Name: 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 이용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징 방법을. 이 기술은 장 상피에서 바이러스-숙주 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 R01DK115507 및 R01AI158683(PI: J. M. Hyser)의 지원을 받았습니다. 연수생 지원은 NIH 보조금 F30DK131828(PI: J.T. Gebert), F31DK132942(PI: F. J. Scribano) 및 F32DK130288(PI: K.A. Engevik)에서 제공했습니다. 오가노이드 유지 배지를 제공해 주신 Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core에 감사드립니다.

바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드 단층의 칼슘 이미징

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<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
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<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
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<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
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저자는 공개할 재정적 이해관계가 없습니다.

세포질 Ca2+ 수준의 변화는 상피 내 병리학의 원인이자 결과일 수 있습니다10,16,17. 세포질 칼슘의 증가는 칼슘 의존성 염화물 채널의 활성화를 통해 분비를 직접 유도할 수 있습니다18,19 TMEM16A. Ca2 +에 대한 반응으로 TMEM16A의 활성화는 염화물의 정점 유출을 허용하여 유체 분비를 촉진하는 삼투압 구배를 설정합니다20,21. 또한, 장내분비 세포 내에서 Ca2+의 증가는 세로토닌의 방출을 촉발하는데, 이는 장 신경계 내의 활동을 조절할 수 있는 구심성 감각 뉴런을 자극한다22. Ca2+ 신호는 또한 단단한 접합을 조절하여 장벽 기능(23,24)에 영향을 미치고 장 줄기 세포(25)의 증식을 조절할 수 있다. 따라서 Ca2+의 조절 장애는 광범위하고 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.
많은 바이러스는 세포질 Ca2+를 조작하여 복제에 도움이 되는 세포 환경을 조성한다26. 로타바이러스(Rotavirus)는 장 상피(intestial epithelium) 27 내에 있는 대표적인 예이다. 로타바이러스 비구조적 단백질 4(NSP4)는 Ca2+가 소포체에서 세포질28,29로 유출될 수 있도록 하는 Ca2+ 전도 채널입니다. 이것은 자가포식을 자극하고 외부 캡시드(30,31,32)의 조립을 돕는다. 로타바이러스 감염은 또한 ADP의 방출을 유도하여 발병에 기여하는 세포간 Ca2+ 파를 유발한다17. 칼리시바이러스(calicivirus)와 엔테로바이러스(enterovirus)를 모두 포함하는 다른 장내 바이러스는 감염된 세포 내에서 Ca2+의 유사한 조절 장애를 유발하는 Ca2+-전도성 비로포린(viroporin)을 암호화한다33,34.
인간 장 오가노이드의 Live-cell Ca2+ 이미징은 상피 내 바이러스 유도 신호전달을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 제공합니다. 그러나 이미징 데이터에서 도출된 결론의 강도는 HIO의 상태와 품질, 적절한 이미징 매개변수 및 건전한 분석 접근 방식에 따라 불가분의 관계에 달려 있습니다.
효율적인 렌티바이러스 형질도입은 새로운 HIO 세포주를 확립할 때 종종 제한적인 단계이지만, 높은 역가의 렌티바이러스와 다중 형질도입은 충분한 전이유전자 발현을 보장하는 데 도움이 됩니다. 중요한 것은, 이것은 형질도입 시 상당한 세포 스트레스의 가능성과 균형을 이루어야 한다는 것입니다. 이것은 대부분 일시적이며 선택 및 여러 구절 후에 가라앉습니다. 그럼에도 불구하고 GECI를 발현하도록 설계된 HIO는 실험을 시작하기 전에 정상적인 성장과 증식을 나타내는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 3차원 HIO를 분산시키고 단층으로 재형성하는 것은 세포 스트레스를 유발합니다. 도금 후 단층이 적응하는 데 3일 이상을 허용하는 것이 가장 좋습니다. 콜라겐 IV로 플레이트를 코팅하는 것은 단층 무결성35,36에 매우 중요합니다. 콜라겐 IV를 분취하여 사용 사이에 -80°C에서 보관하면 단층 부착을 보장하는 데 도움이 됩니다. 각 HIO 라인에 대한 최적의 시딩 밀도를 결정하는 것도 일관성을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 적절한 대조군을 포함하고 실험 간에 비교하는 것은 모든 관측치가 기술적 교란이 아닌 해당 변수에 대한 반응을 나타내도록 하는 데 필수적입니다.
