Name: small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 AQRNA-seq을 활용한 small RNA 정량 분석 방법으로 Mycobacterium bovis BCG의 기아 유도 휴면 상태에서 tRNA 풀 변화를 연구합니다. 이 기술은 기존 RNA-Seq의 한계를 극복하고 정확한 RNA 분자 수준 정량을 제공하여 질병 바이오마커 발굴과 단백질 번역 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

본 연구의 저자들은 AQRNA-seq 기술7을 설명하는 원본 논문의 저자들에게 감사한다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856)과 싱가포르 국립연구재단(National Research Foundation of Singapore)의 보조금으로 이루어졌으며, 싱가포르-MIT 연구 및 기술 항균 내성 연합(Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG)을 통해 이루어졌습니다.

AQRNA-seq를 사용한 tRNA 역학 분석

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D.는 출판된 저작물과 관련된 두 개의 특허(PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1)의 발명자입니다.

AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우는 시료 내 RNA의 캡처를 극대화하고 역전사 중 중합효소 감소를 최소화하도록 설계되었습니다7. 2단계 링커 결찰을 통해 새로운 DNA 올리고(링커 1 및 링커 2)가 과도하게 결찰되어 시료 내 RNA를 완전히 보완합니다. 과잉 링커는 단일 가닥 DNA에 특이적인 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제인 RecJf를 사용하여 효율적으로 제거할 수 있으며, 접합된 산물은 그대로 유지됩니다. 또한 AlkB 처리는 역전사 중에 중합효소 감소를 유발할 수 있는 RNA18의 메틸 변형을 감소시켜 인공물 절단 cDNA 산물의 문제를 완화합니다. AQRNA-seq는 ligation 및 amplification 효율성을 체계적으로 최적화하기 위해 최초로 보고된 분석법입니다. AQRNA-seq는 정량적 정확성과 바이어스 아티팩트 부재로 검증되었으며, miRNA 프로파일링 연구를 위한 가장 정확한 응용 분야로 입증되었습니다.</...

