Name: 신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 학습하세요 인간 유도만능줄기세포로 구축한 3D 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 통해 알츠하이머병의 분자 메커니즘과 APOE4 유전자의 영향을 연구하는 방법을. 이 모델은 맞춤형 치료 및 진단 접근법을 위한 새로운 가능성을 제공합니다.

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이 연구는 NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation 및 Brain Injury Association of America의 지원을 받습니다. C.G.는 NIH F31NS130909의 지원을 받습니다. 그림 1A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

1. iPSC를 iBBB 세포로 분화
참고: 이러한 차별화 프로토콜은 이전에 Mesentier-Louro et al.34에서 설명되었습니다.
<ol><li>코팅 세포 배양 플레이트<ol><li>감소된 성장 인자(GF) 막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. 500μL의 기저막 매트릭스를 49.5mL의 DMEM에 희석합니다. 코팅 용액의 조기 중합을 방지하기 위해 이 용액을 차갑게 유지하십시오.</li>
		<li>6웰 조직 배양 처리 플레이트의 웰당 1-2mL를 추가합니다. 코팅 용액을 37°C에서 최소 20분 동안 그대로 두었다가 적절한 가열된 배양 배지로 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>인간 iPSC를 ETV2 유도 내피 세포로 분화 타이밍 : 8 일 참고: 이 프로토콜은 Blanchard et al.24 및 Qian et al.35에서 채택되었습니다. 수율을 개선하기 위해 Wang et al.36 에 의해 설명된 전사 인자 ETV2의 독시사이클린 유도 발현을 사용합니다. ETV2는 PiggyBac 플라스미드를 통해 도입된 후 세포를 transfection했습니다.<ol><li>세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 feeder-free 만능 줄기 세포 배지에서 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다. 참고: 유도성 iPSC는 PiggyBac 플라스미드(즉, puromycin)를 선택하여 유지할 것을 권장합니다.</li>
		<li>0일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 20,800 cells/cm2 로 세포를 도장합니다.</li>
		<li>1일차: 배지를 DeSR1[DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 최소 필수 배지 비필수 아미노산(MEM-NEAA) 1개, 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 1%)]로 대체하고 BMP4 10ng/mL, CHIR99021 6μM 및 독시사이클린 5μg/mL를 보충합니다.</li>
		<li>3일차: 배지를 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 DeSR2[DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S]로 대체합니다.</li>
		<li>5일차: 배지를 50ng/mL VEGF-A, 2μM 포스콜린 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR[Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S]으로 대체합니다.</li>
		<li>7일차: 배지를 50ng/mL VEGF-A, 2μM 포스콜린 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR로 대체합니다.</li>
		<li>8일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 EC를 1:3으로 분할하고 50ng/mL VEGF-A 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 다시 파종합니다. 알림: 이것은 균일한 혈관 형성을 위해 EC를 iBBB로 캡슐화하는 가장 좋은 시점입니다.</li>
		<li>10일차+: 2-3일마다 50ng/mL VEGF-A 및 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR을 세포에 공급합니다. 플레이트가 합류할 때 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 1:3으로 계속 분할합니다. 참고: iPSC에서 파생된 EC는 8일부터 언제든지 동결될 수 있습니다. 통과하듯이 세포를 들어 올립니다. 펠릿을 EC 동결 배지[60% 녹아웃 혈청 치환(KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50ng/mL VEGF-A 및 10μM Y27632]에 재현탁시키고 세포를 1:3으로 분할하고 -80°C에서 동결 용기를 사용하여 동결합니다. 50ng/mL VEGF-A, 5μg/mL 독시사이클린이 보충된 hECSR의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 해동합니다.</li>