단층을 스코어링하면 원치 않는 세포 손상이 발생할 수 있지만 2D HIO의 RV 감염을 크게 향상시킵니다. 그림 2 는 거의 모든 감염된 세포가 스크래치에 직접 인접해 있기 때문에 이를 보여줍니다. 실험적 증거는 RV가 장 상피 세포의 기저외측 표면에서 가장 효율적으로 감염된다는 것을 시사한다37. 따라서 단층을 점하는 것은 기저면을 노출시켜 감염성을 높일 것으로 예측된다. 효율적인 단층 감염은 또한 기저외측 표면에 접근할 수 있는 배양 배지를 포함하는 웰에 현탁된 폴리카보네이트 막에 HIO를 도금함으로써 달성할 수 있습니다. 그러나 플레이트와 폴리카보네이트 멤브레인 사이의 거리가 상대적으로 멀고, 폴리카보네이트 멤브레인 자체 및 웰 바닥의 플라스틱 표면은 에피형광 이미징에 적합하지 않습니다. 따라서 이 프로토콜에 설명된 채점 방법은 여전히 선호되는 접근 방식입니다. 점수 자체가 신호 교란으로 이어질 수 있다는 점을 감안할 때, 감염되지 않은 점수가 매겨진 대조군을 포함하는 것은 해석에 매우 중요합니다. 인간 노로바이러스와 같이 정점 막을 통해 효율적으로 감염되는 바이러스의 경우, 단층을 채점할 필요가 없다38.
모든 라이브 이미징 시스템과 마찬가지로 광독성은 HIO 단층을 사용하는 실험을 쉽게 혼동할 수 있습니다. 이미징 실험 전반에 걸쳐, 예상치 못한 액포화(vacuolization), 막 블리빙(membrane blebbing) 또는 스트레스의 다른 형태학적 지표를 모니터링하는 것이 중요하다39. 이러한 징후 중 하나라도 감지되면 여기의 지속 시간, 주파수 또는 전력을 줄여야 합니다. 신호 대 잡음비를 높이는 것은 종종 장기적인 세포 건강을 희생시키므로 경험적으로 파라미터를 최적화하는 것이 중요합니다. 시간이 지남에 따라 기준선 형광 강도의 감소로 나타나는 광표백은 세포 스트레스의 전조이며 피해야 합니다.
이미징 데이터의 시각성으로 인해 조사관은 정량적 분석보다 정성적 분석을 선호할 수 있습니다. 그러나 다른 양식과 마찬가지로 재현 가능한 결론을 위해서는 정량화가 필요합니다. 정량적 이미지 분석은 단일 원고에서 다룰 수 있는 것보다 훨씬 더 복잡하지만 몇 가지 핵심 사항을 강조하는 것이 좋습니다. 첫째, 일관된 정량 분석에는 일관된 획득이 필요합니다. 주어진 획득 파라미터 세트에 대해 개발된 분석 파이프라인은 다양한 주파수, 노출 시간, 레이저 출력 또는 파장에서 획득한 이미지에는 효과적이지 않을 수 있습니다. 둘째, 감염의 다양성은 바이러스 유도 칼슘 신호의 빈도에 큰 영향을 미칩니다. 따라서 시야당 감염된 세포의 수를 평가하고 치료 조건 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 것이 중요합니다. 또는 신호 주파수를 시야당 감염된 세포 수로 정규화하면 오류를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 최근에 개발된 mNG 기반 칼슘 지표(NEMO)는 세포(40)에서 절대 Ca2+ 농도를 측정하기 위한 유망한 접근법을 제공하지만, 대부분의 바이오센서는 생물학적 시스템에 대한 상대적인 정보만을 전달한다. 따라서 배경 빼기, 정규화 및 컨트롤과의 비교가 중요합니다.
이 프로토콜은 바이러스 감염 중 칼슘 이미징에 중점을 두지만 일반적인 접근 방식은 쉽게 적용할 수 있습니다. 바이러스 감염은 대체 치료 조건으로 쉽게 대체될 수 있으며, 다양한 세포 경로와 과정을 모니터링하기 위한 바이오센서가 계속 증가하고 있습니다. 모든 프로토콜 조정에서 연구자는 분석을 최우선으로 생각하여 명확하고 정량화 가능한 결과를 가진 실험을 설계해야 합니다.
전반적으로, 라이브 이미징은 타의 추종을 불허하는 시간적 해상도를 제공하여 매우 역동적인 프로세스의 특성화를 향상시킵니다. 오가노이드를 실시간 이미징 실험에 통합하면 생리학적으로 관련된 실제 조직에서 이러한 과정을 관찰할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜이 실험 설계 및 최적화를 촉진하여 연구자들이 세포 및 조직 신호 전달의 새로운 측면을 발견할 수 있기를 바랍니다.

