Name: Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 학습하세요 돼지 췌장 외과적 관류 및 격리를 통한 고품질 islet 분리 기법. 이 방법은 이식 연구와 xenotransplantation을 위한 신뢰할 수 있는 islet 확보에 필수적입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>돼지 췌장의 외과적 관류에 의한 돼지 섬의 정제

<ol><li>Gillespie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+pathogenesis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22CMAJ%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention.</a> CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).</li>
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<li>Otsuka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+preservation+with+a+neutrophil+elastase+inhibitor%2C+alvelestat%2C+contributes+to+improvement+of+porcine+islet+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation.</a> J Clin Med. 11 (15), 4290(2022).</li>
<li>Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+and+scalability+analysis+of+porcine+islet+isolation+for+islet+transplantation%3A+comparison+of+juvenile%2C+neonatal+and+adult+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs.</a> Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).</li>
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<li>Hart, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+an+adequate+perfusion+pressure+for+continuous+dual+vessel+hypothermic+machine+perfusion+of+the+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver.</a> Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).</li>
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<li>Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blood+content+on+porcine+pancreatic+dissociation+and+islet+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield.</a> Transplant Proc. 26 (6), 3442(1994).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+porcine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult porcine islets of Langerhans.</a> Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 mL</td><td>밀리포어 시그마</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 mL (15 - 30 &deg; C)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 원뿔형 튜브</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B [50 mg]</td> <td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>방부제 포비돈 요오드 10%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 그라디언트 이전</td><td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 클로라이드 디하이드레이트</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>COBE 세포 처리기</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소화 회로 저장소, Gibco 병, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Former Connection Kit</td><td>BioRad</td><td>1652008</td><td></td></tr><tr><td>Heparin [1000 U/mL]</td><td>Emergency Medical Products</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액 (1m), 100 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민 25 %, 100 mL</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>Item#:11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Patterson</td><td>Item #:07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liverase (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존력/세포독성 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte 1.1 Media 500 mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex LS 16 튜빙</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 연동 펌프</td><td>Masterflex</td><td>07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/mL)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/바이알)</td><td>Dornase 알파</td><td>8931278</td><td></td></tr><tr><td>회수 매체, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>표준 배양 배지, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&trade; (틸레타민과 졸라제팜) Injection C</td><td>Patterson</td><td>항목 #:07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L</td><td>Global Transplant Solutions</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Sigma Alderich</td><td>CLS6783-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson</td><td>항목 #:07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

