Name: 중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 생체 내 현미경과 MRI를 결합한 등쪽 피부창 종양 마우스 모델을 통해 종양 미세혈관과 방사선 치료 반응을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 전임상 연구 결과의 임상 적용을 가속화합니다.

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종양 세포 배양 및 접종 프로토콜 개발에 도움을 주신 Carla Calçada 박사(Princess Margaret Cancer Centre 박사후 연구원)와 Timothy Samuel 박사(Princess Margaret Cancer Centre 박사 과정 학생)에게 감사드립니다. Kathleen Ma 박사, Anna Pietraszek 박사, Alyssa Goldstein 박사(Princess Margaret Cancer Centre 동물 연구 센터)가 수술 프로토콜 개발을 도왔습니다. 제이콥 브로스케(Jacob Broske, 프린세스 마가렛 암 센터(Princess Margaret Cancer Centre) 의료 엔지니어링 기술자)와 웨인 켈러(Wayne Keller, TriMech 그룹 회사 자벨린 테크놀로지스(Javelin Technologies) 하드웨어 클라이언트 책임자)는 창문 챔버를 3D 프린팅했습니다. James Jonkman(Advanced Optical Microscopy Facility, University Health Network)은 명시야 및 형광 현미경 이미지 획득에 대한 귀중한 지침을 제공했습니다.

Guided Tumor Inoculation and Multimodal Imaging in Mice

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 작업에서는 동일한 동물에서 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징(CT, MRI 및 PET)을 모두 수행할 수 있는 워크플로우를 개발했습니다. 이는 생체 내 현미경 검사와 MRI와 같은 임상 영상 양식의 직접적인 상관 관계를 통해 전임상 현미경 검사 결과를 클리닉에 적용하는 것을 목표로 수행되었습니다. 기존의 DSFC 설계는 금속 2,3으로 만들어졌지만, 생체 적합성 플라스틱 수지로 만든 3D 프린팅 윈도우 챔버를 사용하여 DSFC를 MR과 호환되도록 조정했습니다. 양식의 등록은 임상 이미징 양식에 대한 기준 마커를 사용하고 DSFC의 기준 마커 위치를 광시야 현미경 이미지 및 고해상도 생체 내 현미경 미세혈관 이미지에서 볼 수 있는 혈관 랜드마크와 일치시키는 광시야 현미경 이미지를 획득하여 수행되었습니다. 모달리티를 공동 등록하기 위한 MATLAB 코드가 개발되었으며 보충 파일 2에 포함되어 있습니다.
DSFC는 전임상 연구에서 새로운 것이 아니며2,3,27,29,30,31,32 일부 연구에서는 생체 적합성 플라스틱으로 생체 적합성 플라스틱을 사용하여 생체 내 현미경 검사 및 임상적으로 적용 가능한 이미징을 위해 MR 호환 DSFC를 개발하고 있습니다 27,29,30,31,32. 그러나 이러한 연구는 MRI 및 생체 내 현미경 소견과 전체 종양 수준 상관 관계를 수행합니다. 이 연구의 참신함은 DSFC에 부착된 기준 마커를 사용하여 생체 내 마이크로카피 이미지를 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식에 직접 공동 등록할 수 있어 직접 공간 상관 분석을 가능하게 하는 기능입니다. Gaustad et al.은 또한 MRI와 생체 내 현미경 사이의 공간 상관 관계 분석을 수행했습니다. 그러나 양식상 간의 공동 등록 절차에 대한 구체적인 세부 단계는 포함되어 있지 않다29. 이 작업은 기준 마커 링 부착물을 사용하여 여러 양식을 서로 공간적으로 상호 연관시키기 위한 프로토콜을 제공하며 MATLAB 파이프라인을 포함합니다.
DSFC 설계 및 절차에는 다른 유사한 연구에 비해 향상된 이미징 및 종양 성장 특성을 제공하는 몇 가지 세부 사항이 있습니다. 첫째, 대부분의 창실 방법은 창실 수술 후 종양을 접종하는 것입니다. 이것은 일반적으로 종양을 창 챔버 FOV의 중앙에 두는 것이 더 쉽기 때문에 수행됩니다. 그러나 이전 연구에서는 이것이 차선책이며, 많은 경우에 자발적 퇴행을 동반한 '비현실적인' 단층 종양 성장으로 이어진다는 것을 보여주었다33. 대신, DSFC 이식 전 몇 주 동안 종양이 피부에서 제한 없이 자랄 수 있도록 하여 성장 특성이 개선된 보다 사실적인 3D 종양을 가능하게 합니다33.