대규모 병렬 염기서열분석(MMS)이라고도 하는 차세대 염기서열분석(NGS)은 DNA 단편화, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 ligation, 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 증폭, DNA 염기서열분석, 단편 염기서열을 게놈으로 재조립하는 DNA 염기서열 분석 기술입니다. RNA 염기서열(RNA-seq)에 대한 NGS의 적응은 RNA 전사체와 그 변이체를 식별하고 정량화하는 강력한 접근법입니다1. RNA 라이브러리 준비 워크플로우 및 생물정보학 분석 파이프라인의 혁신적인 개발과 실험실 기기의 발전은 RNA-seq 애플리케이션의 레퍼토리를 확장하여 엑솜 시퀀싱을 넘어 non-coding RNA 프로파일링2, 단일 세포 분석3, 공간 전사체학 4,5, 대체 스플라이싱 분석6과 같은 고급 기능 오믹스로 발전했습니다, 다른 사람들 사이에서. 이러한 첨단 RNA-seq 방법은 정상 및 병든 세포 및 조직에서 전사체의 정량 분석을 통해 복잡한 RNA 기능을 밝힙니다.
RNA-seq의 이러한 발전에도 불구하고 몇 가지 주요 기술적 특징이 분석법의 정량적 능력을 제한합니다. 대부분의 RNA-seq 분석법은 실험 변수(즉, 생물학적 시료 및/또는 생리학적 상태) 간의 RNA 수준 변화를 정밀하고 정확하게 정량화할 수 있지만, 시료 내 RNA 분자 수준의 정량적 비교는 제공할 수 없습니다. 예를 들어, 대부분의 RNA-seq 분석법은 발현된 tRNA의 세포 풀에서 개별 tRNA 동수용체 분자의 상대적 복제 수를 정확하게 정량화할 수 없습니다. 동반 간행물7에서 강조된 바와 같이, RNA-seq에 대한 이러한 제한은 RNA 구조의 여러 특징과 라이브러리 준비의 생화학에서 발생합니다. 예를 들어, 3' 및 5'-말단 염기서열분석 링커를 RNA 분자에 부착하는 데 사용되는 연결 효소의 활성은 RNA의 말단 뉴클레오티드와 염기서열분석 링커의 정체성에 의해 크게 영향을 받습니다. 이로 인해 링커 결찰(linker ligation)의 효율성에 큰 변화가 발생하고 염기서열분석 판독(sequencing read) 8,9,10에서 아티팩트(artifactual)가 크게 증가합니다.
두 번째 한계는 RNA 분자의 고유한 구조적 특성에서 발생합니다. 특히, epitranscriptome의 수십 개의 전사 후 RNA 변형에서 RNA 2차 구조 형성 및 동적 변화는 역전사 중에 중합효소 감소 또는 돌연변이를 유발할 수 있습니다. 이러한 오류는 불완전하거나 잘린 cDNA 합성 또는 변형된 RNA 염기서열을 초래합니다. 이 두 가지 현상 모두 2차 구조 또는 일부 변형을 매핑하는 데 활용될 수 있지만, 후속 라이브러리 준비 단계에서 절단된 cDNA를 캡처하지 못하거나 데이터 처리에서 참조 데이터 세트(11,12)와 일치하지 않는 돌연변이 서열이 발생하는 경우 RNA-seq의 정량적 정확도가 저하됩니다. 더욱이, RNA 전사체의 엄청난 화학적, 길이 및 구조적 다양성과 긴 RNA를 균일하게 단편화할 수 있는 도구의 부족으로 인해 대부분의 RNA-seq 방법의 적용 가능성이 모든 RNA 종에 감소합니다13.
AQRNA-seq(절대 정량 RNA 염기서열분석) 분석법은 정량 정확도를 제한하는 이러한 기술적, 생물학적 제약 중 몇 가지를 제거하기 위해 개발되었다7. RNA 염기서열분석 라이브러리 준비 중 capture, ligation 및 증폭에서 염기서열 의존적 바이어스를 최소화함으로써 AQRNA-seq는 다른 방법에 비해 우수한 선형성을 달성하여 963개의 miRNA로 구성된 참조 라이브러리의 75%를 2배 정확도 내에서 정확하게 정량화합니다. 염기서열분석, 판독 횟수와 RNA 풍부도의 이러한 선형 상관관계는 RNA 올리고뉴클레오티드 표준물질의 가변 길이 풀 분석과 노던 블로팅(northern blotting)과 같은 직교 방법에서도 관찰됩니다. 염기서열분석 판독 횟수와 RNA 풍부도 간의 선형성을 통해 AQRNA-seq는 시료 내 모든 RNA 종에 대한 정확하고 절대적인 정량화를 달성할 수 있습니다.
다음은 AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우를 위한 프로토콜과 함께 제공되는 다운스트림 데이터 분석 파이프라인에 대한 설명입니다. 이 방법은 결핵의 Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin(BCG) 모델에서 기아 유발 휴면 및 후속 소생술 중 tRNA 풍부의 역학을 설명하기 위해 적용되었습니다. 염기서열분석 데이터의 탐색적 시각화를 위한 결과가 제시되었으며, 후속 클러스터링 및 차등 발현 분석을 통해 다양한 표현형과 관련된 tRNA 풍부도에서 식별 가능한 패턴을 밝혀냈습니다.

