Name: 인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 학습하세요 인간 대막을 활용한 3D 생체 외 난소암 복막 전이 모델 구축 방법을. 이 모델은 지방 조직 미세환경에서 암세포 상호작용을 연구하고 새로운 치료법을 테스트하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 자넷 버로스 기념 재단(Janet Burros Memorial Foundation)의 지원을 받았습니다. 우리는 환자와 Karmanos Cancer Institute 부인과 종양학과가 오멘텀 샘플 수집에 대해 감사드립니다. 또한 환자 모집 및 병리학 슬라이드 준비를 조정하기 위해 Karmanos Cancer Institute의 Biobank 및 Correlative Sciences Core를 인정합니다. Biobank 및 Correlative Sciences Core는 Wayne State University의 Karmanos Cancer Institute에 대한 NIH Center 보조금 P30 CA22453의 지원을 받습니다.

다음 연구 프로토콜은 Wayne State University Institutional Review Board(IRB)에서 검토 및 승인되었습니다. 수술 전에 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 받았습니다. 그림 1 은 이 프로토콜의 세 가지 일반적인 단계를 보여줍니다.
1. 인간 omentum 조직의 준비
<ol><li>오멘텀 배양 배지(DMEM/F12 + 소 태아 혈청 10% + 페니실린-스트렙토마이신 1%)를 준비하고 4°C에서 보관합니다. 이 배지 30-40mL를 멸균 50mL 코니컬 튜브 또는 수술용 표본 용기에 분취합니다.</li>
	<li>omental 생검 또는 omentectomy 수술에서 수술 표본을 얻습니다. 멸균 검체를 수술실에서 제거한 직후 omentum 배양 배지에 담그십시오. 워크플로우에서 이를 허용하지 않는 경우 가능한 한 빨리 검체를 omentum 배양 배지에 넣으십시오. 샘플을 얼음 위에 올려 옮기고 처리할 때까지 4°C에서 보관합니다. 알림: 제거된 오멘텀 표본의 크기에 따라 작업 가능한 조직의 양이 결정됩니다.</li>
	<li>층류 후드를 사용하여 채취 후 1-2시간 이내에 omentum 표본을 처리합니다. 모든 재료와 도구가 멸균 또는 멸균되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>수집 용기에서 오멘텀을 꺼내 100mm 배양 접시에 옮깁니다. 검체를 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 담그고 검체를 부드럽게 세척하여 혈전이나 부스러기를 제거합니다.</li>
	<li>조직을 조각으로 자릅니다 (0.5cm x 0.5cm 또는 100-200mg; 그림 2A) 작은 수술용 가위 또는 10-15mm 메스를 사용합니다. 작은 수술용 집게를 사용하여 조직을 조작하고 오멘텀이 부서지는 것을 방지하십시오. 에너지 장치를 사용하여 오멘텀 검체를 외과적으로 제거한 경우 밀봉된 가장자리에서 왜곡된 조직을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>절단된 오멘텀의 각 조각을 24웰 배양 플레이트의 개별 웰에 넣고 500μL의 오멘텀 배양 배지 또는 오멘텀 조각이 웰 바닥 위에 떠 있지 않고 오멘텀을 덮을 수 있는 부피로 웰을 채웁니다(그림 2B).</li>
	<li>주입할 준비가 될 때까지 4°C의 신선한 배양 배지에 오멘텀 조각을 보관합니다.</li>
</ol>2. 난소암 세포의 제조
<ol><li>인간 난소암 세포를 37°C에서 75cm2 배양 플라스크에 배양하고 5%CO2 내지 75% 농도에서 omentum 채취일까지 최소 75% 밀도를 배양합니다. 참고: 이 프로토콜은 이전에기술한 mCherry 양성 OCSC1-F2 인간 난소암 세포를 사용합니다 15,16,17,18. 형광 신호로 태그된 모든 암 세포주에 변형될 수 있습니다.</li>
	<li>omentum 표본을 채취한 직후 층류 후드 내부에 세포를 준비합니다. 모든 재료와 도구가 멸균 또는 멸균되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>멸균 1x PBS 10mL를 배양 플라스크에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포를 세척합니다. 1x PBS를 제거한 다음 0.05% 트립신-EDTA 3mL를 추가합니다.</li>
