Name: Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 배우세요 형광 현미경 매개변수 최적화를 통해 살아있는 Caenorhabditis elegans에서 내인성 화물의 축삭 수송을 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 시냅스 소포 전구체의 동역학을 연구하는 데 필수적입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>GFP-Tagged RAB-3를 사용하여 살아있는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 축삭 수송 분석 향상

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<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립(22mm x 22mm, No1); 골드 씰 커버 유리</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>현미경: Nikon Ti2 도립 현미경, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS 카메라, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA 오일 이멀젼 대물렌즈, ET525/36 방출 필터가 있는 488nm의 Nikon 광자극 스캐너</td><td>Nikon</td><td></td><td>Spinning Disc 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>&nbsp; NIS-elements AR</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td>Ti2용 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>일반 사전 세척 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Nematode strain</td><td>Identifier</td><td>Source</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161</td><td>&nbsp;</td><td>CGC (https://cgc.umn.edu/)에 입금됩니다.</td></tr></tbody></table>

optimizing visualization of axonal transport of endogenous cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 living caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

모델 시스템 및 측정 절차 개요 시냅스 소포 전구체의 축삭 수송을 시각화하기 위해 내인성 GFP 표지 RAB-3를 추적했습니다. 여기서 우리는 최근에 생성된 GFP::Flip-on::RAB-3 균주6을 사용하며, 여기서 세포 특이적 프로모터(glr-4p) 아래의 재조합 효소 Flippase의 발현이 DA9 운동 뉴런에서 내인성 RAB-3를 표지합니다. DA9은 양극성 운동 뉴런으로, 세포체는 항문에 가까운 복부 쪽의 동물 뒤쪽에 위치합니다(그림 1A). 그것은 복부 신경 삭수를 따라 앞쪽으로 달리는 짧은 수상돌기와 뒤쪽으로 뻗어 있는 긴 축삭돌기를 포함하고 있으며, commissure를 형성 한 다음 등쪽 신경삭을 따라 앞쪽으로 뻗어 있으며, 여기서 등쪽 근육과 성병 뉴런 22,23,24를 신경 자극하는 시냅스를 형성합니다. 우리는 비시냅스 영역에서 축삭 수송을 시각화합니다. 대부분의 수송 이벤트는 단일 초점면으로 캡처할 수 있습니다(그림 1A). 초기 광표백 단계는 이 영역에서 종종 일시 중지되는 경향이 있는 이 영역에서 고정 소포의 배경을 줄이기 위해 구현됩니다(그림 1B). 타임랩스 비디오는 3분 동안 녹화되고 비시냅스 영역을 따라 RAB-3 신호는 카이모그래프에 플롯되어 개별 전송 이벤트를 추출합니다(그림 1C).
축삭 수송 시각화를 최적화하기 위한 획득 파라미터 조정 많은 내인성 형광 태그 단백질의 낮은 신호 강도를 극복하려면 현미경의 획득 매개변수를 최적화해야 합니다. 운송 이벤트의 강력한 정량화를 위해 개별 운송 이벤트의 신호 강도는 세포질 배경 또는 일시 중지된 정지 화물에서 가능한 한 밝아야 합니다. 시냅스 소포 전구체는 종종 별개의 소포 풀에서 비시냅스 영역에서 일시 중지하는데, 이는 새로운 유입 소포의 감지를 방해하고 그들의 수송 흔적을 추적하기 어렵게 만든다7.
단일 초기 형광 표백 단계는 소포 풀에서 파생되는 형광 신호를 크게 줄여 새로 들어오는 소포의 움직임 감지를 향상시킬 수 있습니다(그림 2A). 표백 단계는 세포질 배경 강도를 통해 RAB-3 소포가 이동하는 신호를 약간만 향상시켰는데, 이는 RAB-3의 세포질 분율이 매우 낮기 때문일 수 있습니다(그림 2D).
비닝을 사용하면 픽셀 배열을 단일 픽셀로 결합하여 개별 전송 이벤트의 백그라운드에서 신호를 개선하기 위한 추가 계층이 제공됩니다. 2 x 2 비닝은 공간 해상도(여기서는 108.33nm/픽셀에서 216.7nm/픽셀로)를 절반으로 줄이며, 이는 여전히 개별 RAB-3 수송 입자를 추적하기에 충분하지만(그림 2B) 개별 소포의 신호 강도를 크게 향상시킵니다(그림 2D). 매우 높은 공간 해상도가 필요하지 않는 한, 비닝(binning)을 적용하여 다른 많은 축삭 화물을 시각화할 수도 있습니다.
다음으로, 노출 시간의 변화가 단일 전송 이벤트의 신호 강도를 어떻게 향상시킬 수 있는지 물었습니다. 특히 후속 이미징 시점 사이에 700ms로 최대 500ms의 노출 시간이 여전히 시냅스 소포 전구체를 추적할 수 있는 시간적 해상도를 제공한다는 것을 보여주기 위해 분석에 노출 시간을 포함시켰습니다(그림 2C,D).