이 DSFC 디자인은 또한 0.83g의 매우 가벼우며 대형 이미징 창 FOV(직경 1.2cm 유리 커버슬립)를 제공합니다. DSFC 디자인의 독특한 특징은 유리 커버슬립을 전면 프레임에 고정하기 위한 스냅 링이 포함되어 있지 않다는 것입니다. 대신, 유리 커버슬립은 UV 경화 접착제를 사용하여 영구적으로 부착되어 전면 프레임의 하단 부분이 완전히 평평하게 만들 수 있습니다. 또한 전면 프레임은 마우스 피부 아래에 고정되어 있습니다. 이는 종양-유리 계면 사이에 에어 갭이 발생할 가능성을 최소화하기 위해 수행되었습니다. 이전 설계에서는 종양-유리 계면에 틈이 있는 경우 이 영역에 유체가 축적될 가능성이 높다는 점에 주목했습니다. 이는 생체 내 현미경 신호를 감쇠시켜 이미지 품질을 저하시켜 결과에 큰 영향을 미칩니다. 또한 이러한 체액 축적은 T2w 국소화 스캔에서 밝게 보이기 때문에 MRI 절편을 종양에 표적화하는 것을 더 어렵게 만듭니다. 이로 인해 어떤 절편이 조직을 이미징하고 어떤 절편이 DSFC에 축적된 액체를 이미징하는지 식별하기가 어렵습니다. 이 디자인의 한 가지 단점은 유리 커버슬립이 파손되면 쉽게 교체할 수 없다는 것입니다. 우리는 또한 완전히 광학적으로 투명한 플라스틱으로 만들어진 전면 프레임을 설계하여 유리 파손 문제34를 제거했습니다.
이 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 중요한 단계는 다른 단계보다 기술적으로 더 까다롭습니다. 어려움을 겪을 수 있는 한 가지 단계는 DSFC 수술 중 전면 프레임을 피부에 봉합할 때입니다(프로토콜 단계 3.18-3.24). DSFC의 전면 프레임 상단을 따라 약간 느슨한 피부를 유지하는 것이 중요합니다. 이것이 완료되지 않으면 이 영역의 피부가 혈액 공급을 잃고 괴사되어 준비를 망치게 됩니다. 기술적으로 어려운 또 다른 작업은 유리 아래 조직의 가장 표상적인 부분을 포함하도록 MRI 절편 패키지를 타겟팅하는 것입니다. 이 슬라이스가 해당 영역을 정확하게 대상으로 하지 않으면 유리에 대한 부분적인 부피 효과가 발생하여 잘못된 MRI 결과가 발생할 수 있습니다. DSFC 유리 아래 조직의 고르지 않은 표면은 이를 더욱 어렵게 만들 수 있습니다. 이러한 오류의 원인을 줄이기 위해 조직 표면을 가능한 한 평평하고 균일하게 유지하기 위해 DSFC 내부의 피부가 팽팽하게 유지되도록 하는 것이 중요합니다.
여기에서는 이미징 FOV가 6 x6mm2의 큰 이미징 FOV를 가진 svOCT를 사용하여 이 DSFC 워크플로우를 사용하는 방법을 시연했습니다. 이 큰 FOV는 FOV가1mm2 이하인 많은 이미징 방법을 가진 다른 유형의 생체 내 현미경 검사에서는 일반적이지 않습니다13. 이로 인해 광시야 현미경 이미지를 고해상도 생체 내 현미경 이미지에 공동 등록할 때 미세혈관 랜드마크를 식별하기 어려울 수 있기 때문에 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 더 작은 FOV(~6 x 6mm2)를 가진 또 다른 광시야 현미경 이미지가 필요할 수 있으며, 이는 관심 영역을 생체 내 현미경으로 이미징된 영역으로 더욱 미세 조정하기 위해 이미징 양식 간의 추가 중간 공동 등록 단계로 작용할 수 있습니다.