칼슘은 세포 생리학을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 널리 보존된 두 번째 전달자이다1. 생리적 조건에서 강한 전하, 작은 크기 및 높은 용해도를 감안할 때 칼슘은 단백질 구조의 이상적인 조작제입니다. 따라서 칼슘은 전기화학적 신호를 효소, 전사 또는 전사 후 변화로 변환하는 강력한 수단이 됩니다. 소포체(ER)와 원형질막을 가로지르는 엄격한 칼슘 농도 구배는 세포질 칼슘 농도의 급격한 변화를 가능하게 하는 높은 추진력을 생성합니다. 버퍼링과 활성 전송을 모두 포함하는 여러 메커니즘은 이 기울기를 긴밀하게 유지합니다. 정상적인 세포 기능을 위해 필요하기는 하지만, 이러한 유지는 에너지 비용이 많이 들기 때문에 스트레스 상태에서 특히 취약하다 2.
이와 같이, 세포질 내의 칼슘 조절 장애는 많은 종류의 세포 스트레스의 거의 보편적인 신호입니다. 대사 장애, 독소, 병원균, 기계적 손상 및 유전적 교란은 모두 칼슘 신호 전달을 방해할 수 있습니다. 자극에 관계없이, 전체 세포 수준에서 세포질 칼슘의 지속적이고 통제되지 않은 상승은 세포 사멸을 촉진하고 결국 괴사를 촉진할 수 있습니다 3,4. 그러나 진폭이 낮거나 주파수가 높은 세포질 칼슘 수치의 변화는 다양한 영향을 미친다2. 마찬가지로, 칼슘 변동의 결과는 그것이 발생하는 공간적 미세영역에 따라 달라질 수 있다5. 따라서 칼슘 수치를 모니터링하면 동적 신호 전달 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있지만, 이를 위해서는 상대적으로 높은 시간적 및 공간적 분해능을 사용한 샘플링이 필요합니다.
유전자 인코딩 칼슘 지표(GECI)는 살아있는 세포 시스템에서 연속 샘플링을 위한 강력한 도구입니다6. 가장 널리 사용되는 GECI는 GCaMP로 알려진 GFP 기반 칼슘 반응성 형광 단백질입니다7. 표준 GCaMP는 세 가지 뚜렷한 단백질 도메인, 즉 원형으로 치환된 GFP(cpGFP), 칼모듈린 및 M136의 융합입니다. 칼모듈린 도메인은 칼슘과 결합할 때 형태 변화를 겪어 M13과 상호 작용할 수 있습니다. 칼모듈린-M13 상호작용은 cpGFP의 구조적 변화를 유도하여 여기(excitation) 시 형광 방출을 증가시킵니다. 따라서 칼슘 농도의 증가는 GCaMP 형광 강도의 증가와 상관관계가 있습니다. 이들 센서는 세포질(cytosoli)이거나 특정 세포소기관(specific organelle)을 표적으로 할 수 있다8.
대부분의 조직과 마찬가지로 칼슘은 위장 상피 내에서 다양한 기능을 조절합니다. 장 상피는 영양분과 체액 흡수에 필수적이지만 병원균 침입이나 독성 물질을 피하기 위해 단단한 장벽과 면역 인터페이스를 형성해야 합니다. 칼슘 의존 경로는 이러한 거의 모든 중요한 기능에 영향을 미칩니다 9,10,11. 그러나 장 상피 내의 칼슘 신호 전달은 치료 표적으로서 유망한 잠재력과 함께 아직 미개척 분야로 남아 있습니다. 생체 내 장 상피 내 칼슘 역학을 모니터링하는 것은 여전히 어려운 일이지만, 인간 장 오가노이드(HIO)는 실험을 위한 적응 가능한 생체 외 시스템을 제공합니다12. HIO는 인간 장 줄기 세포에서 유래한 3차원(3D) 스페로이드이며, 분화 시 천연 장 상피의 세포 다양성 대부분을 재현합니다12.
이 프로토콜은 GECI를 발현하는 HIO를 엔지니어링한 다음 엔지니어링된 HIO를 라이브 셀 칼슘 이미징을 위한 단층으로 준비하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 칼슘 신호 전달을 방해하는 병리학적 조작의 예로 바이러스 감염을 제시하고 이러한 변화를 정량화하기 위한 분석적 접근 방식을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신 EDTA&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0.05% 트립신 EDTA&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원뿔형 튜브</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>코닝&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco 12634028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView 세포 배양 슬라이드, PS, 75/25 MM, 유리 바닥, 10 구획</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>플루오로비트</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>글루타맥스&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>인간 표피 성장 인자</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td>(variable)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 세포 배양 처리된 24웰 플레이트</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>밀리포어시그마</td><td>TR1003G SB202190</td><td></td></tr><tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 효소, 페놀 레드 없음</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