		<li>CD31/PECAM1 또는 VE-cadherin에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학으로 뇌 미세혈관 내피 세포 분화를 확인합니다(그림 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>인간 iPSC를 주위세포(pericyte)로 분화 타이밍 : 6 일 참고: 이 프로토콜은 Patsch et al.36에서 채택되었습니다.<ol><li>줄기 세포 배지의 피더가 없는 조건에서 세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다.</li>
		<li>0일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 에서 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 37,000-40,000 cells/cm2 (세포주에 따라 다름)로 세포를 도장합니다.</li>
		<li>1일차: 배지를 25ng/mL BMP4 및 8uM CHIR99021가 보충된 N2B27[50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, 글루타민 보충제, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S]로 교체합니다.</li>
		<li>3-4일차: 배지를 2ng/mL Activin A 및 10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27로 교체하고 매일 급여합니다.</li>
		<li>5일차: 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 PC를 분할하고 10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27에서 35,000세포/cm2 의 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에 파종합니다. 알림: 한 번만 셀을 분할합니다. 일부 줄은 분할할 준비가 되기까지 며칠이 더 걸릴 수 있습니다. 세포가 합류할 때까지 매일 배지를 계속 교체하십시오.</li>
		<li>10ng/mL PDGF-BB가 보충된 N2B27에서 PC를 확장하고 2-3일마다 배지를 교체합니다. 세포가 다시 한 번 밀도에 도달하고 두 번째 통로를 거친 후 배지에서 PDGF-BB를 제거합니다. 참고: pericyte는 두 번째 통과 후 iBBB에서 사용할 준비가 되었습니다. PC가 확장되면 고정될 수 있습니다. 세포를 통과하는 것처럼 들어 올리고 세포 펠릿을 동결 매체[90% KSR 및 10% DMSO]에 재현탁시키고 -80°C의 냉동 용기를 사용하여 동결합니다. N2B27에서 35,000 cells/cm2 로 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트에서 해동합니다.</li>
		<li>PDGFRB 및 NG2에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학에 의한 주위 세포 분화를 확인합니다(그림 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>인간 iPSC를 신경 전구 세포(NPC) 및 성상세포로 분화 타이밍 : 총 45 일 (NPC의 경우 15 일, 성상 세포의 경우 30 일) 참고: NPC 분화 프로토콜은 Chambers et al.38에서 채택되었으며, 성상세포 분화는 TCW et al.39에 기술된 바와 같다.<ol><li>줄기 세포 배지의 피더가 없는 조건에서 세포가 ~70% 밀도에 도달할 때까지 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 iPSC를 배양합니다.</li>
		<li>프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 세포를 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 줄기 세포 배지에 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 3분 동안 300× g 에서 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 줄기 세포 배지로 재현탁시키고 10μM Y27632가 보충된 줄기 세포 배지의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 세포를 100,000 cells/cm2 로 도금합니다.</li>
		<li>다음날 줄기 세포 배지를 교체하십시오. 세포가 >95% 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 세포에 계속 공급합니다(세포주에 따라 3-4일).</li>
		<li>NPC 0일차: 배지를 10μM SB43152 및 100nM LDN193189가 보충된 N2B27[50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, 글루타민 보충제, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S]로 교체합니다.</li>
		<li>NPC 1-9일차: 10μM SB43152 및 100nM LDN193189가 보충된 N2B27을 매일 세포에 공급합니다.</li>
		<li>NPC 10일차: NPC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 1:3으로 분할하고 20ng/mL FGF-basic 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 종자합니다.</li>
