Name: 쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 쥐 모델에서 교모세포종의 실시간 나노입자 분포를 관찰하는 투광자 현미경 기법. 형광 표지 산화철 나노입자를 활용해 약물 전달 메커니즘을 연구하고 혈액-뇌 장벽을 투과하는 치료제 분포를 시각화합니다.

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이 프로젝트에 장비와 인프라를 제공해 주신 Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging(SCi3) - 소동물 이미징 센터, NIH S10 Shared Instrumentation Grant(S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) 및 Porter Drive의 Stanford Preclinical Imaging Facility에 감사드립니다. 이 연구는 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(National Institute for Child Health and Human Development, 보조금 번호 R01HD103638)의 보조금으로 지원되었습니다. 스탠포드 대학의 Schnitzer Group에 감사드립니다. 산타 크루즈 대학교 Zuo 연구소; 보스턴 대학교 보스턴 포토닉 센터(Boston Photonic Center)의 신경혈관 이미징 연구소(Neurovascular Imaging Laboratory)에서 이광자 이미징 및 두개골 창 모델에 대한 교육적 토론을 진행했습니다.

마우스에서 2P-IVM을 사용한 뇌종양의 나노 입자 실시간 추적

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

두개창을 통해 2P-IVM을 사용하여 형광 표지된 산화철 NP의 종양 전달을 평가하는 실시간 in vivo NP 추적 방법을 제시합니다. 이 시술을 위한 수술 기법은 안정된 손과 고급 실험 수술 기술을 필요로 합니다. 살아있는 동물 체험으로 넘어가기 전에 사체나 유령을 사용하는 연습을 하는 것이 좋습니다. 이에 대한 대안으로 Hoeferlin 등은 로봇 드릴을 구현하여 열 손상을 줄이고, 수술 기법의 변동성을 최소화하며, 수술을 표준화했다22.
창의 크기는 또 다른 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 더 큰 창은 2P-IVM으로 종양의 더 큰 부분을 이미징할 수 있습니다. 문헌에서, 3-7 mm 사이의 크기가 기술되어 있다23. 그러나 더 큰 창문은 뇌 곡률을 수용할 수 없으며, 이는 국소 압력을 증가시킬 수 있다24. 이 제약을 극복하기 위해, 소위 "유리 두개골"이 대신 사용될 수 있다25. 전통적인 유리창과 비교하여 이 방법은 곡면 유리를 사용하여 뇌 곡률을 수용하여 피질에 가해지는 초점 압력을 줄이면서 더 큰 창을 만들 수 있습니다. 이러한 유형의 곡면 유리는 상업적으로 이용 가능하지 않으며, 곡면이 반사 아티팩트를 유발하여 이미징할 수 있는 창 영역을 제한하기 때문에 2P-IVM에서만 제한적으로 적용됩니다. 또 다른 대안은 실리콘 기반 윈도우(24)이다. 한편으로 이 방법은 만들 창의 크기와 형태에 대해 더 많은 유연성을 제공합니다. 또한 창문 파손 및 염증률 측면에서 고전적인 유리창과 유사한 결과가 보고되었습니다. 반면에, 폴리머 기반 창의 2광자 이미징 품질은 유리창보다 더 빠르게 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 장기 응용 분야에서는 실현 가능하지 않다26. 얇아진 두개골 창은 또 다른 대안입니다. 기존 유리창보다 덜 침습적이지만 여기에 설명된 것과 동일한 기술을 사용하여 교모세포종 세포 이식을 허용하지 않습니다. 또한, 일관된 두개골 두께를 달성하는 것은 어려우며, 결과적으로 2P-IVM27에서 중요한 아티팩트를 유발할 수 있다.
