111:B4</td><td>시그마 알드리치</td><td>L2630</td><td>다양한 E. coli.</em에서 여러 리포다당류가 있습니다> 리포다당류마다 단핵구를 활성화할 수 있는 잠재력이 다릅니다.</td></tr><tr><td>마우스 IgG</td><td>시그마 알드리치</td><td>I5381</td><td></td></tr><tr><td>페파크롬 FXa 8595</td><td>효소 연구소</td><td>085-27</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>어떤 회사 없음</td><td></td> 우리는 Molecular Devices Re-lipidated 재조합 조직 인자, Dade Innovin Siemens <td>10873566</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride의</td> SpectraMax i3x를 사용합니다.<td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima TLX</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>TLA-55</td><td></td></tr></tbody></table>

세포외 소포 조직 인자 활성 분석

Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay

조직 인자(TF)는 인자 (F) VII 및 FVIIa에 대한 막관통 수용체입니다. TF/FVIIa 복합체는 FIX와 FX를 모두 활성화하여 응고 캐스케이드를 시작합니다. TF는 세포외 소포체(EV)의 형태로 세포에서 순환계로 방출됩니다. TF 양성(+) EV의 수준은 암, 박테리아 및 바이러스 감염, 간경변을 포함한 다양한 질병에서 증가하며 혈전증, 파종성 혈관 내 응고, 질병 중증도 및 사망률과 관련이 있습니다. 혈장에서 TF+ EV를 측정하는 방법에는 항원 기반 분석과 활성 기반 분석의 두 가지가 있습니다. 데이터에 따르면 활성 기반 분석은 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높습니다. 이 백서는 2단계 FXa 생성 분석을 기반으로 하는 당사의 사내 EVTF 활성 분석에 대해 설명합니다. FVIIa, FX 및 칼슘을 TF+ EV 함유 샘플에 첨가하여 항 TF 항체의 존재 유무에 따라 FXa를 생성하여 TF 의존성 FXa 생성과 TF 독립적 FXa 생성을 구별합니다. FXa에 의해 절단된 발색 기질은 FXa 수준을 결정하는 데 사용되며, TF 농도를 측정하기 위해 relipidated recombinant TF로 생성된 표준 곡선이 사용됩니다. 이 자체 EVTF 활성 분석은 상용 TF 활성 분석보다 민감도와 특이도가 높습니다.

성공적인 결과는 ≥0.5pg/mL의 양성 대조군과 &lt;0.5pg/mL의 음성 대조군을 제공합니다. 양성 대조군을 위해 &gt;1.0pg/mL EVTF 활성을 가진 높은 LPS 반응기를 찾는 것이 가장 좋습니다. 대표적인 결과는 LPS 활성화 유무에 관계없이 건강한 기증자 11명의 전혈에서 혈장에서 분리한 EV의 EVTF 활성을 보여줍니다(그림 4). 11명의 기증자 중 6명(기증자 2, 4, 5, 8, 10, 11명)은 중등도에서 높은 LPS 반응자였고, 11명의 기증자 중 5명(기증자 1, 3, 6, 7, 9)은 낮은 LPS 반응자였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65840/65840fig01.jpg"> 그림 1</strong...

여기서는 사내 세포외 소포체 조직 인자 활성 분석에 대해 설명합니다. 활성 기반 분석 및 항원 기반 분석은 인간 혈장 샘플에서 세포외 소포체의 조직 인자를 측정하는 데 사용되었습니다. 활성 기반 분석은 항원 기반 분석보다 민감도와 특이도가 더 높습니다.

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX ...

낮은 수준의 조직 인자 양성 세포외 소포체는 다양한 질병을 가진 환자의 혈장에 존재합니다. 그러나 ELISA 및 유세포 분석을 포함한 대부분의 항원 기반 분석은 이러한 낮은 수준을 검출할 수 있는 감도가 없습니다. 수많은 논문에서 혈장에서 조직 인자를 검출하기 위해 ELISA 또는 유세포 분석을 사용했습니다.당사의 프로토콜은 높은 감도와 특이성으로 혈장에서 조직 인자 활성을 측정하지만, 기능적 분석의 사용으로 인해 약간의 변동이 있습니다. 혈장에서 조직 인자 활성 수준을 측정하는 상용 분석 키트가 있습니다. 그러나 이러한 키트에는 항조직 인자 항체가 포함되어 있지 않으므로 조직 인자 의존적 및 조직 인자 독립적 Factor X 생성을 구별할 수 없습니다.

extracellular-vesicle-tissue-factor-activity-assay

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.

EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정

이 글은 전혈 유동 세포분석을 이용해 조직인자(TF) 양성 혈소판의 비율을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질을 평가하여: (1) 휴식 상태에서 세포 내 분포, (2) 휴식 상태와 활성화 상태 모두에서 검사합니다. 또한 혈소판 풍부 혈장 내 TF 양성 혈소판 평가에 대한 지침도 제공됩니다.

인간 혈소판에서 조직 인자 발현의 유동세포분석(flow cytometry analysis)

자율 신경계 활동의 측정은 일반적으로 경계 아이들에게 위협적인 환경을 제공 할 수 있습니다 연구실에 연구원 및 참가자. VU 대학 외래 모니터링 시스템 (VU-AMS)의 장치는 설정에서 심장 자율 제어를 기록 할 수 있습니다. VU-AMS는 어린이 테스트에 매우 순종 입증했다.

아이들의 측정 심장 자율 신경계 (ANS) 활동

세포 및 분자 neotissue 형성에 대한 우리의 지식을 개선하기 위해, TEVG의 쥐 모델은 최근에 개발되었다. 이식은 C57BL / 6 마​​우스의 신동맥 대정맥 개재 이식으로 이식되었다. 이 모델은 우리의 임상 연구에서 달성 된 것과 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 훨씬 단축 된 시간 과정을 통해.

마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

조직 공학 심장 판막에 neotissue 형성 및 협착증 개발을 기초 세포 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 이소성 심장 판막 이식 뮤린 모델이 개발되었다. 폐동맥 판막은 이소성 심장 이식 기술을 사용하여 수신자에게 이식 하였다.

이소성 심장 이식 마우스 모델을 사용하여 폐동맥 판막 이식

배우세요 인간 혈장에서 세포외 소포 조직 인자 활성을 측정하는 기능 기반 분석법을. 이 방법은 기존 항원 기반 검사보다 높은 민감도와 특이성을 제공하여 질병 연구에 활용됩니다.

세포외 소포 조직 인자 활성 분석

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