		<li>NPC 11일차 - 13일차: 매일 NPC에게 20ng/mL FGF-basic이 보충된 N2B27을 먹이십시오.</li>
		<li>NPC 14일차: NPC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물로 1:3으로 분할하고 20ng/mL FGF-basic 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 다시 파종합니다.</li>
		<li>NPC 15일차/성상세포 0일차: 이것은 성상세포 분화의 0일차입니다. 세포에 완전한 성상교세포 배지(AM)를 공급합니다. 참고: NPC는 N2B27에서 20ng/mL FGF-염기성으로 보충되고 합류할 때 통과할 수 있습니다. NPC를 얼리려면 세포 펠릿을 냉동 배지[90% KSR 및 10% DMSO]에 재현탁시키고 세포를 1:3으로 분할한 다음 -80°C의 냉동 용기를 사용하여 냉동합니다. 20ng/mL bFGF 및 10μM Y27632가 보충된 N2B27의 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에서 해동합니다.</li>
		<li>성상교세포 1-30일차: 2-3일마다 세포에 AM을 공급합니다. 세포가 >90% 합류하면 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 사용하여 15,000 cells/cm2 의 플레이트를 AM의 신선한 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 통과시킵니다. 참고: 성상교세포는 30일 이내에 완전히 분화되어야 합니다. 성상교세포는 -80°C의 냉동 용기에 있는 냉동 배지[90% KSR 및 10% DMSO]에서 냉동할 수 있습니다. 25,000-35,000 cells/cm의 AM에서 환원된 GF 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 해동합니다2.</li>
		<li>Nestin 및 SOX2에 대한 항체를 이용한 면역세포화학에 의한 NPC 분화를 확인합니다. S100B 및 CD44에 대한 항체를 사용하여 면역세포화학으로 성상세포 분화를 확인합니다(그림 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>2. iBBB 조립
<ol><li>감소된 성장 인자(GF) 기저막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. iBBB는 100% 환원된 GF 기저막 매트릭스에 캡슐화되어 있으므로 DMEM에서 이 매트릭스를 희석하지 마십시오. 각 iBBB에는 50μL의 매트릭스가 필요합니다.</li>
	<li>분화된 EC를 37°C에서 5분 동안 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 해리합니다. 해리된 세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 hECSR에 1:3 비율로 원뿔형 튜브로 옮깁니다(Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). 3분 동안 300× g 의 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 hECSR에 재현탁시킵니다. 참고: 15mL 또는 50mL의 원뿔형 튜브를 사용하며, 이 튜브는 해리된 세포와 배지의 부피를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 세포는 또한 여러 튜브로 분할된 다음 재현탁 시 재결합될 수 있습니다.</li>
	<li>분화된 PC를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 37°C에서 5분 동안 해리합니다. N2B27(50% DMEM/F12 + 글루타민 보충제, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x 글루타민 보충제, 1x N-2, 1x B-27, 1% 페니실린-스트렙토마이신[P/S])에 대한 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 해리된 세포를 전달합니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 셀을 회전시킵니다. 세포 펠릿을 N2B27에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>분화된 성상교세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물과 37°C에서 5분 동안 해리시킵니다. 해리된 세포를 프로테아제-콜라겐분해효소 혼합물을 1:3 비율로 원뿔형 튜브에 옮겨 성상교세포 배지(AM)를 완성합니다. 3분 동안 300× g 의 속도로 세포를 회전시킵니다. 세포 펠릿을 AM에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 각 세포 유형을 계산합니다. 각 유형의 세포 현탁액을 적절한 배지에서 1 × 106 cells/mL의 최종 농도로 희석합니다.</li>