Fiji를 이용한 kymographs 생성 및 분석 kymograph를 생성하고 그림 3의 단계에 따라 개별 운송 이벤트를 분석합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> 그림 1: 내인성 형광 RAB-3의 축삭 수송을 시각화하기 위한 모델 시스템의 개요. (A) 상부 패널: 후방-전방 및 복부-등쪽 축이 표시된 선충의 개요. 운동 뉴런 DA9는 파란색으로 표시되어 있습니다. 중간 패널: 표시된 DA9 구획화와 함께 상단 패널에 표시된 상자 영역을 확대합니다. En passant 시냅스는 녹색으로 표시되며 *는 항문을 나타냅니다. 축삭돌기는 외음부를 통과할 때까지 등쪽 신경삭에서 계속됩니다. 빨간색 상자는 비시냅스 영역의 영역을 나타냅니다. 하단 패널: 단일 초점면에서 근위 축삭돌기에서 RAB-3로 표지된 내인성 GFP의 컨포칼 현미경 이미지. 대부분의 RAB-3 신호는 시냅스 영역에 군집되어 있지만, 비시냅스 영역에는 RAB-3이 더 오래 일시 중지되는 소포 싱크가 있습니다. 비통시 영역은 빨간색 상자로 표시됩니다. 스케일: 20 μm. (B) 축삭 수송을 시각화하기 위한 타임랩스 기록의 대표 이미지. 고정 입자에 대한 개별 수송 입자의 추적성을 향상시키기 위해 비시냅스 영역은 처음에 광표백됩니다. 보라색 상자 영역의 아래쪽 패널은 전방(주황색 화살촉) 및 역행(파란색 화살촉) 이동 이벤트의 예를 보여줍니다. 패널은 위에서 아래로 연속된 시간점을 나타냅니다. (C) (B)의 타임랩스 기록은 카이모그래프(위치에 대한 시간의 2D 표현)로 표시되었습니다. 대각선은 기울기가 속도를 나타내는 이동 이벤트를 나타냅니다. 수직선은 정지된 이벤트를 나타냅니다. 보라색 상자는 (B)에도 표시되는 수송 이벤트를 강조하기 위한 kymograph의 확대이며, 전방(주황색) 및 역행(파란색) 수송 이벤트가 추적됩니다. 파선은 일시 중지 이벤트를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> 그림 2: 내인성 축삭 화물의 시각화를 개선하기 위해 획득 단계 및 매개변수 최적화. 내인성 GFP::RAB-3는 컨포칼 회전 디스크 현미경에서 단일 초점면의 이미지를 촬영하여 DA9 축삭의 비시냅스 영역에서 시각화되었습니다. 카이모그래프를 획득하여 전방(오른쪽에서 왼쪽으로) 및 역행(왼쪽에서 오른쪽) 방향(A-C)으로 개별 운송 이벤트를 시각화했습니다. (A) 카이모그래프는 (왼쪽 카이모그래프) 또는 통합된 표백 단계가 있는 RAB3 수송 이벤트를 보여줍니다. bleaching 단계는 연속적인 transport 이벤트(주황색 화살촉) 사이의 일시 중지 이벤트(노란색 화살표 머리로 표시)의 시각화를 개선합니다. (B) 2 x 2 비닝을 구현하면 희미한 RAB3 전송 이벤트의 신호 강도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 이미지는 300ms 노출 시간에 획득되었으며 (C) 노출 시간의 점진적인 증가(맨 왼쪽의 100ms에서 맨 오른쪽의 500ms로)는 개별 전송 이벤트의 신호 강도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 이미지는 2 x 2 비닝에서 초기 광표백 단계를 사용하여 획득했습니다. 모든 카이모그래프는 총 3분의 지속 시간을 표시하며 동일한 배율로 그려지므로 연속된 이미징 포인트 사이의 시간 경과가 길어 획득 시간 포인트가 적은 카이모그래프는 카이모그래프의 총 길이가 더 짧습니다. (D) (A-C)의 카이모그래프에서 배경 형광을 뺀 후 수송 이벤트당 신호 강도의 정량화. 비닝(binning)과 사진 표백제(photo bleach) 단계는 300ms 노출 시간에 획득되었습니다. 100 ms(n events = 27 in nanimals= 2), 200 ms(n events = 30 in nanimals = 2), 300 ms(n events = 88 in nanimals = 6), 500 ms(n events = 12 in nanimals= 1), 300 ms without (w.o.) binning (nevents = 31 in nanimals= 3), 300 ms with (w) binning (nevents = 88 in nanimals= 6) 및 300 ms 동안 n events를 사용한 통계적 비교, 표백이 있는 2 x 2 비닝(n이벤트= n 이벤트 = 88 in n동물 = 6) 및 표백 없음. 각 데이터 포인트는 무작위로 선택된 추적을 따라 단일 시점에서 배경(축삭의 세포질) 빼기 후 개별 RAB-3 수송 이벤트의 신호 강도를 나타냅니다. 노출 시간은 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교한 다음 Dunn의 다중 비교를 사용하여 비교했으며, 비닝 및 사진 표백은 쌍별 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> 그림 3: kymograph를 생성하고 개별 운송 이벤트를 측정하는 단계별 절차. (A) 비디오 녹화를 피지에 로드한 후 분할 선 도구를 사용하여 분석할 축삭 세그먼트의 길이를 따라 선을 추적합니다. (B) kymograph(오른쪽 패널)는 왼쪽 패널에 표시된 매개변수와 함께 Kymoreslicewide 플러그인을 사용하여 생성됩니다. (C) 개별 운송 이벤트는 리니어 라인 툴로 추적되고 ROI 매니저에 저장됩니다. 오른쪽 패널에는 결과 테이블을 생성하는 데 사용되는 측정 설정이 표시됩니다. (D) 표의 결과는 운송 매개변수를 계산하는 데 사용됩니다. 상자는 프로토콜의 methods 섹션에 설명된 중요한 매개 변수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

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SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

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Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다. (동영상) | JoVE Journal

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

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