칼슘 신호전달은 거의 모든 조직의 필수 조절자입니다. 장 상피 내에서 칼슘은 분비 활동, 액틴 역학, 염증 반응, 줄기 세포 증식 및 기타 많은 특성화되지 않은 세포 기능의 조절에 관여합니다. 따라서 장 상피 내의 칼슘 신호 역학을 매핑하면 항상성 세포 과정에 대한 통찰력을 제공하고 다양한 자극에 대한 고유한 반응을 밝힐 수 있습니다. 인간 장 오가노이드(HIO)는 장 상피를 연구하기 위한 고처리량 인간 유래 모델로, 칼슘 역학을 조사하는 데 유용한 시스템입니다. 이 논문에서는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표지자(GECI)를 사용하여 HIO를 안정적으로 transduction하고, 실시간 형광 현미경 검사를 수행하고, 이미징 데이터를 분석하여 칼슘 신호를 의미 있게 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 대표적인 예로, 3차원 HIO를 렌티바이러스로 transduction하여 녹색 형광 단백질 기반 세포질 GECI인 GCaMP6를 안정적으로 발현시켰습니다. 그런 다음 엔지니어링된 HIO를 단일 세포 현탁액으로 분산하고 단층으로 파종했습니다. 분화 후, HIO 단층을 로타바이러스에 감염시키거나 칼슘 반응을 자극하는 것으로 알려진 약물로 처리하였다. 온도 제어, 가습 라이브 이미징 챔버가 장착된 형광 현미경을 사용하면 감염되거나 약물로 처리된 단층의 장기 이미징이 가능합니다. 이미징 후 무료로 제공되는 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 획득한 이미지를 분석했습니다. 전반적으로, 이 연구는 HIO에서 세포 신호 전달을 특성화하기 위한 적응 가능한 파이프라인을 구축합니다.

