Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)
2024년 1월 26일
본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.
인간의 뇌는 다양한 기술을 가진 복잡한 기관입니다. 그 기능을 이해하려면 뇌 전체에 걸쳐 상세한 세포 센서를 구성하는 것이 필수적입니다. 당사의 일상적으로 높은 처리량 프로토콜을 사용하면 마이크로미터 분해능으로 인간 뇌의 체적 영역에 대한 3D 세포 구조를 분석할 수 있어 구조적 특성 분석이 가능합니다.
인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 재구성은 뇌 샘플의 방대한 크기, 복잡한 생물학적 구성, 다양한 사후 고정 및 보관 조건, 리포푸신형 색소의 자가형광 신호와 관련된 몇 가지 실험적 과제를 제시합니다. 이 모든 것이 광학 투명화 효율성과 품질 입증을 손상시킬 수 있습니다. 다른 투명화 기법과 비교했을 때, 광시트 현미경 이미징과 결합된 단조직 형질전환 방법은 여러 인간 뇌 절편의 빠르고 동시적인 처리에 사용할 수 있습니다.
그 결과 세포 내 해상도로 3D 뇌 재구성이 가능합니다.
개요
본 연구는 사후 인간 뇌 절편의 동시 광학 투명화, 다회차 표지 및 3D 체적 재구성을 위한 고처리량 프로토콜을 제시합니다. S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol (TDE) SHORT 기술을 라이트시트 형광 현미경법과 통합함으로써, 본 방법론은 마이크로미터 해상도로 정밀한 구조적 특성 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 조직학
- 면역조직화학
배경
- 인간의 뇌는 다양한 규모에 걸쳐 정밀한 조사가 필요한 복잡한 기관입니다.
- 대형 뇌 샘플의 처리와 색소로 인한 자가 형광 신호 해결 등이 주요 과제입니다.
- 본 프로토콜은 기존 투명화 기술의 단점들을 보완합니다.
연구 목적
- 인간 뇌의 구조 분석을 위한 효율적인 프로토콜을 개발한다.
- 뇌 조직 절편의 광학 투명화 효율과 이미징 품질을 향상시킨다.
- 높은 정밀도와 신뢰성을 갖춘 3D 재구성을 가능하게 한다.
사용된 방법
- 본 연구에서는 라이트시트 형광 현미경법을 이용합니다.
- 인간 뇌 조직을 생물학적 모델로 사용하며, 상세한 섹셔닝 및 처리 단계가 기술되어 있습니다.
- 주요 단계로는 샘플의 아가로스 매립, TDE를 이용한 처리, 그리고 다양한 신경세포 마커를 위한 다회차 면역염색이 포함됩니다.
- 최적의 투명화 및 이미징 조건을 보장하기 위해 배양 시간과 온도가 정밀하게 정의되어 있습니다.
주요 결과
- 본 프로토콜은 회백질 및 백질의 효과적인 광학 투명화와 고품질 이미징을 가능하게 합니다.
- 다회차 염색을 통해 인간 뇌 절편 내의 서로 다른 신경세포군을 시각화할 수 있습니다.
- 본 방법은 3D 재구성에서 세포 내 하위 구조의 세부 사항을 포착할 수 있음을 보여줍니다.
결론
- 본 연구는 마이크로미터 해상도로 뇌 구조를 종합적으로 분석하는 방법을 수립합니다.
- 이 접근 방식은 뇌 구조에 대한 이해를 증진하고 이것이 신경세포 연구에 주는 시사점을 발전시킬 수 있는 잠재력을 강조합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
인간 뇌 조직의 대규모 고해상도 3D 이미징은 신경 제약 R&D의 타겟 검증 및 기전 이해를 발전시키는 데 매우 중요합니다. SHORT 프로토콜을 라이트시트 형광 현미경법(light-sheet fluorescence microscopy)과 결합하면 회백질과 백질 모두에서 신경세포 하위 집단의 신속하고 다중적인 구조적 매핑이 가능해집니다. 이러한 역량은 초기 발견 단계 및 중개 연구의 전환점에서 예측 신뢰도를 높이고 리스크를 감소시키는 데 기여합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 표적 검증을 위한 신경세포 구조의 상세한 분석 및 하위 집단 매핑을 가능하게 합니다.
- 인체 뇌 조직의 세포 구조적 맥락을 밝힘으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 고함량의 정량적 구조 데이터를 제공하여 포트폴리오 우선순위 선정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 어세이 개발
- 후속 정량 이미징 워크플로우에 적합하도록 광학 투명화 및 다중 표지된 조직 절편을 제작합니다.
- 재현 가능한 고효율 이미징 및 분석을 위해 시료 처리 과정을 표준화합니다.
- 신경세포 마커의 다중 검출을 가능하게 하여 강력한 분석법 개발을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 구조적 영상 출력물을 질병 관련 인간 뇌 구조와 정렬합니다.
- 인간 조직의 직접적인 분석을 가능하게 하여 발견 단계부터 전임상 검증까지의 연속성을 제공합니다.
- 포괄적인 3D 세포구조 데이터를 통해 위험 조정된 추진 결정 프로세스를 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
본 프로토콜은 타겟 검증 및 기전 연구를 위해 인간 뇌 절편의 고처리량 정량 이미징을 가능하게 함으로써, 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속적인 연구 과정에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 상세한 신경 세포 매핑을 통해 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량 분석을 위해 재현 가능하고 다중화된 이미징 준비 샘플을 제공합니다.
- 분석: 조건별 비교 분석을 위한 다채널, 세포하 해상도 데이터를 제공합니다.
- 중개 연구: 인간 조직과의 직접적인 관련성을 통해 기초 발견과 전임상 연구를 연결합니다.
- 기업적 재사용: 신경생물학 프로그램 전반에서 반복 사용 가능한 확장 가능하고 표준화된 워크플로를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경생물학적 타겟 검증에서 예측 신뢰도를 높이고 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 표준화되고 확장 가능하며 재현 가능한 조직 처리 및 이미징을 제공합니다.
- 전략적 가치: 정보에 기반한 go/no-go 결정과 자본 효율적인 포트폴리오 관리를 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 신경약물 자산의 위험 조정 우선순위 설정 및 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 조직 처리, 면역 표지 및 고급 현미경 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 라이트 시트 형광 현미경 및 다채널 이미징 인프라에 대한 접근 권한이 요구됩니다.
- 시료 준비 및 이미징 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 다양한 뇌 영역이나 조직 상태에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 최적의 결과를 얻기 위해 시료 취급 및 배양 파라미터를 엄격하게 제어해야 합니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