	<li>배양 플라스크를 부드럽게 흔들어 모든 세포를 코팅한 다음 플라스크를 인큐베이터(37°C 및 5% CO2)에 5분 이상 두지 않습니다. 배양 플라스크를 두드려 세포를 완전히 분리한 다음 3mL의 오멘텀 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 세포 현탁액을 혼합한 다음 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다. 24°C에서 1,200 x g 에서 5분 동안 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 6mL의 신선한 오멘텀 배양 배지에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액을 100-200 μL 당 최소 100,000 세포로 희석합니다. 이것은 오멘텀의 각 절단 조각에 주입되는 양입니다.</li>
	<li>적절한 수의 세포를 새로운 배양 플라스크에 옮겨 세포 통과를 계속합니다.</li>
</ol>3. 난소암 세포 주입
<ol><li>1mL 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 끌어올린 다음 26G 바늘을 부착합니다. 세포가 파편화될 수 있으므로 바늘을 사용하여 세포 현탁액을 그리지 마십시오.</li>
	<li>작은 수술용 집게를 사용하여 잘린 오멘텀 조각을 집습니다. 주입을 용이하게 하기 위해 omentum을 별도의 작동 멸균 접시로 옮깁니다. 바늘 끝으로 오멘텀을 부드럽게 뚫고 소량의 세포 현탁액을 조직에 주입합니다(그림 2C).</li>
	<li>최소 100μL 또는 100,000개의 세포가 있는 총 부피까지 여러 영역에 걸쳐 주입을 반복합니다. 세포 현탁액의 대부분이 표본 주위에 고이는 것처럼 보일 수 있습니다. 주입 품질에 대한 우려가 있는 경우 주입을 반복하거나 더 많은 양의 세포 현탁액을 검체에 주입합니다.</li>
	<li>주입된 오멘텀 샘플을 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 되돌립니다. 오멘텀 배양 배지의 양은 오멘텀이 뜨지 않고 덮을 수 있는 수준입니다. 플레이트를 조심스럽게 다루고 인큐베이터(37°C 및 5% CO2) 안에 넣습니다.</li>
	<li>선택 사항: Matrigel(기저막 매트릭스)을 사용하여 omentum 조직을 고체 매트릭스에 현탁시켜 더 쉽게 주입하고 더 농축된 세포 현탁액을 전달할 수 있습니다.<ol><li>기저막 매트릭스를 4°C에서 해동하고 사용 직전에 오멘텀 배양 배지와 1:1 비율로 혼합합니다. 기저막 매트릭스 혼합물을 얼음 위 또는 주입할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 빈 우물을 자른 오멘텀 조각을 담글 수 있을 만큼 충분한 기저막 매트릭스 혼합물로 채웁니다.</li>
		<li>시료를 기저막 매트릭스 혼합물에 넣은 다음 24웰 배양 플레이트를 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에 20분 동안 놓습니다. 혼합물이 응고되면 위에서 설명한 대로 주입을 계속합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 이미징을 사용하여 성공적인 주입을 확인합니다. 주입 부위에서 형광 신호의 줄무늬가 시각화되는지 확인합니다(그림 2D). 주입 후 omentum에 부착 된 실제 세포 수는 예측할 수 없습니다.</li>
</ol>4. 인간 오멘텀과 난소암 세포의 공동 배양
<ol><li>500-2000 μL의 신선한 오멘텀 배양 배지를 추가하여 48-72시간마다 배지를 교체합니다. 암세포를 대체할 수 있으므로 배지를 오멘텀 조직 위에 직접 피펫으로 바르지 마십시오. 미디어 색상이 노란색으로 바뀌면 미디어를 변경하십시오. 참고: 배지 교체 빈도는 사용된 배지의 양과 암세포 성장 궤적에 따라 달라집니다. 일단 암세포가 오멘텀에 씨를 뿌리고 나면, 오멘텀 조각이 떠 있는지 여부는 더 이상 중요하지 않습니다.</li>
	<li>선택 사항: 기저막 매트릭스가 사용된 경우 매트릭스는 일반적으로 첫 번째 매체 교체 시 용해됩니다.</li>
	<li>형광 영상을 사용하여 난소암 종양의 성장을 모니터링합니다. 이미징 빈도는 조사자의 재량에 달려 있습니다. 약 14일 이내에 작은 종양의 증거를 예상합니다(그림 3A-C). 결과는 주사의 품질에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>실험 엔드포인트에 따라 실험을 종료합니다. 참고: 종양 성장과 오멘텀 조직의 무결성은 지난 50일 동안 관찰되었습니다.</li>
</ol>