그림 1A 는 GCaMP6를 안정적으로 발현하기 위해 형질도입된 3차원 인간 장 오가노이드를 포함하는 BMM 돔을 보여줍니다. 그림 1B 는 파종 후 24시간, 48시간 및 72시간에 단층으로 재도금된 동일한 오가노이드 라인을 보여줍니다. GCaMP6의 기능을 검증하기 위해 단층을 4분 동안 2초마다 형광 현미경으로 이미지화하고 ~20초 후에 100nM ADP를 배지에 첨가했습니다. ADP는 소포체에서 칼슘 방출을 유도하여 세포질 칼슘을 증가시킵니다. 각 노출에서 488nm 채널에서 감지된 형광 강도는 그림 1C에 표시되어 있습니다. 이 트레이스는 일정한 기준선 형광 강도와 ADP 추가 시 급격한 증가, 그리고 기준선으로 점진적으로 복귀하는 것을 보여줍니다. 응답이 매체 추가로 인해 발생할 수 있는 단순한 형광 강도의 변화가 아니라 실제 신호 이벤트인지 확인하기 위해 차량 제어가 포함됩니다.
HIO 단층을 채점하면 로타바이러스 감염의 효율성이 높아집니다. 점수를 매기는 기술은 다양하지만 그림 2A와 같이 단층 길이를 따라 단일 점수를 사용하여 일관된 감염을 얻는 것이 가장 쉽습니다. 형광 단백질을 발현하는 로타바이러스의 재조합 균주를 사용하면 실시간 이미징 중에 감염을 확인할 수 있습니다(그림 2B). 마커를 발현하지 않는 균주를 사용하는 경우 이미징 후 면역형광으로 감염을 감지할 수 있습니다. HIO 단층에서 세포의 운동성을 감안할 때 시간이 지남에 따라 감염된 단일 세포를 추적하기 어려운 경우가 많습니다. 대신, 감염을 확인하고 시야 간에 감염의 다양성이 일치하는지 확인하는 방법으로 종말점 염색을 사용하십시오(그림 2C).
HIO의 세포간 칼슘파는 그림 3A와 같이 정성적으로 관찰할 수 있습니다. 그러나 주어진 시야에서 칼슘파의 주파수를 결정하려면 정량적 분석이 필요합니다. 위 프로토콜의 6단계에서 설명한 성공적인 분할 단계는 그림 3A에 나와 있습니다. 그림은 원시 이미지(그림 3Ai), 이전 프레임의 픽셀 강도를 뺀 후의 이미지(그림 3Aii), 분할된 칼슘파(그림 3Aiii)를 보여줍니다.
이미징 실행 과정에서 각 시야에 대해 칼슘파를 분할하고 정량화한 후에는 다양한 조건에 노출된 단층의 파동 주파수를 비교하는 것이 유용한 경우가 많습니다. 그림 3B 의 스트립 차트는 모의 및 로타바이러스 접종 단층에서 시야당 칼슘파의 총 수를 보여줍니다. 이 예에는 RV의 두 가지 균주, 즉 인간 로타바이러스 균주(Ito HRV)와 mRuby를 발현하는 유인원 로타바이러스 SA11 재조합 균주(SA11-mRuby)가 포함됩니다. 모의 감염 대조군은 기준 칼슘파 주파수로 사용되고, 치료되지 않은 로타바이러스 감염 단층은 양성 대조군으로 사용되며, 로타바이러스에 감염되고 처리된 단층은 실험 조건입니다. ADP 수용체 억제제인 BPTU를 포함한 약물로 처리된 모의 감염 및 RV 감염 단층을 단방향 ANOVA로 두 대조군 조건과 비교할 수 있습니다. 이 데이터는 BPTU가 세포 간 칼슘파의 빈도를 효과적으로 감소시킨다는 것을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> 그림 1: jejunal 인간 장 오가노이드에서 GCaMP6s 발현 검증. (A) 렌티바이러스 형질도입 후, GCaMP 발현 HIO는 선별 및 다중 통과를 거쳤으며, 이는 가장 최근 통과 이후 7일 후에 여기에 나와 있습니다. 488nm 레이저로 자극하면 15μL 기저막 매트릭스에 3차원 스페로이드(Ai)로 도금된 형질도입된 HIO에서 GCaMP6s 발현이 분명합니다. 20x 대물렌즈를 사용하여 50% 레이저 출력으로 50ms 노출을 획득한 다음 함께 연결하여 전체 기저막 매트릭스 돔을 시각화했습니다. 4ms 명시야 노출(Aii)을 사용하여 유사한 프로세스를 수행했습니다. 명시야 이미지에서 돔 중앙의 어두운 HIO는 문화가 통과할 준비가 되었음을 나타냅니다. (B) HIO를 효소로 단세포 현탁액으로 소화한 후, 콜라겐 IV로 미리 코팅된 이미징 바닥판의 웰(직경 5mm)당 150,000개 세포 밀도로 다시 도금했습니다. 파종 후 72시간이 지났을 때 단층이 합류하여 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되었습니다. GCaMP의 기능을 검증하기 위해 4분 동안 2초마다 50% 레이저 출력으로 50ms 노출로 설정된 488nm 필터를 사용하여 이미지를 획득했습니다. (C) 여기에 표시된 트레이스는 이미징 과정에서 첫 번째 획득으로 정규화된 전장 형광 강도를 나타냅니다. 