이 연구에서는 종양 미세혈관을 이미징하는 데 중점을 두었지만 이 모델을 사용하여 다른 종양 미세환경 구성 요소도 이미징할 수 있습니다. 예를 들어, 생체 내 현미경 검사는 종양 기질(35)을 성공적으로 이미징하는 것으로 나타났으며, 확산 텐서 이미징 또는 확산 첨도 이미징과 같은 확산 가중 MRI 방법은 종양 기질(36,37)의 구조에 대한 정보를 제공할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 이 워크플로우는 종양 기질의 고해상도 생체 내 현미경 이미지를 기질의 MRI 기반 측정과 직접 공동 등록하여 기질 종양 정보를 클리닉으로 변환할 수 있는 흥미로운 기회를 제공할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 co-registration을 위해 혈관 랜드마크를 사용하기 때문에 생체 내 현미경 기질 이미지에도 존재해야 한다는 점에 유의해야 합니다.
제시된 워크플로우는 전임상 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식 간의 격차를 해소하는 데 중요한 단계임이 입증될 수 있습니다. 이 모델은 실측 자료로 생체 내 현미경 이미지로 임상 이미징 방법을 검증하고, 생체 내 현미경 검사와의 비교를 통해 임상적으로 적용 가능한 새로운 이미징 방법을 개발하고, 여러 이미징 양식을 사용하여 치료의 반응을 종단적으로 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

종양 미세혈관은 종양 미세환경의 중요한 구성 요소로서 치료의 표적이 될 수 있고 치료 반응의 결정 요인이 될 수 있습니다. 전임상 환경에서 미세혈관은 일반적으로 orthotopic 또는 heterotopic window chamber 동물 모델에서 생체 내 현미경을 사용하여 연구됩니다 1,2. 이는 이미징이 살아있는 조직에서 수행되고 종양을 몇 주 또는 몇 개월에 걸쳐 종단적으로 모니터링할 수 있기 때문에 조직학적 연구에 비해 몇 가지 장점이 있습니다 2,3. 이러한 연구는 생체 내 현미경의 고해상도 이미징 기능을 활용하여 종양에 대한 치료제의 전달 4,5, 치료 내성6의 원인, 항혈관 신생 치료 7,8 및 방사선 요법 2,9와 같은 치료에 대한 미세 혈관의 반응을 연구할 수 있습니다.
생체 내 현미경 검사는 분명히 전임상 암 연구에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 임상에서 종양 미세환경 특징을 어떻게 측정할 수 있습니까? 미세혈관 정보는 방사선 요법10에서 치료 저항성을 결정하는 데 중요한 혈액 공급 및 종양 세포 저산소증을 측정하기 위해 클리닉에서 유용할 뿐만 아니라 주변 종양 세포에 화학요법제를 전달하는 미세혈관의 능력(11)을 측정하는 데 유용할 것입니다. 예를 들어, 방사선 치료에서 종양 미세혈관의 구조 및 기능에 대한 공간 정보는 분획 일정을 조정하거나 무혈성 및 저산소 가능성 있는 영역으로 선량을 우선적으로 증가시킴으로써 환자의 치료 계획을 개인화하는 데 도움이 될 수 있다12.
Intravital Microscopy는 매우 높은 해상도(μm 스케일)를 가지고 있기 때문에 이러한 중요한 미세혈관 기능을 측정할 수 있습니다. 그러나 조직에 대한 깊이 침투는 수백 미크론 또는 몇 밀리미터로 제한되어 임상 구현이 어렵습니다. 실제로, 클리닉에서 생체 내 현미경 검사의 몇 가지 새로운 응용 프로그램이 있습니다13; 그러나, 이는 여전히 피부(14)와 같은 표면 근처의 조직을 검사하거나 유연한 카테터/내시경(flexible catheters/endoscopes)을 통해 다양한 체강의 점막/내피 내벽을 검사하는 것으로 제한된다(15,16).
더 일반적으로, 미세혈관은 CT17 또는 MRI18과 같은 영상 양식을 사용하여 연구됩니다. 이러한 임상 이미징 기법은 신체 내부의 모든 깊이까지 이미징할 수 있지만 공간 해상도(mm 스케일)가 훨씬 낮습니다. 따라서, 고해상도의 상세한 미세혈관 정보를 임상에 도입하기 위해 전임상 활력내 현미경 검사와 임상 이미징 양식 사이의 이러한 해상도 격차를 해소할 필요가 있다19. DCE(Dynamic Contrast-Enhanced) MRI 및 CT20, IVIM(Intravoxel incoherent motion) MRI21과 같은 임상 영상 양식의 미세혈관 영상 기능을 개선하기 위해 여러 기능적 영상 방법이 개발되었습니다. 그러나, 이들은 미세혈관의 간접 측정을 제공하는 모델-기반 방법이며, 따라서, 미세혈관구조(19,22)의 적절한 "실측 자료" 측정으로 검증되어야 한다.