이식되는 세포주와 교모세포종의 양은 연구 일정을 계획할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 사항입니다. C6 쥐 신경교종 세포주는 교모세포종 연구에서 가장 널리 사용되는 세포주 중 하나입니다. 쥐와 생쥐에서, 5 x 104 및 5 x 106 사이의 세포 수가 두개내 착상에 대해 보고되었다 27,28,29,30,31. 일반적으로 더 많은 수의 세포를 이식할 때 더 빠른 종양 성장을 기대할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 1 x 105 세포를 이식하고 이식 후 11일과 12일에 이미징을 수행했습니다. Xin 등은 BALB/c 누드 마우스에 1 x 105 C6 세포를 이식하고 이식 후 7일째에 MRI에서 진행된 교모세포종과 15일 후 사망률 증가를 감지했다고 보고했습니다30. 이에 비해, Jia et al.은 더 많은 수의 세포(1 x 106)와 동일한 마우스 균주를 사용하였고, 교모세포종 조직(32)의 옅은 Evans 청색 염색에 의해 입증된 바와 같이, 약간 파괴된 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가진 MRI에서 7일째에 작은 종양 덩어리를 검출하였다. 14일째에는 에반스 블루 얼룩이 7일째보다 더 강했는데, 이는 BBB가 심하게 교란되었음을 나타냅니다. 차례로, 종양의 성장은 동물을 실험에 얼마나 오래 머물게 할 수 있는지에 영향을 미친다. 이는 종단 영상 연구에서 동물 복지에 대한 중요한 고려 사항입니다. 만성 두개골 창은 이식 후 최대 6개월 동안 이미징에 적합한 것으로 보고되었다26.
이 프로토콜에 사용된 나노 입자는 산화철과 형광단 성분으로 구성됩니다. 가능한 응용 분야에는 새로운 치료 약물의 종양 전달 조사, 세포 치료제, 종양 혈관 구조 및 종양 미세 환경에 대한 중재가 포함됩니다. 다양한 약물 후보 물질과 병용 요법을 세포 및 분자 수준에서 평가할 수 있습니다. NP의 산화철 성분은 2P-IVM 외에도 MRI 또는 자분 이미징을 사용한 다중 모드 이미징을 가능하게 합니다. MRI는 임상적으로 유의미한 영상 양식을 나타내지만, 그 해부학적 해상도는 생체 내 현미경검사(33)보다 열등하다.
이 방법에는 특정 제한 사항도 있습니다. 생쥐 뇌 지도에 따른 뇌 좌표는 C57BL/6J 생쥐에 대해 표준화되어 있으며 생쥐 균주, 성별 및 연령에 따라 조정되어야 합니다. 더욱이, 이광자 이미징을 사용하면 약 450μm의 제한된 깊이에만 접근할 수 있다9. 따라서 2P-IVM으로 종양의 부분적인 특성 분석만 가능하며, 종양 특성의 지역적 차이를 놓칠 수 있습니다. 또한 NP 투여 후 두 개의 시점만 포함되었습니다. 정맥 투여 후 더 많은 시점을 포함한 향후 연구를 통해 종양 미세환경에서 NP의 시공간 거동을 보다 자세히 분석할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 GBM의 마우스 모델에서 2P-IVM을 사용하여 형광 표지된 산화철 나노입자의 종양 전달을 평가했습니다. 이 방법은 다양한 연구 분야에 맞게 쉽게 수정할 수 있으며 신경 과학 분야에서 생체 내 뇌 이미징을 위한 중요한 도구입니다.