난소암-오멘텀 상호작용을 위한 3D Ex Vivo 모델 구축

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</ol>

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이 프로토콜을 사용하여 난소암에 대한 복막암의 전임상 모델은 기본적인 in vitro 및 ex vivo 기술의 조합을 사용하여 개발되었습니다. mCherry+ OCSC1-F2 인간 난소암 세포로 오멘텀 검체를 파종한 후 50일간의 공동 배양에서 점진적인 종양 성장이 관찰되었습니다. 이 방법은 다양한 오멘텀 표본을 사용한 여러 실험 시험에서 개발 및 최적화되었습니다. 성공적인 종양 성장은 오멘텀의 질, 암세포의 생존력, 주사의 효과에 달려 있었다. 이 보고서에서는 이전에 여러 간행물에서 보고된 mCherry+ OCSC1-F2 세포와 mCherry+ R182 인간 난소암 계열만 사용했습니다 12,15,16,17,18,19,20,21,22. 두 세포주를 서로 다른 배증 시간(OCSC1-F2의 경우 16시간, R182의 경우 36시간)으로 사용하여 omental 조직 내에서 로그 성장을 달성하는 데 걸리는 시간의 차이가 관찰되었습니다. 그럼에도 불구하고 우리는 공동 배양 시스템에서 두 세포주를 모두 확립하는 데 성공했습니다.
연구자, 연구 코디네이터, 수술 팀 간의 효율적인 의사 소통은 오멘텀 표본의 수집 및 처리에 매우 중요했습니다. 연구자는 프로토콜 후보를 식별하고, 연구 코디네이터는 수술 전에 환자의 동의를 얻고, 연구자는 수술실에서 검체를 수집했습니다. 이 워크플로우를 감안할 때, 수집에 영향을 미치는 많은 환자 측 요인(예: 수술 취소, 수술 시간 변경, 부적절하거나 제거되지 않은 경우)이 발생했기 때문에 연구자의 일정은 유연해야 했습니다. 수술실에서 조직을 직접 시각화하고 선택하면 표본 무결성, 수술 무균 및 적시 처리가 보장됩니다. 처음에는 표본 수집이 연구 코디네이터에게 위임되었습니다. 그러나 몇 개의 표본을 채취한 후 처리 시간이 지연되고(즉, >4시간) 오멘텀의 품질이 크게 떨어진다는 것을 알게 되었습니다(예: 조직이 조각난 경우). 한 실험에서는 암세포가 제때 준비되지 않았기 때문에 주입 전 48시간 동안 omental 조직을 4°C에서 보관했습니다. 유사한 종양 성장이 여전히 관찰되었지만, 온도 변화가 종양 미세환경(TME)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에 이 순서는 반복되지 않았습니다.
검체 채취 전에는 수술 일정에 따라 암세포가 충분히 융합되어 있어야 했습니다. 매달 채취하는 검체의 수가 다양했기 때문에 난소암 세포의 활성 배양이 항상 유지되는 것은 아니었습니다. 냉동된 세포는 최소 1주일 전에 해동하고, 표준 프로토콜을 사용하여 도금한 다음, 생존력을 보장하기 위해 세포를 적어도 한 번 통과시켰습니다. 이 프로토콜에 사용된 세포주는 상대적으로 탄력적이었습니다. 그러나 수술 당일까지 세포가 회복되지 않아 주사를 놓을 수 없는 경우도 있었습니다. 이 연구에서는 50% 미만의 융합된 암세포를 주입하려는 시도는 없었습니다. 세포 준비와 관련된 후속 지연은 우수한 멸균 기술을 사용하고 예상되는 검체 수집 일정에 따라 합류를 유지하기 위해 세포를 비율로 분할하여 완화되었습니다. 이 프로토콜은 형광 표지가 부착된 2개의 암 세포주로만 제한되었지만, 형광 단백질이 없는 다른 기존 암 세포주 또는 원발성 암 세포도 활용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