당사는 전임상 생체 내 현미경 검사와 CT 및 MRI와 같이 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식 간의 이러한 격차를 해소하기 위해 DSFC(dorsal skinfold window chamber) 종양 마우스 모델을 개발했습니다. DSFC는 유리창을 통해 고해상도 생체 내 현미경 이미징을 위해 종양에 직접 접근할 수 있을 뿐만 아니라 MR 호환 재료(플라스틱 및 유리)로 만들어졌기 때문에 MRI와 같이 임상적으로 적용 가능한 이미징도 제공합니다. 또한 포함된 MATLAB 코드는 전임상 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식 간의 직접적인 공간 상관 관계를 위해 다중 모드 3D 공동 정합을 수행합니다. 여기에서는 DSFC를 설치하기 위한 설계 및 수술뿐만 아니라 생체 내 현미경 및 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식을 공동 등록하는 절차에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BxPC-3 Human Pancreatic Cancer Cells</td><td>ATCC (American Type Culture Collection)</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354234</td> Corning Stripettor <td></td></tr><tr><td>Ultra Pipet Controller</td><td>Corning</td><td>07-202-350</td><td></td></tr><tr><td>칼슘, 마그네슘 또는 페놀이 레드가 없는 Dulbecco Phospphate 완충 식염수, 500mL</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(캐나다), 500mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 100x(액체, 안정화, 멸균 필터링, 세포 배양 테스트)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640(1x), 액체, L-글루타민 포함, 500mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Window Chamber Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Glass Coverslip</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>CS-12R No. 1.5</td><td></td></tr><tr><td>Connex 500 3D 프린터</td><td>Stratasys</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>생체 적합성 클리어 MED610 수지</td><td>Stratasys</td><td>&nbsp; RGD810</td><td></td></tr><tr><td>록타이트 AA 3105 UV 경화형 접착제</td><td>록타이트</td><td>LCT1214249</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 챔버 백 프레임</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 챔버 기준 마커</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 챔버 프론트 프레임</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>윈도우 챔버 지지 클립</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>접종 및 수술 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD SafetyGlide 인슐린 주사기와 영구적으로 부착된 바늘, 0.5 mL, 29 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>CABD305932</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Solution</td><td>Betadine</td><td>AP-B002C2R98U</td><td></td></tr><tr><td>Cidex OPA 14 Day Solution 3.8 L</td><td>ASP</td><td>JOH20394</td><td></td></tr><tr><td>일회용 수술용 언더패드 23 인치 x 24 인치</td><td>Kendall</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>눈 윤활제&nbsp; &nbsp;</td><td>Optixcare</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Nair</td><td>&lrm; </td><td></td></tr><tr><td>061700222611 Halstead 헤모스태틱 펜치</td><td>Almedic</td><td>7742-A12-150</td><td></td></tr><tr><td>난방 패드</td><td>선빔&nbsp;</td><td></td><td></td>B086MCN59R</tr><tr><td>아이리스 가위</td><td>Almedic</td><td>7601-A8-690</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>시그마</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>&nbsp; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc</td><td>NDC 