알츠하이머병(AD)의 신경 모델에서 미토콘드리아 관련 소포막(MAM) 안정화의 정량적 분석

우리는 알츠하이머병을 포함한 여러 신경퇴행성 질환의 병태생리학을 조절하는 데 중요한 다양한 두께 또는 간격 폭의 미토콘드리아 관련 ER 막의 안정성을 정량적으로 측정하려고 노력하고 있습니다. 종종 MAM이라고 불리는 미토콘드리아 관련 ER 막에 대한 최근 연구에서는 이를 AD 초기 단계에서 아밀로이드 병리를 시작하는 핵심 요인 중 하나로 설명했습니다. 이 발견은 AD가 전적으로 MAM 관련 질병임을 시사하는 MAM 가설이라는 새로운 가설의 개발로 이어졌습니다.

우리의 프로토콜은 지금까지 어려운 것으로 남아 있던 살아있는 세포에서 MAM 안정화를 측정하기 위한 정량적 도구를 제공하는 최초의 프로토콜입니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 미토콘드리아의 고유한 동적 특성을 사용하여 살아있는 세포에서 MAM 갭 폭을 조이거나 풀 때 MAM 안정화의 변화를 정량적으로 측정한다는 것입니다.

가까운 장래에 우리의 초점은 최근 개발된 AD 약물 스크리닝 플랫폼을 사용하여 MAM 또는 MAM 결합 시그마 원 수용체의 일련의 FDA 승인 합성 또는 천연 소분자 조절제를 스크리닝하고 작용 메커니즘을 이해하기 위해 최첨단 생세포 이미징 및 키모그래피 기술을 개선하고 사용하는 것입니다.

[해설자] MAM 안정제로 세포를 형질감염시키려면 각 웰에서 골수 단핵 혼합물을 실온 DMEM-F12 배지 2밀리리터로 교체합니다. 뉴클레오펙터 시약과 보충제 1을 4.5:1의 비율로 결합합니다. 혼합물에 100마이크로리터의 뉴클레오펙터 시약을 첨가합니다. 그런 다음 DNA 용액을 소용돌이치게 합니다. 각 형질감염에 대해 처리당 1-5마이크로그램의 DNA를 별도의 1밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 세포에서 기존 배지를 흡인한 후 PBS 10ml로 세포를 한 번 세척합니다. PBS를 흡인하고 1밀리리터의 accutase를 세포에 직접 첨가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양합니다. 그런 다음 접시 측면을 가볍게 두드려 세포를 제거합니다. 현미경으로 세포가 느슨해지고 자유롭게 흐르는지 확인합니다. 10밀리리터의 DMEM-F12 배지로 암자극을 중화하고 세포 현탁액을 깨끗한 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 부유 세포 10마이크로리터를 가져와 세포 계수 챔버의 A면에 추가합니다. 그런 다음 채워진 챔버의 A면을 셀 카운터 전면의 메인 슬롯에 삽입합니다. 밀리리터당 세포 수를 측정하고 기록합니다. 필요한 수의 세포를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하고 각 전기천공에 대해 펠릿을 100마이크로리터의 뉴클레오펙터 혼합물에 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 세포 현탁액 100마이크로리터를 DNA가 들어 있는 튜브 중 하나에 추가합니다. 용액을 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 DNA 세포 혼합물을 전기천공 큐벳으로 옮기고 제공된 뚜껑으로 밀봉합니다. 장치에서 적절한 핵 프로그램을 선택하십시오. 멸균 피펫을 사용하여 미리 채워진 6웰 플레이트에서 약 500마이크로리터의 DMEM을 큐벳에 즉시 추가합니다. 한 번 부드럽게 혼합하고 전기천공된 세포와 배지를 해당 웰로 옮깁니다. 시작하려면 세포가 들어 있는 6웰 플레이트를 현미경 챔버에 놓고 세포가 보일 때까지 현미경의 초점을 조정합니다. 적색 형광 단백질 신호를 포착하려면 594나노미터 레이저를 사용하여 형광단을 여기시키고 방출을 570-640나노미터로 설정합니다. 녹색 형광 단백질의 경우 510-540나노미터 방출로 여기하기 위해 488나노미터 레이저를 사용하십시오. 축삭 주위에 맞게 스캔 영역을 자릅니다. 스캔 영역이 작을수록 처리 시간이 단축되고 키모그래피 생성이 단순화됩니다. 간격을 초당 1프레임으로 설정하고 총 지속 시간을 181초로 설정합니다. 실행을 클릭하여 프로세스를 시작합니다. MAM 1X 표지 ER 결합 미토콘드리아의 축삭 속도는 자유 및 MAM 9X 결합 미토콘드리아에 비해 50% 감소했습니다. MAM 1X 미토콘드리아의 26.6%는 이동성이 있었고 유리 미토콘드리아는 53.82%, MAM 9X 미토콘드리아는 44.79%였습니다. 역행 운동은 MITO-RFP 미토콘드리아 및 MAM 9X 미토콘드리아보다 MAM 1X 미토콘드리아에서 더 낮았습니다. MAM 1X 미토콘드리아의 전행성 이동도 Mito-RFP에 비해 감소했습니다. MAM 1X 미토콘드리아의 고정 비율은 운동성 감소를 반영하여 MAM 9X 미토콘드리아보다 유의하게 높았고, MAM 1X 미토콘드리아의 전체 속도는 MAM 9X 미토콘드리아보다 유의하게 낮았습니다.