약 20초(화살표)에서 10번째 노출 후 100nM 아데노신 이인산(ADP)을 첨가하여 세포질 칼슘(빨간색)의 스파이크를 유도했습니다. 동일한 볼륨의 1x PBS를 추가해도 의미 있는 응답(파란색)을 이끌어내지 못했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> 그림 2: RV 감염을 촉진하기 위한 HIO 단층 점수 매기기. (A) 그림은 25G 바늘을 사용하여 단층을 스코어링하는 데 적합한 기술을 보여줍니다. (B) HIO 단층은 mRuby 형광 단백질(자홍색, 화살표)을 발현하는 RV의 재조합 균주에 감염되어 감염된 세포를 식별할 수 있었습니다. 대안적으로, 자연적으로 발생하는 RV 균주를 사용할 때, 면역형광을 사용하여 감염된 세포를 식별할 수 있습니다. (C) 표시된 이미지는 고정 후 4개의 서로 다른 HIO 단층, DAPI 염색(파란색) 및 로타바이러스 항원(자홍색)의 항체 표지에서 얻은 것입니다. 두 기법 모두 단층의 점수가 매겨진 부분 근처에서 우선적인 RV 감염을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> 그림 3: RV 유도 세포간 칼슘파의 분할 및 정량화. GCaMP6를 발현하는 RV 감염 HIO의 488nm 노출은 프로토콜을 사용하여 16시간 동안 1분마다 획득되었습니다. (A) 그림은 세포간 칼슘파 분할 과정을 보여줍니다. 먼저, 이전 획득(t-1)의 픽셀 값을 각 원시 이미지(Ai)에서 빼서 형광 강도(Aii)의 변화를 정량화합니다. 그런 다음 이전 프레임에서 실험적으로 최적화된 최소 강도 증가를 기반으로 하는 임계값이 적용됩니다. 그런 다음 세포간 칼슘파(Aiii)를 선택하고 단세포 칼슘 신호를 제외하기 위해 최소 연속 신호 영역에 대해 이미지를 필터링합니다. 이 처리를 통해 각 시야에서 칼슘파를 정량화할 수 있습니다. 이 실험에서 단층은 모의 감염되었거나, 인간 로타바이러스(HRV)의 ITO 균주에 감염되었거나, 비구조적 단백질 3(SA11-mRuby)의 다운스트림인 유전자 세그먼트 7에서 mRuby를 암호화하는 유인원 로타바이러스의 재조합 균주에 감염되었습니다. 감염된 단층은 ADP 수용체 억제제인 BPTU로 처리하거나 치료하지 않은 상태로 두었습니다. 그런 다음 단층을 8개의 서로 다른 위치에서 이미지화하고 각 시야의 칼슘파를 이 프로토콜에 설명된 파이프라인을 사용하여 정량화했습니다. 스트립 차트의 점은 평균과 SD를 표시하는 막대 차트에 겹쳐진 각 위치에서 감지된 칼슘파의 수를 나타냅니다. 단방향 분산 분석(One-way ANOVA)에 이은 Dunnett의 테스트는 RV의 두 균주 중 하나가 감염되지 않은 그룹의 세포간 칼슘파의 빈도를 증가시키는 반면, BPTU 치료는 RV에 의한 칼슘파 빈도의 증가를 방지합니다. **p<0.01, ***p<0.001입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>시약</td>
			<td>변환</td>
			<td>제어</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (1 mM 재고)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>폴리브렌(1mg/μL 재고)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>렌티바이러스</td>
			<td>변수*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *주석 참조</td>
			<td>400 μL까지</td>
			<td>400 μL까지</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 렌티바이러스 형질도입 배지. 형질주입 배지와 대조 배지를 각각 두 번째 및 세 번째 열에 표시된 부피의 시약을 결합하여 준비합니다. 세포당 10개의 렌티바이러스 형질도입 단위의 감염 다중성(MOI)을 목표로 합니다. 사내에서 포장된 LV의 경우 일반적으로 ~25-50μL의 농축 LV가 필요합니다. 가장 상업적으로 포장된 LV의 역가는 분석 증명서와 함께 제공됩니다.
보충 코딩 파일 1: ImageJ 매크로 스크립트는 일괄 처리를 통해 칼슘파 정량을 허용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