0010-6015-03</td><td></td></tr><tr><td>끄덕임. Cg-rag1tm1엄마&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>7799</td><td></td></tr><tr><td>땅콩 가위 & 트리머</td><td>Wahl</td><td>8655-200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; SOFSILK 비흡수성 수술용 봉합사 #5-0 3/8" 테이퍼 포인트 바늘 (17 mm) (왁스 코팅, 브레이디드 블랙 실크, 멸균)&nbsp;</td><td>&nbsp; 시네처&nbsp;</td><td>&nbsp; VS880</td><td></td></tr><tr><td>파편 집게</td><td>Almedic</td><td>7725-A10-634</td><td></td></tr><tr><td>MR 이미징</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D 인쇄 창 챔버 고정 장치.</td><td></td><td></td><td>맞춤형 3D 인쇄, 자세한 내용은 그림 3을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>대류 난방 장치</td><td>3M Bair Hugger</td><td>70200791401</td><td></td></tr><tr><td>약물 주입 시스템</td><td>하버드 장치&nbsp; &nbsp;</td><td>PY2 70-2131</td><td>PHD 22/2200 MRI 호환 주사기 펌프</td></tr><tr><td>Gadovist 1.0</td><td>Bayer</td><td>2241089</td><td></td></tr><tr><td>호흡기 모니터링 시스템</td><td>SAII</td><td>모델 1030</td><td>MR 호환 모니터링 및 게이트 시스템.</td></tr><tr><td>꼬리 정맥 카테터(27G 0.5")</td> <td>Terumo Medical Corp</td><td>15253</td><td></td></tr><tr><td>Optical Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D printed imaging stage</td><td></td><td></td><td>, 자세한 내용은 보충 그림 3 참조.</td></tr><tr><td>12 V 7 W 유연한 폴리이미드 히터 플레이트 얇은 접착제 PI 난방 필름 25 mm x 50 mm</td><td>BANRIA&nbsp;</td><td>B09X16XCVS</td><td>마우스 본체 온도 조절에 사용되는 발열체.</td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>BK Precission</td><td>1761</td><td>발열체에 전원을 공급하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII</td><td>Leica Microsystems</td><td>15209</td><td></td></tr><tr><td>svOCT 이미징 시스템</td><td></td><td></td><td>자체 제작 이미징 시스템. 자세한 내용은 참고 문헌 23에서 확인할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td>R2020A</td><td></td></tr></tbody></table>

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 dorsal skinfold window chamber 종양 마우스 모델

A Dorsal Skinfold Window Chamber Tumor Mouse Model for Combined Intravital Microscopy and Magnetic Resonance Imaging in Translational Cancer Research

현미경 및 광간섭 단층 촬영과 같은 전임상 생체 내 이미징은 종양 미세환경과 치료에 대한 반응을 시각화하기 위한 암 연구에서 유용한 도구임이 입증되었습니다. 이러한 이미징 방식은 미크론 규모의 해상도를 가지고 있지만 조직에 대한 얕은 침투 깊이로 인해 클리닉에서 사용이 제한적입니다. CT, MRI 및 PET와 같이 임상적으로 적용 가능한 이미징 방식은 침투 깊이가 훨씬 더 크지만 공간 해상도(mm 스케일)가 상대적으로 낮습니다. 
전임상 생체 내 이미징 결과를 임상에 적용하려면 이러한 미시적 대 거시 적 해상도 격차를 해소할 수 있는 새로운 방법을 개발해야 합니다. 여기에서는 동일한 동물에서 전임상 생체 내 및 임상적으로 적용 가능한(CT 및 MR) 이미징을 가능하게 하도록 설계된 등쪽 스킨폴드 창 챔버 종양 마우스 모델과 이 두 가지 이질적인 시각화 방법을 연결하는 이미지 분석 플랫폼에 대해 설명합니다. 중요한 것은 설명된 창 챔버 접근 방식을 통해 직접 공간 일치를 위해 창 챔버의 기준 마커를 사용하여 다양한 이미징 양식을 3D로 공동 등록할 수 있다는 것입니다. 이 모델은 기존 임상 이미징 방법의 검증뿐만 아니라 "실측 자료" 고해상도 생체 내 소견과의 직접적인 상관 관계를 통해 새로운 방법을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 
마지막으로, 화학 요법, 방사선 요법, 광역학 요법 등 다양한 치료에 대한 종양 반응은 전임상 및 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식을 사용하여 이 방법론으로 종단적으로 모니터링할 수 있습니다. 따라서 여기에 설명된 등쪽 피부주름창 챔버 종양 마우스 모델 및 이미징 플랫폼은 다양한 암 연구 연구에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 전임상 생체 내 현미경 결과를 CT 또는 MRI와 같은 보다 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식으로 변환하는 데 사용할 수 있습니다.