	<li>원뿔형 튜브에서 각 세포 유형에 대해 계산된 세포 수를 결합합니다: 50μL의 iBBB에는 2.5 × 105 EC, 5 × 104 PC, 5 × 104 성상교세포가 필요합니다. 피펫팅 오류를 설명하기 위해 계산된 셀 수보다 10% 더 많은 셀 수를 포함합니다. 셀 혼합물을 300× g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 알림: 입력 셀의 품질 관리를 위해 고정 및 염색을 위해 2D 단일 배양에서 각 셀 유형의 일부 남은 셀을 도금하는 것이 좋습니다. 환원된 GF 기저막 매트릭스로 코팅된 이전에 준비된 플레이트에 각 세포 유형을 35,000 cells/cm2 로 도금하고 3-4일 후에 고정합니다. 세포 유형 특이적 항체에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>세포 펠릿에서 매질을 흡인하여 세포 펠릿 위에 약 50μL의 상층액을 남깁니다. P200을 사용하여 세포 펠릿을 잔류 매체에 부드럽게 재현탁하여 단일 세포 슬러리를 만듭니다.</li>
	<li>iBBB당 50μL의 환원된 GF 기저막 매트릭스에서 원하는 수의 iBBB에 대해 10ng/mL VEGF-A가 보충된 충분히 환원된 GF 기저막 매트릭스에 세포 슬러리를 혼합하고, 기포를 도입하지 않으면서 세포를 균질하게 혼합하도록 주의합니다. 알림: 이 단계에서 세포와 환원된 GF 기저막 매트릭스를 얼음 위에 유지하여 조기 중합을 방지하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>50μL의 환원된 GF 기저막 매트릭스 혼합물을 48웰 유리 바닥 배양 접시의 웰에 피펫팅합니다. 접시 바닥에 부피를 고르게 분산시킵니다(그림 1C).</li>
	<li>iBBB를 37°C에서 30-40분 동안 배양하여 환원된 GF 기저막 매트릭스가 중합되도록 하여 매트릭스에 세포를 캡슐화합니다.</li>
	<li>10ng/mL VEGF-A, 5μg/mL 독시사이클린, 10μM Y27632가 보충된 AM 500μL를 추가합니다.</li>
	<li>다음날 배지를 10ng/mL VEGF-A가 보충된 AM으로 변경하십시오. 2-3일마다 매체를 계속 교체하십시오. 2주 후, VEGF-A 보충을 중단하십시오. iBBB는 2주 후에 다운스트림 분석을 위한 준비가 됩니다.</li>
</ol>3. Aβ 피브릴을 이용한 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA) 유도
<ol><li>PBS에서 200μM에서 아밀로이드-β1-40 및 아밀로이드-β1-42 의 원액을 준비합니다.</li>
	<li>2주 iBBB에서 최종 농도 20nM까지 iBBB 배지에 Aβ를 첨가합니다. Aβ 보충 배지에서 96시간(4일) 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>96시간 후에 매체를 제거하고 고정을 계속합니다(섹션 4).</li>
</ol>4. iBBB 고정 및 염색
<ol><li>iBBB를 고정하려면 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세척한 다음 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드 500μL에서 배양합니다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드 용액을 제거하고 PBS 1mL에서 4 x (최소) 15분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>0.3% PBST(0.3% Triton X-100이 포함된 PBS)에서 샘플을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 투과시킵니다.</li>
	<li>차단 완충액(0.3% PBST에 5% 일반 혈청)에서 배양액을 실온에서 부드럽게 흔들면서 최소 1시간 동안 배양합니다. 참고: 사용되는 혈청의 유형은 사용된 2차 항체의 숙주 종에 따라 다릅니다. 예를 들어, 2차 항체의 숙주 종이 염소인 경우 일반 염소 혈청을 사용합니다. 숙주 종이 당나귀인 경우 일반 당나귀 혈청을 사용하십시오. 이것은 또한 4 °C에서 밤새 부드럽게 흔들어 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>1차 항체를 차단 완충액에서 권장 또는 결정된 농도로 희석합니다.</li>
	<li>차단 용액을 1차 항체 희석액으로 교체합니다. 균일한 배양을 위해 iBBB가 항체 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 100-150μL는 48웰 유리 바닥 배양 접시에서 50μL iBBB를 덮기에 충분합니다. 4 °C에서 부드럽게 흔들어 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>1차 항체를 제거합니다. 3% PBS에서 10 x 20-0.3분 동안 iBBB를 세척합니다.</li>
	<li>2차 항체를 차단 완충액에서 권장 또는 결정된 농도로 희석합니다. 또한 Hoechst와 같은 핵 염색을 권장 또는 결정된 농도의 2차 항체 용액에 추가합니다.</li>
	<li>마지막 PBS 세척을 2차 항체 희석액으로 교체합니다. 균일한 배양을 위해 iBBB가 항체 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 100-150μL는 48웰 유리 바닥 배양 접시에서 50μL iBBB를 덮기에 충분합니다. 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 알림: 이것은 또한 4 °C에서 밤새 부드럽게 흔들어 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>PBS에서 세탁당 최소 4시간 동안 iBBB를 5-1번 세탁하십시오. 샘플이 이미지화될 때까지 4°C의 PBS 또는 페이딩 방지 장착 매체에 보관합니다.</li>
	<li>도립 현미경으로 이미지를 촬영하려면 iBBB를 유리 바닥 접시나 접시에 보관하십시오. 유리 웰 위에 유리 커버슬립을 놓아 iBBB를 제자리에 고정합니다(그림 1D).</li>
</ol>