<table><tbody><tr><td>2-케토글루타레이트&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>작업 용액(1M)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>2100 바이오분석기 기기</td><td>애질런트</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M은 T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA 리가제 반응 완충액(10X), PEG 8000(1X) 및 ATP(100mM); 작업 용액 (10mM)을 준비하고 -20 °C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>상온에서 보관</td></tr><tr><td>암모늄 철(II) 황산염 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>작업 용액(0.25 M)을 준비하고 -20°C에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>바이오분석기 소RNA 분석</td><td>애질런트</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>Small RNA Analysis는 입력 RNA의 품질과 효소 반응(예: Linker 1 ligation)의 효율성을 확인하는 데 사용됩니다</td></tr>.<tr><td>소 혈청 알부민 (BSA; 10 mg/mL)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>이 제품은 2022년 12월 15일에 중단되었으며 재조합 알부민, 분자 생물학 등급(NEB B9200)으로 대체되었습니다.</td></tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>마크롱 정밀 화학</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demethylase&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demethylase는 rtStar tRNA 전처리 및 First-Strand cDNA 합성 키트 (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드 (dNTP) 솔루션 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (구성 요소 #: N0447LVIAL)</td><td>이 dNTP 솔루션 믹스는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP (각각 10 mM)의 등몰 농도를 포함하고 있습니다.</td></tr> <tr><td></td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>가열 블록은 QIAquick&nbsp와 함께 사용됩니다. 젤 추출 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>염료Ex&nbsp; 2.0 스핀 키트&nbsp;</td><td>키아겐</td><td>63204&nbsp;</td><td>짧은 잔여물(예: 길이가 10bp 미만인 올리고)을 제거하는 데 효과적</td></tr>입니다.<tr><td>전기영동 전원 공급 장치</td><td>, Bio-Rad Labrotories</td>, <td>PowerPac 300</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf PCR Tubes(0.5 mL),</td> <td>Eppendorf</td><td></td> 0030124537 <td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes(0.5 mL),</td> <td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes(1.5 mL),</td> <td>Eppendorf</td><td></td> 022363204 <td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes(2 mL),</td> <td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 (에탄올), 순수</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023&nbsp;</td><td>순수 에탄올은 Zymo Research의 Oligo Clean 및 Concentrator Kit와 함께 사용됩니다</td></tr><tr><td>겔 이미징 시스템</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 염료, 보라색(6X), SDS 없음</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (component #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S에는 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 및 Gel Loading Dye, 보라색(6X) 포함, SDS 없음</td></tr><tr><td>GENESYS 180 UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>분광 광도계는 맥주의 법칙</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td>를 사용하여 올리고 농도를 측정하는 데 사용됩니다 <td>작업 용액 (1M, pH = 8 NaOH)을 준비하고 -20 °deg에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>염산(HCl)&nbsp;</td><td>VWR Scientific 제품</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>작업 용액(5M)을 준비하고 주변 온도에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>이소프로필 알코올 (이소프로판올), 순수</td><td>마크론 정밀 화학물질</td><td>3032-16</td><td>이소프로판올은 QIAquick&nbsp와 함께 사용됩니다. 젤 추출 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>작업 용액(0.5M)을 준비하고 -20°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (component #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L contains RecJf (30 U/&mu; L) 및 NEBuffer 2(10X); -20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물 (DEPC 처리되지 않음)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>올리고 클린 & 집중 장치 키트&nbsp;</td><td>자이모 리서치</td><td>D4061&nbsp;</td><td>상온에서 보관</td></tr><tr><td>PEG 8000 (50% 용액)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M은 T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA 리가제 반응 완충액(10X), PEG 8000(1X) 및 ATP(100mM); 작업 용액 (10mM)을 준비하고 -20 °C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Peltier Thermal Cycler</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>페놀:콜로로포름:이소아밀&nbsp; 알코올 25:24:1 pH = 5.2&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 버퍼 (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript 역전사효소</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIA빠른&nbsp; 젤 추출 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>이 키트는</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (구성 요소 #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (구성 요소 #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S에는 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 및 Gel Loading Dye, Purple(6X), SDS</td></tr> <tr><td>없음 포함RecJf&nbsp; (30 U/&무; 엘)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L(구성 요소: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L에는 RecJf(30 U/&mu; L) 및 NEBuffer 2(10X); -20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>RNase 억제제(쥐; 40 U/&mu; 엘)&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0314L&nbsp;( 구성 요소 # : M0314LVIAL)</td> <td>-20 &deg에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>시퀀AMP&nbsp; DNA 중합효소&nbsp;</td><td>타카라</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509에는 SeqAMP&nbsp; DNA 중합효소&nbsp; 및 SeqAMP&nbsp; PCR 버퍼 (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; PCR 완충액 (2X)&nbsp;</td><td>타카라</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509에는 SeqAMP&nbsp; DNA 중합효소&nbsp; 및 SeqAMP&nbsp; PCR 완충액 (2X)</td></tr><tr><td>새우 알칼리성 인산가수분해효소 (1 U/&mu; 엘)&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0371L&nbsp;( 구성 요소 #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr> <tr><td>수산화 나트륨 (NaOH)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>&nbsp; S5881</td><td>작업 용액(5M)을 준비하고 상온</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제(400U/&mu)에서 보관하십시오. 엘)&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0202L&nbsp;( 구성 요소 #: M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L에는 T4 DNA 리가아제(400 U/&mu; L) 및 T4 DNA 리가아제 반응 완충액(10X)</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제 반응 완충액(10X)&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0202L&nbsp;( 구성 요소 #: B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L에는 T4 DNA 리가아제(400 U/&mu; L) 및 T4 DNA 리가아제 반응 완충액 (10X)</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가아제 1 (30 U/&mu; 엘)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M은 T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA 리가아제 반응 완충액(10X), PEG 8000(1X) 및 ATP(100 mM)</td></tr><tr><td>T4 RNA 리가아제 반응 완충액(10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M은 T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), T4 RNA 리가아제 반응 완충액(10X), PEG 8000(1X) 및 ATP(100mM)</td></tr></tbody></table>