스페클 분산 광학 간섭 단층 촬영(svOCT)을 수행하여 넓은 시야(FOV) 3D 미세혈관 이미지(6 x 6mm, 측면2 개 x 깊이 1mm)를 얻었습니다. 이러한 이미지를 획득하기 위해, 직교 간섭계를 기반으로 하는 앞서 설명된 스윕 소스 OCT 시스템이사용되었다 23. OCT 이미지는 측면으로 인접한 두 개의 3 x 6mm2 FOV 스캔을 스티칭하여 획득했습니다. 각 B-스캔은 400개의 A-스캔으로 구성되었으며 이전 작업24에서 설명한 대로 정확한 스페클 분산 처리를 가능하게 하기 위해 위치당 24번(25ms 간격) 수행되었습니다.
MRI 데이터 세트를 미세혈관 svOCT 데이터 세트에 공동 등록하기 위해 몇 가지 단계를 수행했습니다. 첫 번째 단계는 5.12단계에서 수행되었으며 그림 4에 나와 있습니다. 이 단계에서는 깊이 방향(그림 4의 z축)을 따라 두 데이터 세트를 공동 등록합니다. 측면 치수(그림 4의 xy-plane)를 따라 데이터 세트를 공동 등록하기 위해 기준 마커 링과 일련의 두 점 기반 아핀 등록이 사용됩니다. 먼저, MRI 데이터 세트는 링의 기준 마커 위치와 전면 프레임의 유리창 둘레에 있는 해당 디봇(그림 5B, C의 녹색 점)과 일치시켜 명시야 현미경 이미지에 공동 등록됩니다. 다음으로, svOCT 미세혈관 데이터 세트와 명시야 현미경 이미지 모두에서 식별할 수 있는 혈관 랜드마크를 사용하여 명시야 이미지(및 해당 MRI 데이터 세트)를 svOCT 데이터 세트(그림 5A,B의 파란색 점)에 공동 등록합니다. 따라서 명시야 현미경 이미지는 MRI(기준 마커의 디봇 위치)와 svOCT 미세혈관 이미지(미세혈관 랜드마크)의 특징을 모두 포함하는 중간 해상도 이미지로 작용하여 매우 다른 이미징 해상도에서 다중 모드 공동 정합을 가능하게 합니다.
종양이 없는(건강한 맨살) 및 종양이 없는 창실 준비 마우스에 대한 세 가지 양식(미세혈관 이미징, 광시야 현미경 및 MRI) 간의 성공적인 동시 정합 이미지는 각각 그림 6A-C 및 그림 6D-F에 나와 있습니다. 세 가지 양식이 모두 함께 등록되면 상관 관계 분석을 수행할 수 있습니다. 공동 등록된 데이터셋을 활용하려면 공간 상관 관계를 복셀별로 수행하거나 선택한 관심 볼륨에 대해 적절한 평균화 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 그림 7은 svOCT 유래 미세혈관 지표와 기능적 MRI 유래 대변혈관 지표 간의 상관관계에 대한 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 플롯에는 종양이 있는 쥐 두 마리와 '건강한' 맨피부 쥐 한 마리의 데이터가 포함됩니다. 이 플롯은 1mm2 측면 x 500 μm 깊이의 슬라이딩 윈도우 관심 볼륨(VOI) 기술을 사용하여 생성되었으며 각 포인트는 VOI의 한 위치를 나타내는 500 μ측면 스텝 크기입니다. 건강한 마우스의 경우, 혈관 분석은 검사된 종양의 3D 공간 범위와 일치시키기 위해 FOV 중심에서 3 x 3mm2 관심 영역으로 제한되었습니다. 이 분석 방법을 사용하여 svOCT와 MRI의 상관 관계를 관련한 보다 자세한 연구는 최근 연구22에서 확인할 수 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig06.jpg"> 그림 6: 건강한 영상 데이터 세트와 종양 영상 데이터 세트를 공동 등록했습니다. 맨 윗줄에는 (A) 색상 심도로 인코딩된 svOCT, (B) 파란색 점선으로 표시된 분석 영역과 공동 등록된 명시야 현미경 이미지, (C) 건강한 맨살 마우스에 대한 공동 등록된 DCE-MRI 파라미터 맵이 표시됩니다. 맨 아래 줄에는 (D) 색상 심도 인코딩 svOCT, (E) 파란색 점선으로 표시된 종양 윤곽이 있는 공동 등록된 명시야 현미경 이미지, (F) 종양이 있는 마우스에 대한 공동 등록된 DCE-MRI 매개변수 맵이 표시됩니다. C 와 F 의 검은색 복셀은 각각 분석 영역과 종양 외부에 있으므로 고려되지 않습니다. 축척 막대 = 1mm. 