마지막으로, 종양 성장 속도는 주사 직후 지방세포에 인접하고 지방세포 내에 있는 암세포의 합류와 상관관계가 있었습니다. 이것은 주입 후 모든 오멘텀 표본의 형광 이미지를 촬영하여 결정되었습니다. 종양세포를 고형장기나 피하조직에 접종하는 것과 비교했을 때, 암세포를 뇌조직에 주입하는 것은 더 어려웠다. omentum의 느슨한 구조와 지방 일관성은 조직이 누출 없이 세포 현탁액의 양을 효과적으로 유지하는 것을 방지합니다. 더 작은 바늘(즉, 30G 이하)을 사용하여 주입하면 세포 증식이 감소하여 세포 단편화에 대한 우려가 있었습니다. 다양한 주입 기술, 세포 수 및 세포 현탁액을 테스트했으며 위에서 설명한 프로토콜과 일관된 결과를 찾았습니다. 동시에, 우리는 프로토콜에 대한 이러한 변이가 세포의 악성 특성을 감안할 때 여전히 유사한 결과를 생성할 가능성이 있음을 인정합니다. Matrigel의 추가는 세포외 기질이 세포 현탁액을 더 잘 유지함에 따라 주입 단계를 더 쉽게 만들었습니다. 그러나 이 방법은 비용이 더 많이 들고 샘플에서 일관되게 더 높은 종양 부담을 생성하지 않았습니다. 전반적으로, 오멘텀 표본 중 종양이 자라지 않는 경우는 드물었지만, 종양의 수와 성장 속도는 다양했다.
이 모델은 지방이 풍부한 복막 조직으로의 조기 전이를 복제하여 난소암 종양 형성의 특징을 시뮬레이션했습니다. 이 프로토콜은 기술이 필요하지 않은 변형이 가능하고, 복제가 쉬우며, 잠재적인 변환 가치가 있는 시스템을 생성합니다. 난소암에서 기존의 in vitro 및 ex vivo 모델과 비교하여, 여기에 설명된 방법은 긴 수명 동안 종양 구조와 TME를 유지하는 모델을 생성하기 위해 여러 기술을 결합합니다. 또한, 여러 종양이 있는 오멘텀 표본을 새로운 웰로 옮기고 암이 없는 오멘텀으로 배양했을 때(즉, 주입하지 않았을 때) 7일 이내에 암세포를 파종하는 것을 관찰했습니다. 이 발견은 복제된 종양이 상피-중간엽 전이를 통해 전이 가능성을 유지한다는 것을 시사합니다. 문헌에서 조직 생검을 장기간 배양한 유사한 난소암 모델은 확인되지 않았다. 이러한 접근법은 마우스 오멘텀(mouse omentum)으로부터 분리된 중피 세포가 수집 후 30개 이상의 통로에 대해 배양될 수 있다는 이전의 발견에 의해 뒷받침된다23.
이 연구에서 설명된 모델은 난소암 세포와 지방이 풍부한 망막 내 세포 간의 직접적인 상호 작용의 효과를 더 잘 이해하기 위해 사용할 수 있습니다. 암세포는 전사체 조직에서 해리되어 전사체 또는 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 얻을 수 있습니다. 또한 세포는 약물 반응 연구에 사용할 수 있습니다.
이 모델의 주요 한계는 종양의 수, 종양 성장 속도 및 종양의 위치를 예측할 수 없다는 것입니다. 표준화가 부족하고 샘플 간 변동이 있으면 이 모델의 적용이 제한될 수 있습니다. 우리는 또한 이 프로토콜을 개발하는 동안 추가 검토가 필요한 몇 가지 관찰을 했습니다. 예를 들어, 한 실험에서 "대조군" 복제는 환자가 나중에 omental micrometastasis로 진단되었기 때문에 실제로 암이 없는 것은 아니었습니다. 그러나 주입되지 않은 종양은 실험 기간 내내 생존 가능한 상태로 유지되었습니다. 이 모델의 향후 응용 분야에는 초기 종양 형성 중 TME의 분자 연구, 면역 세포 주입에 의한 TME의 조작 및 약물 반응 조사가 포함됩니다. 요약하면, 우리는 여기에 설명된 전임상 모델이 기존 연구 도구의 레퍼토리에 추가되고 난소암에서 TME의 분자 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 것이라고 믿습니다.