2광자 생체 내 현미경(2P-IVM)은 생체 조직1을 시각화할 수 있는 형광 이미징 기술입니다.
1990년대에 처음 개발된 2P-IVM은 다양한 전임상 모델에서 망막2, 신장3, 소장4, 달팽이관5, 심장6, 기관7 및 뇌의 생체 내 분석에 사용되었습니다 8,9. 신경과학 분야에서, 2P-IVM은 알츠하이머병11, 파킨슨병12 및 교모세포종(GBM)13,14,15,16과 같은 신경계 질환을 연구할 뿐만 아니라, 깨어 있는 동물10에서 건강한 뇌의 실시간 이미징을 위한 기술로서 중요성을 얻고 있다.
2P-IVM은 교모세포종 발병 중 종양 미세환경을 연구하기 위한 훌륭한 솔루션을 제공합니다. 일부 이전 연구는 in vitro17 및 ex vivo 모델18에 초점을 맞춘 반면, 다른 연구에서는 교모세포종을 검사하기 위해 orthotopic19 및 xenotropic20 in vivo 모델을 구현했습니다. Madden et al.은 마우스 모델13에서 CNS-1 쥐 신경교종 세포주의 네이티브 이미징을 수행했습니다. Ricard 등은 orthotopic GL261-DsRed 쥐 모델을 사용하여 2P-IVM14에서 종양 부위의 혈관을 강화하기 위해 형광단의 정맥 투여를 수행했습니다.
여기서는 교모세포종의 orthotopic 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자(NP)의 종양 전달을 추적하기 위해 2P-IVM을 적용합니다. 두개창을 사용하여 이 방법을 사용하면 뇌에서 NP의 실시간 시공간 분포를 자세히 연구할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 염화나트륨 주입 용액</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD</td><td>Luer-Lok 주사기, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>써모 피셔</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>2광자 현미경</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>알코올 애플리케이터, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>알코올, 스프레이 병</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap 논스틱 알루미늄 호일</td><td></td></tr><tr><td>마취기</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>마취 모니터링&nbsp;</td><td>켄트 사이언티픽&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. 설치류 펄옥시미터</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제 (100개), 액체</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>베타딘 적용기</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>생검 펀치, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine sustained release</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1.0 mg/mL</td><td>제네릭 약물을 대신 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>C6 쥐 신경교종 세포주</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>캐뉼라</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>카프로펜</td><td>화이자&nbsp;</td><td>리마딜, 50mg/ml</td><td>제네릭 약물을 대신 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/바이알</td><td>제네릭 약물을 대신 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>치과 시멘트</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>치과 시멘트 키트, 투명, 2 성분</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>제네릭 약물을 대신 사용할 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>회복, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>드레이프&nbsp;</td><td>카디널 헬</td>스 <td>바이오 쉴드 랩</td><td></td></tr><tr><td>드릴</td><td>세양 마이크로테크</td><td>에스코트 프로, B08350</td><td></td></tr><tr><td>드릴 팁&nbsp;</td><td>헤이거 & Meissinger GmbH</td><td></td><td>REF310104001001005 크기 005, 미국 1/4</td></tr><tr><td>FIJI 이미징 분석 소프트웨어</td><td>국립 보건 연구소</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>펜치</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>거즈</td><td>Fisher HealthCare</td><td>멸균 면 거즈 패드, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>에티콘 주식회사&nbsp;</td><td>Surgifoam 흡수성 젤라틴 스폰지, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&nbsp;</td><td>셀포인트 사이언티픽&nbsp;</td><td>Germinator 500, No. 11688</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립, 5mm 지름</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel 커버 유리&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>장갑, 비멸균</td><td>Fisher Scientific</td><td>니트릴 무분유 건강 진단 장갑</td><td></td></tr><tr><td>장갑, 멸균</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>교회 & 드와이트</td><td>나이어 헤어 리무버 로션&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro; L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 없이 Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>헤드 바</td><td>Hongway</td><td>5mm 내경 O-링</td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>설치류 워머 X2</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2&프라임;</td><td></td></tr><tr><td>산화철 나노 입자</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Ferahemé ferumoxytol 주사제, 510 mg / 17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, 스트레인 005557</td><td></td></tr><tr><td>현미경 (수술)</td> <td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>나노 입자</td><td>사용자 정의</td><td></td><td>플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지된 산화철 나노 입자(Ferumoxytol)</td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>주요 제약</td><td>Lubrifresh P.M. 야간 연고, 203964</td><td></td></tr><tr><td>산소</td><td>린데 가스 & 이큅먼트 Inc.&nbsp;</td><td>고압 스틸 K 스타일 실린더, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 컵</td><td>Georgia-Pacirif 소비자 제품</td><td>Dixie 부분 컵, 2 oz., 플라스틱, 투명, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex 스테인레스 스틸 일회용 메스</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>실란트</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>일회용 실험실 가운</td><td>하이테크 변환</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>멸균 진공 병 상단 여과 시스템</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 상자</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>수술용 장갑</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>수술용 접착제, 3M Vetbond 티슈 접착제</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Tail vein cathether</td><td>Custom</td><td></td><td>Sillicone 튜빙과 연결된 두 개의 30 G 캐뉼라로 구성되어 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), 페놀 레드</td><td>없음 Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolett 토치</td><td>봄 햇빛 기술</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 모델에서 교모세포종의 two-photon intravital microscopy