약어: svOCT = speckle variance optical coherence tomography; DCE-MRI = 동적 대비 강화 자기 공명 영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 7A는 MRI의 k트랜스파라미터와 svOCT로 측정된 혈관 부피 분율(VVF)을 비교한 것입니다. VVF는 혈관이 차지하는 조직의 비율이고 ktrans는 혈관 내 공간에서 혈관 외 공간으로 이동하는 가돌리늄의 속도 상수입니다. ktrans는 Toft의 모델을 복셀 별 복셀 기준25,26에서 가돌리늄 시간 농도 곡선에 맞추어 얻어진다. svOCT의 VVF 측정은 종양이 건강한 조직보다 작은 VVF를 가지고 있음을 보여주며, 이는 잠재적으로 종양 내부에 혈관이 잘 형성되지 않은 영역이 있음을 나타냅니다. ktrans는 혈류, 혈관 투과성 및 모세관 표면적 25,26에 따라 달라지므로 VVF가 클수록 더 큰 혈관 표면적과 혈류를 의미하기 때문에 ktrans와 VVF 사이의 양의 상관 관계가 예상됩니다. 그러나, 이 관계에서 종양 혈관 투과성의 영향을 더 자세히 설명하기 위해서는 덱스트란 외래 실험과 같은 더 많은 연구가 필요하다27.
그림 7B 는 MRI의 TTP(Time to Peak Contrast Enhancement)와 svOCT의 가장 가까운 용기()<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">까지의 평균 거리 간의 상관 관계를 보여줍니다. TTP는 가돌리늄 시간 농도 곡선이 최대값에 도달하는 데 필요한 시간을 측정하는 반정량적 메트릭이며, 이는 복셀별26 기준으로 계산됩니다. 상기 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> svOCT 미세혈관 측정법은 분석된 부피(22) 내에서 가장 가까운 혈관까지의 평균 거리를 측정한다. 일반적으로 종양 조직에 비해 건강한 조직이 더 작 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> 은데, 이는 건강한 미세혈관이 더 조밀하게 밀집되어 더 균일하게 산소가 공급되는 조직으로 이어지고, 종양 조직은 혈관화가 덜 잘 되어 있음을 나타낸다28. 종양 조직의 값이 높을 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> 수록 무혈 조직 영역의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그림 7B 는 TTP와 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">TTP 사이의 양의 상관 관계를 보여줍니다. 이는 건강한 조직이 가돌리늄이 조직 안팎으로 효율적이고 빠르게 세척되어 혈관화가 잘 이루어진다는 것을 보여줍니다. 그러나 종양 미세혈관은 혈관 간 거리가 클수록 더 기형이 되어 가돌리늄이 조직에 도달하는 시간이 증가하여 TTP가 증가합니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig07.jpg"> 그림 7: MRI와 svOCT의 거시적 상관관계와 미세혈관 공간 상관관계. 이 플롯은 종양이 있는 마우스 2마리와 건강한 맨피부 마우스 1마리를 대상으로 500 μm 깊이의 슬라이딩 윈도우 VOI를 사용하여 x 1 x 1 mm2 측면 × 500 μm 스텝 크기의 슬라이딩 윈도우 VOI를 사용한 결과를 포함하며, 각 포인트는 슬라이딩 윈도우 VOI의 한 위치에 대해 주어진 메트릭의 평균 값을 나타냅니다. 약어: svOCT = speckle variance optical coherence tomography; DCE-MRI = 동적 대비 강화 자기 공명 영상; VOI = 관심 거래량. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 창 챔버 구성 요소의 3D STL 파일. 부품을 3D 프린팅하는 데 사용된 DSFC 챔버의 4가지 구성 요소(전면 프레임, 후면 프레임, 지지 클립 및 기준 마커 링)가 포함된 zip 파일입니다. 약어: DSFC = dorsal skinfold window chamber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20file%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 멀티모달 이미지 공동 정합을 위한 MATLAB 스크립트. 이 MATLAB 스크립트(Multimodal_Image_Register.m)는 명시야 현미경, 미세혈관 이미지 데이터, 구조 및 기능(DCE 및/또는 IVIM 파라미터 맵) MR 이미지를 가져와 미세혈관 데이터셋에 공동 등록된 모든 데이터셋을 출력합니다. MATLAB 스크립트는 MRI - .dcm, svOCT - .mat 및 현미경 - .jpg 또는 . 