난소암은 전 세계적으로 가장 치명적인 부인과 악성 종양입니다1. 이 암에 걸릴 위험은 평생 70명 중 1명이며, 평균 진단 연령은 63세입니다2. 원발성 난소 악성 종양은 조직학적으로 상피성 또는 비상피성으로 분류됩니다. 상피난소암(EOC)은 종양의 90% 이상을 차지하며, 가장 흔한 아형은 EOC의 약 70%-80%를 차지하는 고등급 장액암(HGSC)입니다. 현재로서는 질병을 조기에 발견할 수 있는 효과적인 선별 방법이 없습니다. 따라서 대부분의 환자는 암이 복막강 전체로 퍼진 후 진행된 단계(즉, Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stage III 또는 IV)에서 진단된다2.
표준 일선 치료는 눈에 보이는 모든 거시적 질병을 제거하는 세포 축소 수술과 잔여 현미경 질환을 파괴하기 위한 보조 백금 기반 화학 요법입니다. 지난 20년 동안 난소암 치료에는 많은 발전이 있었지만, 진행성 난소암 환자의 약 70%는 치료 후 3년 이내에 재발한다3. 이러한 환자들의 전반적인 예후가 좋지 않다는 점을 감안할 때, EOC의 현재 및 향후 중개 연구 노력은 조기 발견을 위한 바이오마커를 식별하고, 전이를 방지하고, 내성을 회피하기 위한 현재 치료법을 개선하고, 새로운 맞춤형 암 치료법을 개발하는 것을 목표로 합니다.
복막강 내 전신 전이 및 관련 화학 저항성은 난소암 환자의 치료 개선을 위한 두 가지 주요 한계입니다 4,5. 오멘텀(omentum)은 위에서 장 위로 늘어져 있는 지방이 많은 앞치마와 같은 구조로, 난소암 전이의 주요 부위이다 6,7. 물리적 장벽으로서의 기능 외에도 오멘텀은 재생 및 혈관 생성 능력을 가지고 있으며 면역 활동을 가지고 있어 혈관 형성을 촉진하고 상처 치유를 촉진하며 감염을 제한하는 것으로 나타났습니다8. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있고 손상된 조직을 복구하는 데 도움이 될 수 있는 고농도의 줄기세포를 함유하고 있습니다. 염증은 부상이나 감염에 대한 반응으로 염증이 생길 수 있으며, 이는 면역 세포가 부상 부위로 이동하도록 유도한다9. 이 면역 세포는 손상된 조직의 복구와 재생을 촉진하는 데 도움이 되는 성장 인자와 기타 분자를 방출합니다. 대식세포, 림프구, 형질세포와 같은 면역세포는 병원체를 탐지 및 공격하고 복막 면역을 조절하는 역할을 하는 "유백색 반점"으로 알려진 구조입니다. 오멘텀은 또한 면역 관용을 유도하는 역할을 하는 것으로 나타났는데,10 이는 면역 체계가 자가 항원을 견디고 건강한 조직을 공격하지 않는 능력입니다. 그러나 동일한 면역 관련 활동이 종양의 성장, 전이 및 면역 감시의 탈출과 같은 병리학적 반응에도 관여한다 9,11. 우리 연구실과 다른 연구자들의 이전 연구에서는 항종양 면역 반응 억제 및 화학 내성 획득에서 지방 미세환경의 독특하고 적극적인 역할을 입증했습니다12,13,14. 불행히도, 우리는 omentum이 전종양 미세환경을 제공하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 제한된 정보를 가지고 있습니다.
암세포와 난소암 사이의 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 인간 난소암 세포와 환자 유래 난소암 외출로 구성된 3D 배양 시스템이 개발되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 복막암종의 새로운 생체 외 모델을 나타냅니다. 이 모델은 지방이 풍부한 조직에서 난소암 종양형성의 자연스러운 진행을 모방합니다. 제안된 모델은 생성하기 쉽고, 저렴하며, 난소암 연구의 중개 조사에 잠재적으로 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>1mL 인슐린 주사기(26G 분리형 바늘</td><td>BD</td><td>포함) 329652</td><td></td></tr><tr><td>10mL 혈청학적 피펫</td><td>CELLTREAT</td><td>229010B</td><td></td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>CELLTREAT</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>24웰 셀 배양 플레이트</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 조직 배양 플라스크</td><td>CELLTREAT</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>코닝 세포 카운터</td><td>Corning</td><td>9819000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 이미저</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-글루타민, +2.438 g/L 나트륨 중탄산염</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 자격을 갖춘</td><td>Gibco</td><td>1043028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>기저 멤브레인 매트릭스</td></tr><tr><td>No. 10 스테인리스 스틸 일회용 메스</td><td>Integra-Miltex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, pH 7.4 ( 1x)</td> <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Revolve 현미경</td><td>에코</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양입니다. 오멘텀은 전이성 난소암 세포에 지지적인 미세환경을 제공할 뿐만 아니라 종양 내성을 허용하는 면역 조절 신호를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 난소암 세포와 지방이 풍부한 조직 간의 상호 작용을 밀접하게 모방하는 모델은 제한적입니다. 오멘텀이 전종양 미세환경을 제공하는 세포 및 분자 메커니즘을 더 깊이 이해하기 위해, 우리는 암세포-오멘텀 상호작용에 대한 독특한 3D 생체 외 모델을 개발했습니다. 인간 오멘텀을 사용하여 지방이 풍부한 미세환경 내에서 난소암 세포를 성장시키고 종양 성장과 면역 조절을 담당하는 요인을 모니터링할 수 있습니다. 이 모델은 지방이 풍부한 종양 미세환경 연구를 위한 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 이 틈새 시장에서 전이성 암세포를 표적으로 하는 새로운 치료 접근법의 개발 및 평가를 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 제안된 모델은 생성하기 쉽고, 저렴하며, 중개 조사에 적용할 수 있습니다.