인간 만능 줄기세포에서 파생된 3D 혈액-뇌 장벽 모델

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<li>Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reviewing+the+significance+of+blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis+pathology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).</li>
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<li>Oddo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microfluidic+blood-brain+barrier+%28bbb%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models.</a> Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

BBB 기능 장애는 동반 질환이며, 잠재적으로 수많은 신경 질환의 원인 또는 악화 요인이 될 수 있다 7,40,41. 그러나 신경 혈관 질환이 있는 인간에서 BBB의 기능 장애 및 고장의 기저에 있는 분자 및 세포 생물학을 연구하는 것은 거의 불가능합니다. 이 프로토콜에 제시된 유도 BBB(iBBB)는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 국소화를 포함하여 BBB의 중요한 세포 상호 작용을 요약하는 시험관 내 시스템을 제공합니다. iBBB는 BBB 기능 장애의 모든 단계와 관련된 분자 경로를 연구하는 데 사용할 수 있으며 뇌 아밀로이드 혈관병증에서 볼 수 있듯이 아밀로이드 β 응집과 같은 신경 혈관 질환 표현형을 모델링할 수 있습니다.
iBBB의 조립은 간단하지만, iBBB의 품질은 사용되는...

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)를 말초에서 분리하여 적절한 신경 기능을 위한 이상적인 환경을 유지하는 핵심 미세혈관 네트워크입니다. 뇌는 대사 항상성 1,2,3,4를 유지하고, 노폐물 4,5,6을 제거하며, 병원균과 독소로부터 뇌를 보호함으로써 중추신경계로의 물질 유입과 유출을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 7,8.
BBB의 일차 세포 유형은 내피 세포(EC)입니다. 중배엽 계통에서 유래 한 내피 세포는 혈관 (vasculature) 1,9의 벽을 형성합니다. 미세혈관 EC는 서로 긴밀한 접합부를 형성하여 막의 투과성을 크게 감소시키는 동시에10,11,12,13,14 중추신경계 1,4,12,14 안팎으로 영양소의 이동을 촉진하는 수송체를 발현합니다. 미세혈관 EC는 미세혈관 기능과 항상성을 조절하는 주위 세포(PC)-벽화 세포로 둘러싸여 있으며 분자 및 면역 세포에 대한 BBB의 투과성을 조절하는 데 중요합니다 15,16,17. 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 성상교세포(astrocyte)는 BBB를 구성하는 최종 세포 유형입니다. 성상세포(astrocyte)의 말단은 EC-PC 혈관관을 감싸고 세포체는 뇌 실질(brain parenchyma)로 확장되어 뉴런과 혈관 1 사이의 연결을 형성합니다. 뚜렷한 용질 및 기질 수송체는 BBB 기능 18,19,20,21에서 중요한 역할을 하는 성상세포(astrocyte) 말단부(예를 들어, 아쿠아포린 4[AQP-4])에 국한된다.
BBB는 적절한 뇌 건강 기능을 유지하는 데 중요하며, BBB의 기능 장애는 알츠하이머병(AD)22,23,24,25, 다발성 경화증 7,26,27,28, 간질29,30 및 뇌졸중 31,32을 포함한 많은 신경 질환에서 보고되었습니다. 뇌혈관 이상이 신경 퇴행의 중심적인 역할을 하여 허혈성 및 출혈성 사건에 대한 감수성을 증가시키는 데 기여한다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병 환자의 90% 이상이 뇌혈관을 따라 아밀로이드 β(Aβ)이 침착되는 것을 특징으로 하는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 앓고 있습니다. CAA는 BBB 투과성을 증가시키고 BBB 기능을 감소시켜 중추신경계를 허혈, 출혈성 사건 및 가속화된 인지 기능 저하에 취약하게 만든다33.
우리는 최근 3D 매트릭스에 캡슐화된 EC, PC 및 성상세포를 통합하는 환자 유도 만능 줄기세포에서 파생된 인간 BBB의 시험관 내 모델을 개발했습니다(그림 1A). iBBB는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 위치 파악을 포함하여 생리학적으로 관련된 상호작용을 재현한다24. iBBB를 적용하여 APOE4에 의해 매개되는 CAA의 감수성을 모델링했습니다(그림 1B). 이를 통해 APOE4가 CAA를 촉진하는 인과적 세포 및 분자 메커니즘을 식별하고, 이러한 통찰력을 활용하여 APOE4 마우스24에서 CAA 병리를 줄이고 생체 내 학습 및 기억을 개선하는 치료 전략을 개발할 수 있었습니다. 여기에서는 인간 iPSC에서 BBB를 재구성하고 체외에서 CAA를 모델링하기 위한 자세한 프로토콜과 비디오 자습서를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>6e10 아밀로이드-&베타; 항체</td><td>Biolegend</td><td>SIG-39320</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>20-14E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 555, 647 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Amyloid-beta 40 fibril</td><td>AnaSpec</td><td>AS-24235 사용</td><td></td></tr><tr><td>아밀로이드-베타 42 피브릴</td><td>AnaSpec</td><td>AS-20276</td><td></td></tr><tr><td>Aquaporin-4 항체</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-53234</td><td>1:300</td></tr><tr><td>성상세포 기저 매체 및 보충제</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B-27 무혈청 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cyamn Chemical</td><td>13112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 with GlutaMAX medium</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D3072-1ML</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 슬라이드 장착 매체</td><td>VWR</td><td>100502-406</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>R& D Systems</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexTM LDEV-Free hESC 인증 감소된 성장 인자 지하실&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom 48-well Culture Dishes</td><td>Mattek Corporation</td><td>P48G-1.5-6-F</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>인간 내피 혈청이 없는 매체</td><td>Gibco</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Tocris</td><td>6053</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 비필수 아미노산 용액 (MEM-NEAA)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S30-100mL</td> 2차 항체 호스트 파라포름알데히드 (PFA)<td>와 일치하는 세럼을 사용하십시오</td></tr><tr><td>.</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRB(혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타) 항체</td><td>R& 1</td><td>:500</td>인산완충식염수(PBS), pH 7.4 Gibco 10010031 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pecam1(혈소판 내피 세포 접착 분자 1) 항체</td><td>R&에서 사용되는 D Systems AF385 D Systems</td><td>AF806</td><td>1:500</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PiggyBac 플라스미드 (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)</td><td>AddGene</td><td>&nbsp; 카탈로그 #168805</td><td></td></tr><tr><td>S100B 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532-100uL</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SB43152</td><td>Reprocell</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Chem Impex</td><td>22870</td><td>25uM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp에서 사용;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin(CD144) 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>AF938</td><td>1:500</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254/10</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>MA3-39100-A488</td><td>희석 = 1:500</td></tr></tbody></table>