우리의 연구를 통해 우리는 바이러스가 장 상피 내에서 신호 전달을 어떻게 방해하는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 우리는 특히 바이러스에 감염된 세포가 감염되지 않은 이웃 세포를 조절하지 못하여 발병에 기여하는 방식을 이해하는 데 관심이 있습니다. 최근 로타바이러스에 감염된 세포는 ADP 펄스를 방출하는데, ADP는 감염되지 않은 주변 세포를 조절하지 못하고 바이러스 확산을 촉진하며 질병을 악화시킵니다.칼슘 영상은 신경 과학과 같은 분야에서 매우 인기가 있지만 상피 생물학이나 바이러스학을 연구하는 데 널리 사용되지는 않았습니다. 이 프로토콜은 칼슘 신호 전달 및 살아있는 바이러스 감염 상피 조직을 연구하기 위해 기존 기술 및 모델 시스템을 적용하는 접근 방식을 제공합니다. 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 발현하기 위해 오가노이드를 엔지니어링함으로써 당사의 접근 방식은 인간 장 상피의 세포 다양성을 재현하는 모델 시스템에서 일관되고 재현 가능한 장기 이미징을 가능하게 합니다.우리는 숙주와 바이러스 모두에 대한 바이러스 유도 파라크린 퓨린성 신호전달의 효과를 이해하는 것을 목표로 합니다. 우리의 향후 연구는 또한 이러한 유형의 신호전달이 다른 바이러스에 광범위하게 보존되는지 여부와 그 효과가 유사한지 여부를 결정할 것입니다.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

이 프로토콜은 기본 Lgr5-positve organoid 문화와 레트로 바이러스 전달의 후속 성능을 설명합니다. 이 시험관의 Organotypic에 소설에서 수행 할 기능 연구를 전달 유전자의 Cre 호텔 유도 과발현 또는 최저을 가능하게하고 있습니다   모델 시스템.

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

칼슘 신호의 생세포 영상은 단일층에서 배양된 안정적인 세포주에서 칼슘 동원을 연구하는 데 광범위하게 활용됩니다. 이 프로토콜은 복잡한 1차 조직에서 생세포 염료를 이용한 칼슘 신호전달의 생세포 형광 영상을 설명하며, 기계 학습 소프트웨어를 활용해 수천 개의 개별 세포의 형광 강도를 동시에 정량화하여 분석을 간소화합니다.

자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상

배우세요 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 이용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징 방법을. 이 기술은 장 상피에서 바이러스-숙주 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

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