수술 설정 및 정중선 개복술은 그림 1에 나와 있습니다. 개복술 절개는 비뇨생식기 입구를 피하기 위해 구부러져야 합니다(그림 1B). 리트랙터를 설정할 때 Omni 또는 Bookwalter 리트랙터의 포스트를 테이블의 왼쪽 아래쪽 모서리에 부착하십시오. 이상적인 수축에는 오른쪽 복벽에 2개, 왼쪽 복벽에 2개, 오른쪽 결장과 소장에 1-2개의 견인 블레이드가 멸균 수건으로 싸여 있습니다(그림 1C). 차체 벽, splanchnic 또는 가단성 견인기 블레이드를 사용할 수 있으며, 이는 보조 장치 및 작업자 선호도의 가용성에 따라 다릅니다. Omni 또는 Bookwalter 견인기를 사용할 수 없는 경우 1-2개의 자체 유지 Balfour 견인기를 사용하여 양쪽의 복벽을 후퇴시킬 수 있습니다. 그런 다음 보조원은 멸균 수건으로 감싼 오른쪽 결장과 소장에 수축을 적용할 수 있습니다.
그림 2에서 수행된 후복막 절제술은 둔한 박리와 날카로운 박리술을 혼합하여 시행할 수 있습니다. infrarenal IVC와 aorta의 원주 제어를 얻는 것이 중요하지만, 이 절개는 분기점까지 계속될 필요가 없습니다. 흉곽내 또는 후간IVC의 손상은 심각한 출혈을 유발하고 수술 영역을 모호하게 할 수 있기 때문에 시술의 흉강내 부분은 기술적으로 가장 까다롭습니다(그림 3). 하행 흉부 대동맥을 식별할 때는 엄지와 검지를 사용하여 대동맥을 식도에서 둔하게 분리합니다. 작은 늑간동맥의 파열과 그에 따른 출혈을 피하기 위해, 하행 흉부 대동맥이 대동맥 클램프를 수용할 수 있도록 명확하게 정의된 공간으로 접근할 수 있는 한 원주 조절은 필수적이지 않습니다.
대동맥 내막의 캐뉼레이션은 Seldinger 기법을 사용하여 수행됩니다(그림 4). 이는 근위 및 원위부로 고정된 대동맥 내측 대동맥을 사용하거나 클램핑 없이 직접 수행할 수 있습니다. 대동맥의 뒷벽을 통해 바늘이 삽입되지 않도록 주의하십시오. 대동맥의 크기가 충분한 경우 더 큰 칼집을 사용할 수도 있습니다. IV 확장 튜브에서 공기를 제거하고 UW 용액의 IV 튜브를 멸균 방식으로 10Fr 피복에 연결하는 것이 중요합니다. 대동맥이 클 때까지 흐름이 시작되지 않지만 IV 채널이 열려 있는지 확인하십시오.amped(그림 4B). infrarenal IVC에서 정맥 절제술을 할 때 주치의는 DeBakey 겸자를 사용하여 IVC를 단단히 잡고 정맥 절제술 부위를 잃지 않고 수술 필드에 많은 양의 혈액을 붓는 것이 중요합니다. 췌장에서 떨어진 정맥 절제술은 수영장 석션의 신속한 배치와 함께 췌장 절제술을 위한 투명한 조직 평면으로 혈액 없는 수술 필드를 유지합니다(그림 4C). 초기 배액은 어두운 정맥혈이지만 돼지가 출혈되고 UW 용액이 내장을 통해 관류됨에 따라 밝아집니다. 절차의 이 부분에는 큰 흡입 캐니스터를 사용해야 합니다.
내장, 특히 췌장은 UW 용액이 관류됨에 따라 점점 창백해집니다(그림 5A). 췌관은 십이지장엽의 경로를 따라 십이지장으로 들어가는 경로를 따라 식별할 수 있습니다. 덕트는 장내 내용물로 오염되지 않도록 두 개의 실크 넥타이로 나누어야 합니다(그림 5B). 췌장 실질은 창백하고 피가 없어 보이지만, 췌장을 둘러싼 나머지 결합 조직은 섬 격리 전에 청소해야 합니다(그림 5C).
그런 다음 채취된 췌장은 다단계 섬 분리 및 정제 과정을 거칠 수 있습니다(그림 6). 그림 7A 는 섬 분리 및 정제 공정 후의 대표적인 섬 크기 분포를 보여줍니다. 그림 7B 는 명시야 현미경을 사용하여 정제된 islet을 보여주며, 활성/사멸 염색 후의 녹색 및 적색 염색은 각각 생존 가능한 섬 세포와 생존 불가능한 islet 세포를 나타냅니다. Islet 수율 및 순도는 Islet 세포 카운터를 사용하여 평가할 수 있습니다. 대표적인 수율은 3개의 독립적인 돼지 췌장 분리로부터 제공되며, 그림 7C에 요약되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg"> 그림 1: 작동 설정. (A) 복부가 멸균 상태로 준비된 상태로 누운 자세로 놓인 돼지; (B) xiphoid에서 치골까지 만든 정중선 개복술; (C) Omni retractor가 제자리에 있는 상태에서 노출된 후복막. 축척 막대 = 2cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg"> 그림 2: 후복막 박리. (A) infarenal IVC 및 신장 정맥의 원주 조절을 통한 후복막 절제술. 노란색 사각형은 그림 2B에서 확대되어 있습니다. (B) infraarenal IVC 및 신장 정맥의 확대 이미지; (C) 신장 정맥이 묶여 있습니다. 눈금 막대 = 2cm. 약어: IVC = 하대정맥. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg"> 그림 3: supraceliac control 얻기. (A) 우측 반격막이 절개되었습니다. 노란색 사각형은 그림 3B에서 확대되어 있습니다. (B) 흉곽내 IVC 및 하행 흉부 대동맥을 노출시키기 위한 우측 반격막 절개의 확장; (C) 흉곽내 IVC의 원주 조절을 얻었다. 눈금 막대 = 2cm. 약어: IVC = 하대정맥. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg"> 그림 4: Infrarenal aortic cannulation, visceral isolation, and perfusion. (A) 얻어진 대동맥의 근위 및 원위 조절; (B) Seldinger 기술에 의해 대동맥 내측 대동맥에 배치된 10Fr 칼집; (C) infrarenal aortic sheath를 통한 내장 관류 및 infrarenal IVC에서 정맥 절개술 및 수영장 빨판을 통한 배액. 눈금 막대 = 2cm. 약어: IVC = 하대정맥. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg"> 그림 5: 전체 췌장 절제술. (A) 관류 중 내장이 창백해진다. (B) 분리된 췌관; (C) 이식된 돼지 췌장. 축척 막대 = 2cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg"> 그림 6: Islet 분리 및 정제. 효소 용액의 주입, 돼지 췌장의 소화, 조직 수집, Cell Processor를 사용한 세포 세척, 세포 배양 및 분석에 대한 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg"> 그림 7: 대표적인 islet 생존율과 정제 후 수율. (A) 확대된 명시야 이미징 및 살아있는/죽은 염색 후의 돼지 섬. 녹색은 살아있는 세포를 나타냅니다. 빨간색은 죽은 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100μm (B) 정제 후 돼지 섬 크기의 히스토그램 분포. (C) 3개의 돼지 췌장 섬 분리에서 얻은 섬의 순도 및 수율을 나타내는 표. 약어: IEQ = islet equivalent, islet 정량화의 표준 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