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)의 핵심 생리학적 구성 요소로, 영양분을 유지하고 노폐물을 제거하며 병원균으로부터 뇌를 보호합니다. BBB의 고유한 장벽 특성은 신경 질환을 치료하기 위해 CNS로의 치료 약물 전달에 어려움을 제기합니다. BBB 기능 장애는 신경 질환과 관련이 있습니다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 대뇌 혈관에 아밀로이드가 침착되어 BBB가 손상되는 현상으로, 알츠하이머병(AD)의 대부분의 경우 동반 질환으로, BBB 기능 장애 또는 고장이 신경 퇴행에 관여할 수 있음을 시사합니다. 인간 BBB 조직에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 적절한 BBB 기능과 BBB 변성에 기여하는 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 3D 매트릭스에 통합하여 인간 만능 줄기 세포 유래 BBB(iBBB)를 개발했습니다. iBBB는 BBB에 존재하는 해부학적 구조와 세포 상호 작용을 요약하기 위해 자체 조립됩니다. iBBB에 아밀로이드를 파종하면 CAA의 주요 측면을 포착할 수 있습니다. 또한 iBBB는 뇌혈관 질환 및 신경 퇴행과 관련된 유전적 및 환경적 요인을 조절하여 유전학 및 생활 방식이 질병 위험에 미치는 영향을 조사할 수 있는 유연한 플랫폼을 제공합니다. 마지막으로, iBBB는 중추신경계에 대한 치료 전달을 최적화하기 위해 약물 스크리닝 및 의약 화학 연구에 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 인간 만능줄기세포에서 발생하는 3가지 유형의 세포(내피세포, 주위세포, 성상교세포)의 분화, 분화된 세포를 iBBB로 조립하는 방법, 외인성 아밀로이드를 이용하여 in vitro 에서 CAA를 모델링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 생물학적 충실도와 실험적 유연성을 모두 갖춘 시스템으로 살아있는 인간 뇌 조직을 연구하는 문제를 극복하고 인간 BBB와 신경 퇴행에서의 역할을 조사할 수 있습니다.