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

뇌종양에 정맥 주사로 투여되는 암 치료제의 전달은 혈액-뇌 장벽에 의해 제한됩니다. 생체 내 뇌종양에서 거대분자의 축적 및 분포를 직접 이미지화하는 방법은 전임상 모델에서 약물 전달을 이해하고 최적화하는 능력을 크게 향상시킬 것입니다. 이 프로토콜은 교모세포종(GBM)의 마우스 모델에서 2광자 생체 내 현미경(2P-IVM)을 사용하여 정맥 투여된 형광 표지 나노 입자의 실시간 생체 내 추적 방법을 설명합니다.
프로토콜에는 실험 동물의 마취 및 진통, 두개골 창 만들기, 교모세포종 세포 이식, 헤드 바 배치, 2P-IVM 연구 수행 및 장기 추적 연구를 위한 수술 후 관리를 포함한 절차에 대한 다단계 설명이 포함되어 있습니다. 대표적인 2P-IVM 이미징 세션과 이미지 분석을 보여주고, 이 기술의 장점과 단점을 살펴보고, 잠재적인 응용 분야에 대해 논의합니다.
이 방법은 생체 내 전임상 뇌 영상 분야의 다양한 연구 질문에 대해 쉽게 수정하고 적용할 수 있습니다.

여기에서 우리는 두개골 창 수술을 수행하고 교모세포종(n=5)의 NSG 마우스 모델에 C6 세포를 생착시켰습니다. 창 제작과 관련된 모든 구성 요소(그림 1A)를 적절하게 밀봉하면 장기 이미징을 위한 창의 내구성을 보장하고 이환율을 줄일 수 있습니다. in vivo 2P-IVM(그림 2)에 맞게 조정된 스테이지를 사용하여 주요 움직임 아티팩트 없이 최대 2시간 동안 마취 상태에서 동물을 이미징할 수 있었습니다. GBM 함유 마우스에서 나노 입자를 정맥 투여한 후 약 10분 후, 2P-IVM은 FITC 표지 나노 입자의 혈관 내 국소화와 일치하는 종양 부위 혈관의 녹색 형광 신호를 보여줍니다. 혈관 외부에서 소량의 녹색 형광 신호만 나타나며, 이는 NP의 유출이 시작됨을 나타냅니다(그림 3A). 혈관 외 공간에서 발생하는 FITC 신호의 증가가 관찰되며, 이는 진행된 유출과 일치합니다(그림 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> 그림 1. 두개골 창 배치, 개두술, 이식 및 이미징. (A) 두개골 창의 해부학적 배치의 단면. 헤드 바는 금속이 없기 때문에 이광자 생체 내 현미경 검사 외에도 자기 공명 영상 또는 자기 입자 영상을 수행할 수 있습니다. (B) 개두술(왼쪽), 세포 이식(가운데) 및 2광자 생체 내 현미경(오른쪽)의 개요(위 줄) 및 세부 보기(아래 줄). 두개골을 열면 표재성 출혈이 발생하고(왼쪽) 빠르게 재흡수됩니다(가운데). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> 그림 2. 무대의 CAD(Computer-Assisted Design). 바이트 바, 헤드 바 안정화, 높이 및 각도 조정용 나사를 포함하여 생체 내 2광자 생체 내 현미경 검사에 사용되는 스테이지의 CAD. 3D CAD 파일은 보충 코딩 파일 1에서 찾을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> 그림 3. In vivo 2광자 생체 내 현미경 이미지. 나노 입자 정맥 투여 후 (A) 10분 및 (B) 24시간 후에 얻은 이미지. 교모세포가 적색 스펙트럼(왼쪽)에서 형광 신호를 방출하는 반면, 뇌 조직의 나노 입자는 녹색(오른쪽)으로 시각화됩니다. # 은 외래 NP를 나타내고 * 는 혈관을 나타냅니다. 제한된 수의 입자만 유출을 거쳤으며 NP 투여 후 10분 후에 종양 세포 근처에서 볼 수 있습니다. 교모세포종 세포 부위에 풍부한 입자가 보였는데, 이는 NP 투여 후 24시간 동안 유출이 있었음을 시사한다. 나노 입자는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 산화철 나노입자(페루목시톨)로 구성됩니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. 약어: 2P-IVM: 2광자 생체 내 현미경, RFP: 적색 형광 단백질, GBM: 교모세포종, FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트, NP: 나노 입자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 1: 스테이지의 3D CAD 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