연구 2 형 당뇨병 아일 레츠의 공급 부족이다. 여기 부분 pancreatectomy를 겪고 환자에서 아일 레츠를 분리를위한 프로토콜을 공유할 수 있습니다. 이 방법은 제 2 형 당뇨병 환자에서 아일 레츠을 얻기위한 독특한 장소를 나타내며 임상 기초 및 임상 연구에 적합한 숫자가 아닌 당뇨병 과목과 일치.

부분 Pancreatectomized 환자에서 인간 아일 레츠의 분리

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

조직 공학 전체 췌 장의 외 분 비 및 내 분 비 기능 때문에 도전 이다. 우리는 그대로 돼지 췌 세제 Triton X-100의 관류에 의해 성공적인 decellularization의 프로세스, 나트륨 deoxycholate, 및 deoxyribonuclease의 해 부에 대 한 방법을 보여줍니다.

절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

비디오 기사는 돼지 3일 생존 모델에서 췌장 절제술 및 췌장 동종 이식 기술을 요약하고 방법에 대한 단계별 설명과 불안정하고 섬세한 돼지 내장 해부학을 다루기 위한 수술 요령 및 요령에 중점을 둡니다.

돼지 췌장 이식을 위한 수술 요령과 요령

여기에서는 가능한 교란 요인을 감소시키면서 내분비 췌장 기능을 평가하기 위한 추가 기술로 온전한 췌장이 있는 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통해 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)를 수행하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

온전한 췌장을 가진 마우스 맥관 구조를 통한 관류를 통한 포도당 자극 인슐린 분비

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

학습하세요 돼지 췌장 외과적 관류 및 격리를 통한 고품질 islet 분리 기법. 이 방법은 이식 연구와 xenotransplantation을 위한 신뢰할 수 있는 islet 확보에 필수적입니다.

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

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