난소암 세포를 오멘텀 표본에 성공적으로 확립하는 것은 약 14일째에 분명했습니다(그림 3A-C). 추가 실험을 위해 수집된 표본당 최소 24개의 복제물을 준비하고 주입했습니다. 종양 성장은 형광 이미지를 촬영하여 모니터링했습니다(그림 3D,E). 이미지는 오멘텀에 부착되지 않은 각 우물의 바닥에서도 암세포의 단층이 자라기 때문에 신중하게 해석되어야 했습니다. 우리는 형광 신호가 암세포 단층과 겹치는 것을 피하기 위해 매체에 현탁되어 있을 때 오멘텀의 이미지를 촬영하는 것을 선호했습니다.
14일까지 형광 신호가 없으면 주입 실패로 간주될 수 있습니다. 암세포는 처음 7일 동안 암세포의 표면을 가로질러 퍼졌지만 시간이 지남에 따라 모여서 종양을 형성하는 것이 관찰되었습니다(그림 3A-D). 샘플 간의 종양 부담에 대한 대리 측정은 오멘텀 배양 배지의 색상이 빨간색에서 노란색으로 변하는 속도였습니다(그림 3F). 형광 영상, 조직학적 검토 및 전체 검사를 활용하여 공동 배양 50일 후 종양 성장과 조직 생존율을 확인했습니다(그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 일반적인 단계 그림. (A) 1단계: 오멘텀 준비; (B) 2단계: 암세포 주입; (C) 3단계: 암세포-오멘텀 미세환경 구축. (BioRender.com 에서 준비한 그림). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig02.jpg"> 그림 2: 암세포의 준비 및 omentum에 주입 . (A) 오멘텀은 1x1cm 조각으로 자릅니다. (B) 각 조각을 24웰 플레이트의 웰에 넣고 500μL의 매체로 덮습니다. (C) 암세포를 오멘텀 조각에 주입. (D) 주사 후 형광 암세포의 줄무늬가 관찰됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig03.jpg"> 그림 3: 공동 배양 14일 및 25일 후의 대표 이미지. (A-C) 공동 배양 14일 후의 대표 이미지: (A) 단계, (B) mCherry 채널, (C) 병합. (D-E) 25일간의 공동 문화 후 대표 이미지. (F) 배지 색상이 분홍색에서 노란색으로 변하는 것은 성공적인 암세포 주입 및 공동 배양 확립을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig04.jpg"> 그림 4: 총 형태 및 Hematoxylin 및 Eosin(H&amp;E) 염색. (A,B) 50일째 공동 배양의 대표적인 총 형태; 화살표는 mCherry+ 난소암 세포의 성장 부위를 가리킵니다. (씨,디) 50일째 공동 배양의 대표적인 H&amp;E 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 암세포-omentum 상호 작용의 3차원(3D) 생체 외 모델의 확립을 설명합니다. 이 모델은 지방 틈새 시장 내에서 종양 유발 기전을 규명하고 새로운 치료법을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