small rna 정량을 위한 aqrna-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq는 생물학적 샘플에서 염기서열분석 판독 횟수와 small RNA copy numbers 사이에 직접적인 선형 관계를 제공하여 small RNA pool의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 여기에 설명된 AQRNA-seq 라이브러리 준비 절차에는 맞춤형으로 설계된 염기서열분석 링커의 사용과 역전사 진행성을 차단하는 메틸화 RNA 변형을 줄이는 단계가 포함되며, 이로 인해 전장 cDNA의 수율이 증가합니다. 또한 수반되는 생물정보학 파이프라인의 자세한 구현이 제시됩니다. 이 AQRNA-seq 시연은 20일간의 영양 결핍 과정과 6일의 소생술에 걸쳐 선택된 5일에 걸쳐 수확된 Mycobacterium bovis BCG의 45개 tRNA에 대한 정량 분석을 통해 수행되었습니다. AQRNA-seq의 효율성과 엄격성을 개선하기 위한 지속적인 노력도 여기에서 논의될 것입니다. 여기에는 PCR 증폭 후 primer dimer 문제를 완화하기 위해 gel purification을 없애고 보다 정확한 read mapping을 가능하게 하기 위해 full-length read의 비율을 늘리는 방법을 탐색하는 것이 포함됩니다. AQRNA-seq에 대한 향후 개선 사항은 다양한 유기체의 세포 및 조직 샘플에서 모든 small RNA 종을 정량화하기 위한 이 기술의 자동화 및 고처리량 구현을 촉진하는 데 중점을 둘 것입니다.

마이코박테리움 보비스 기하급수적 성장을 겪고 있는 BCG(bacilli de Calmette et Guérin) 균주 1173P2는 영양 결핍의 시계열(0, 4, 10 및 20일)을 거친 후 이전에 Hu et al.7에서 제시된 바와 같이 영양이 풍부한 배지에서 6일 동안 소생시켰습니다. Small RNA는 5개의 지정된 시점 각각에서 3개의 생물학적 복제를 통해 박테리아 배양에서 분리되었습니다. Illumina 라이브러리는 위에서 설명한 AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우(그림 1)를 사용하여 구축한 후 Massachusetts Institute of Technology의 BioMicro Center에서 시퀀서에서 시퀀싱했습니다. 그런 다음 염기서열분석 데이터는 tRNA 함량의 정량화를 위해 맞춤화된 AQRNA-seq 데이터 분석 파이프라인(그림 2)을 ...