적절하게 형성된 iBBB는 하나의 반투명 디스크로 응고됩니다(그림 3A). iBBB가 며칠 후에 처음 피펫팅된 표면에서 분리되는 것은 정상입니다. 이것은 피할 수 없지만 실수로 iBBB를 흡입하지 않도록 매체를 교체할 때 주의를 기울인다면 iBBB의 적절한 형성에 큰 문제가 되지 않습니다. 24시간 후 균일하게 분포된 단일 세포를 명시야 현미경으로 식별할 수 있습니다(그림 3B). 2주 후에는 더 뚜렷한 구조를 볼 수 있지만 명확하게 식별하기는 어렵습니다(그림 3C).
iBBB의 품질은 입력 셀의 분화 품질에 크게 좌우됩니다. 세포 유형 특이적 마커를 고정하고 염색하기 위해 2D 단일 배양에서 일부 남은 세포를 도금하는 것이 좋습니다. PECAM1 또는 VE-cadherin에 대해 70% 이상 양성인 내피 세포(<stro...

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

우리의 목표는 알츠하이머병 발병 기전을 매개하는 분자 및 세포 메커니즘을 규명하여 치료 및 진단 기회를 발견하는 것입니다. 현재 알츠하이머병의 발병과 발병에 관여하는 분자 경로와 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이는 마우스 모델 및 기타 체외 알츠하이머병 모델이 질병 발병에 중요한 고유한 인간 생물학을 요약하지 못했기 때문입니다.우리는 알츠하이머병, 치매 및 기타 형태의 신경 퇴행과 관련된 뇌혈관 병리를 연구하는 데 적용할 수 있는 혈액-뇌 장벽의 시험관 모델을 개발했습니다. 이 모델은 알츠하이머병의 가장 강력한 위험 인자인 APOE4가 부분적으로 기생충 특이적 경로를 통해 작용하여 병원성 아밀로이드 부담을 증가시킨다는 것을 보여주기 위해 사용되었으며, 유도 만능 줄기세포를 사용하여 질병 병리학 및 약물 스크리닝을 조사하는 데 사용할 수 있는 인간 뇌 조직을 체외에서 구축할 수 있습니다. 이러한 체외 혈액-뇌 장벽 모델은 개인화된 치료 및 진단 접근법을 가능하게 합니다.당사의 3D 체외 혈액-뇌 장벽 모델은 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 국소화를 포함하여 생리학적으로 관련된 상호 작용을 보여줍니다. 또한 아밀로이드 병리를 포함한 질병 관련 표현형을 모델링할 수 있습니다. 마지막으로, 환자 유래 유도만능줄기세포를 사용하면 원하는 유전적 배경을 연구할 수 있습니다.체외 혈액-뇌 장벽 모델을 사용하여 병리학적 뇌혈관 아밀로이드 축적을 매개하는 경로를 발견했습니다. 이를 통해 우리는 노화된 APOE4 마우스에서 이 병리를 되돌릴 수 있는 치료 전략을 탐색하게 되었으며, 현재 후속 조치를 취하고 있습니다.

reconstruction-blood-brain-barrier-vitro-to-model-therapeutically

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

혈액 - 뇌 장벽 장애는 뇌에 특정 약물의 전달을 에이즈. 마니 톨은 물리적 장벽을 방해하기 위해 간 arterially 혈관을 수축 주변 세포를 전달했습니다.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

여기에서는 일차 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포, 성상 세포 및 혈관 주위 세포를 기반으로 혈액 뇌 장벽의 삼중 세포 배양 모델을 구축하는 방법을 설명합니다. 이 다세포 모델은 시험관 내 허혈성 뇌졸중 중 신경 혈관 단위 기능 장애의 연구 또는 약물 후보의 스크리닝에 적합합니다.

시험관 내 허혈성 뇌졸중 연구를 위한 인간 혈액-뇌 장벽의 삼중 일차 세포 배양 모델

학습하세요 인간 유도만능줄기세포로 구축한 3D 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 통해 알츠하이머병의 분자 메커니즘과 APOE4 유전자의 영향을 연구하는 방법을. 이 모델은 맞춤형 치료 및 진단 접근법을 위한 새로운 가능성을 제공합니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

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