현재 연구는 분리된 지방세포와 난소암 세포로 구성된 공동 배양 시스템을 사용합니다. 이 지방세포는 시험관 내에서 pre-adipocyte와 분화됩니다. 그런 다음 이러한 셀은 트랜스웰 삽입물을 통해 분리되므로 셀과 셀이 직접 접촉하지 않습니다.이 생체 외 배양 방법은 암세포와 지방 미세환경의 직접적인 상호 작용을 연구하는 모델을 제공합니다. 우리의 모델은 인간 운동량의 구조를 보존하므로 일반적으로 이 기관에 있는 다양한 세포 유형을 유지합니다. 지방 세포 외에도 이러한 세포에는 면역 세포뿐만 아니라 지원 섬유아세포가 포함됩니다.이 모델은 또한 이러한 세포를 고유 매트릭스로 유지합니다. 이 모델은 이 틈새 시장에서 전이성 암세포를 표적으로 삼기 위한 새로운 치료 접근법의 개발 및 평가를 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기에 설명된 mesothelial 통관 분석은 fluorescently 표시된 셀 및 촬영된 비디오 현미경 시각화하고 양적 난소암 다세포 spheroids 및 mesothelial 세포 monolayers의 상호 작용을 측정하기 위해 활용합니다. 이 분석은 난소 암 전이의 초기 단계를 모델.

체외 Mesothelial 정리 분석에서는 그것이 난소 암 전이의 초기 단계 모델

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

이 비디오는 인간 망막 표본에서 일차 인간 중피 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 중피 세포는 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하기 위한 체외 난소암 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다.

Mesothelial Cell Isolation: A Technique to Isolate Primary Mesothelial Cells From Human Omentum Tissue Specimen

이 비디오에서는 난소 이식 내 난소암 집락화를 연구하기 위해 GFP 발현 난소암 세포와 겹쳐진 생체 외 난소 장기 배양을 확립합니다. 이 프로토콜은 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spot)으로 알려진 망막 내의 면역 세포 구조를 분석합니다.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An ex vivo method to establish Milky spot colonization of fluorescently labeled ovarian cancer cells in murine omentum explants(오멘텀의 난소암 세포 집락화 모델링: 쥐 오멘텀 외식에서 형광 표지된 난소암 세포의 밀키 스폿 집락화를 확립하기 위한 생체 외 방법)

이 비디오는 종양 발달 및 복막 전이를 연구하기 위한 쥐 실험 모델을 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 난소암 모델은 인간 상피 난소암 세포를 암컷 마우스의 난소에 orthotopic 접종하여 생성됩니다.

쥐 난소에 난소암 세포의 정소성 접종: 세포의 복막 전파를 연구하기 위한 난소암 마우스 모델을 설정하는 절차

우리는 복막 지방 조직, 특히 망막의 난소암 집락화를 연구하기 위해 생체 내 및 생체 외 접근 방식을 모두 구현하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 복막 지방의 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spots)으로 알려진 망막의 면역 세포 구조를 정량화하고 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

이 원고는 종양 저산소증이 전이에 미치는 영향을 직접 테스트하고 그 작용 메커니즘을 해독할 수 있는 동물 모델의 개발을 설명합니다. 여기에 설명된 실험은 유잉 육종에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종양 유형에도 유사한 접근법을 적용할 수 있습니다.

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

학습하세요 인간 대막을 활용한 3D 생체 외 난소암 복막 전이 모델 구축 방법을. 이 모델은 지방 조직 미세환경에서 암세포 상호작용을 연구하고 새로운 치료법을 테스트하는 데 활용됩니다.

인간 Omentum을 사용한 난소암 복막 전이의 생체 외 모델

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