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

AQRNA 염기서열분석은 거의 모든 세포 또는 조직 샘플에서 microRNA, tRNA 및 tRNA 단편과 같은 작은 RNA를 정량적으로 매핑합니다. 170개의 알려진 tRNA 변형 중 일부를 매핑하는 데 사용할 수 있지만 매핑에 더 특이적인 다른 방법이 있습니다. AQRNA-seq를 사용하여 RNome에서 질병 바이오마커를 발견하고 시스템 수준에서 단백질 번역 메커니즘을 탐색할 수 있습니다.대부분의 RNA-seq 분석법은 샘플에 있는 개별 RNA 분자의 풍부도를 정확하게 정량화할 수 없습니다. 이는 2차 구조, 전사 후 변형과 같은 RNA의 구조적 특성뿐만 아니라 RNA의 말단 뉴클레오티드에 의해 유도된 1,000배의 ligation biases와 같은 라이브러리 준비의 생화학에 의해 발생합니다. AQRNA-seq는 여러 가지 기술적 및 생물학적 문제를 극복하기 위해 개발되었으며, 이로 인해 시료 내 RNA 농도의 정확한 정량화가 제한됩니다.다른 물질과 비교했을 때, RNA 분자의 재검수와 복제 수 사이의 선형성을 달성하며, 참조 라이브러리의 75%를 정확하게 정량화하여 963개의 microRNA를 2배의 정확도로 압축합니다. AQRNA-seq는 small RNA의 절대 정량화를 제공한다는 점에서 독보적입니다. 이는 염기서열분석 횟수를 샘플에 있는 RNA 분자의 사본 수와 직접 연결합니다.이러한 수준의 정확도는 샘플에서 수십 개에서 수백 개의 tRNA를 비교하는 데 매우 중요하며, 조건 및 샘플 간에 상대적인 정량화만 허용하는 일반 small RNA-seq와 다릅니다. 당사는 단백질 번역을 이해하는 데 있어 충족되지 않은 요구를 위해 AQRNA-seq를 설계했습니다. 우리는 세포가 변형된 tRNA의 사본 수에서 수십 개의 tRNA 변형을 재프로그래밍하여 해당 tRNA와 일치하는 코돈으로 강화된 메신저 RNA의 선택적 번역을 가능하게 한다는 것을 발견했습니다.AQRNA-seq를 사용하면 이 메커니즘의 일부로 tRNA 풀의 변화를 정량화할 수 있습니다. 우리는 단백질 번역을 위한 이 새로운 모델을 검증하기 위해 이를 광범위하게 사용했습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

실시간 PCR을 통해 해안 퇴적물의 박테리아 16S rRNA 유전자 및 전사체를 정량화하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 방법론에는 DNA와 RNA의 공동 추출이 포함됩니다. DNA가 없는 RNA의 제조; 및 표준 곡선 구조를 포함한 RT-q-PCR을 통한 16S rRNA 유전자 및 전사체 정량화.

실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

이 프로토콜 매핑 사전 mRNA 3' 최종 사이트를 처리 하는 방법을 설명 합니다.

3' 끝 시퀀싱 A seq2 라이브러리 준비

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

여기에 제시된 것은 식물 조직의 레이저 포획 미세 절(LCM)을 위한 프로토콜입니다. LCM은 오염없는 방식으로 조직의 영역을 격리하기위한 현미경 기술입니다. 절차는 조직 고정, 파라핀 포함, 단면, LCM 및 RNA 추출을 포함한다. RNA는 다운스트림 조직 특이적, 전사의 현세적으로 해결된 분석에서 사용된다.

레이저 캡처 미세 절 RNA-시퀀싱 용 공간 및 측두 조직 -특정 유전자 발현 분석

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

배우세요 AQRNA-seq을 활용한 small RNA 정량 분석 방법으로 Mycobacterium bovis BCG의 기아 유도 휴면 상태에서 tRNA 풀 변화를 연구합니다. 이 기술은 기존 RNA-Seq의 한계를 극복하고 정확한 RNA 분자 수준 정량을 제공하여 질병 바이오마커 발굴과 단백질 번역 메커니즘 연구에 활용됩니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

더 많은 동영상 탐색