교모세포종은 가장 흔한 원발성 뇌암 중 하나이며 빠른 성장과 낮은 기대 수명과 관련이 있습니다. 교모세포종에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 것은 치료제의 전달이 혈액 뇌 장벽에 의해 제한되기 때문에 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 뇌에서 거대분자의 축적 및 분포를 직접 이미지화하는 방법은 약물 전달을 이해하고 최적화하는 능력을 크게 향상시킬 것입니다.2광자 현미경은 교모세포종의 전임상 모델에서 나노 입자의 실시간 분포를 연구하기 위한 우아한 솔루션을 제공합니다. 이 연구에 사용된 나노 입자를 변형시킴으로써 세포 및 분자 수준에서 다양한 약물 후보 및 병용 요법의 전달을 조사할 수 있습니다. 이광자 생체 내 현미경 외에도 이러한 나노 입자의 산화철 성분은 MRI 또는 MPI를 사용한 다중 모드 이미징을 가능하게 합니다.미래에는 영상 시설이 암을 조기에 발견하는 데 도움이 될 수 있으며, 이를 통해 악성 종양에 대한 보다 효과적인 치료법으로 이어질 수 있습니다. 이를 달성하기 위한 한 가지 방법은 이광자 생체 내 현미경을 양전자 방출 단층 촬영 및 광음향 초음파와 같은 다른 이미징 양식과 병합하는 것입니다.

two-photon-intravital-microscopy-of-glioblastoma-in-a-murine-model

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

C57BL에 GL261 셀 / 6 마​​우스의 Intracranial 이식은 인간 glioblastoma multiforme의의 특징 중 많은 것들을 요점을 되풀이하다 악성 gliomas을 생산하고 있습니다. 우리는 우리가 사용할 수 있도록 안정 루시페라제 표현 GL261 세포를...

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

이 비디오에서는 이식된 두개골 창을 통해 마우스 모델에서 사전 주입된 암세포의 생체 내 이미징을 수행합니다. 이 고해상도 타임 랩스 이미징 기술을 통해 살아있는 쥐에서 암세포의 동적 거동을 연구할 수 있습니다.

마우스 모델의 두개창 기반 생체 내 이미징: 쥐 모델의 뇌에서 사전 주입된 암세포의 행동을 연구하기 위한 이미징 기술

이 비디오에서는 마우스 모델에서 형광 단백질이 태그된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT에 대해 설명합니다. 이 기술은 분자 수준에서 항종양 치료제의 효과를 밝히는 데 유용합니다.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

출처: Clark, AJ, et al. 교모세포종에 대한 면역적격 동물 모델의 생물발광 영상. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 루시페라아제 발현 종양 세포와 루시페린을 사용하여 종양 성장을 비침습적으로 정량화하는 면역 적격 마우스 모델에서 교모세포종 진행을 추적하기 위한 생물 발광 이미징을 보여줍니다.

교모세포종에 대한 면역적격 마우스 모델의 생물발광 이미징

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

GL261 신경교종 세포는 교모세포종의 유용한 면역 역량 동물 모델을 제공합니다. 이 프로토콜의 목표는 생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 두개내 종양 성장을 모니터링하기 위한 적절한 기술을 시연하고, 종양 면역학 연구를 위한 루시페라제 변형 GL261 세포의 유용성 및 교모세포종 치료를 위한 면역 요법 접근법을 검증하는 것입니다.

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

배우세요 쥐 모델에서 교모세포종의 실시간 나노입자 분포를 관찰하는 투광자 현미경 기법. 형광 표지 산화철 나노입자를 활용해 약물 전달 메커니즘을 연구하고 혈액-뇌 장벽을 투과하는 치료제 분포를 시각화합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

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