티프. MATLAB 코드는 프로토콜 섹션에 설명된 파일 크기/해상도를 수용하도록 작성되었습니다: MRI - 0.5 x 0.5 mm 평면 해상도를 위한 64 x 64 매트릭스의 32 x 32 mm 시야각; 10개의 연속 이미징 슬라이스, 현미경 - &gt;1.5cm2 시야(모든 해상도 허용 가능)의 2D 이미지, svOCT - 6 x 6mm 시야각 7.5μm 해상도. 다른 파일 형식, 이미지 해상도 또는 이미징 시야가 사용되는 경우 MATLAB 코드를 수정해야 합니다. 약어: DCE = Dynamic Contrast-Enhanced; IVIM = intravoxel 비일관성 운동; MRI = 자기 공명 영상; svOCT = 스페클 분산 광학 간섭 단층 촬영. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Multimodal_Image_Register.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 창실을 쥐의 피부에 부착하기 위한 임시 봉합사. 봉합사는 (1)에서 시작하여 마우스의 전면 피부와 창 챔버의 전면 프레임을 통과합니다. (2) 그런 다음 봉합사는 마우스의 뒷 피부를 통해 창실의 뒷 프레임으로 나갑니다. 그런 다음 봉합사는 뒤쪽 프레임을 통해 (3) 뒤쪽 피부, 앞쪽 프레임을 통해, (4) 앞쪽 피부로 다시 끼워 넣습니다. (5) 그런 다음 봉합사는 DSFC 프레임과 피부층을 통해 다시 가져옵니다. (6) 마지막으로 봉합사는 창실의 상단 구멍과 피부의 모든 층을 통해 다시 가져옵니다. 그런 다음 DSFC + 스킨 어셈블리는 (1)에서 봉합사를 조이고 매듭을 지어 결합합니다. 약어: DSFC = dorsal skinfold window chamber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 영구 봉합사의 최적 배치. 영구 봉합사는 앞 피부/프레임을 통해 뒷 피부/프레임에서 빠져나오고 전체 어셈블리를 통해 뒤로 연결되고 앞쪽에 매듭을 지어야 합니다. 각 숫자는 하나의 개별 봉합사를 나타냅니다. 봉합사는 고정될 때 전체 어셈블리에 압력을 고르게 가할 수 있도록 숫자 순서대로 배치해야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S3: 생체 내 현미경 이미징을 위한 3D 프린팅 스테이지. (A) 이소플루란 가스 마취 부착물이 있는 3D 프린팅 스테이지는 생체 내 현미경 이미징에 사용됩니다. (B) 창 챔버는 3개의 볼트로 스테이지에 고정되어 고정하고 호흡 움직임을 제거합니다. (C) DC 전원에 직렬로 연결된 두 개의 발열체는 마취 상태에서 마우스의 체온을 유지하기 위해 스테이지 아래쪽에 접착됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Intravital microscopy 결과의 번역은 조직에 대한 얕은 깊이 침투로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 직접적인 공간 상관 관계를 위해 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식(예: CT, MRI)을 함께 정합할 수 있는 등쪽 창 챔버 마우스 모델에 대해 설명하며, 이를 통해 생체 내 현미경 검사 결과의 임상 번역을 간소화할 수 있습니다.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the ...

전임상 생체 내 이미징은 해상도가 매우 높지만 조직 내 깊이 침투가 제한되어 있어 전임상 이미징 연구에 매우 적합합니다. 반면에 MRI는 임상적으로 훨씬 더 적용 가능하고 깊이 침투가 더 높지만 공간 해상도가 매우 낮습니다. 이 연구의 목표는 자기 공명 영상을 통해 전임상 생체 내 현미경 검사 결과를 클리닉으로 더 잘 번역하기 위해 이 두 가지 양식을 서로 연관시키는 것입니다.당사의 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography) 및 지리학 시스템(geography system)을 포함한 MRI 및 바이오포토닉스(biophotonics)의 관류 민감성 이미징 방법은 미세혈관이 저분획 방사선 요법에 대한 종양 반응에 어떤 영향을 미치는지 밝히고 있습니다. 3D 프린팅은 또한 비용 효율적인 맞춤형 도구 제조를 통해 종단 연구를 용이하게 합니다. 마지막으로, AI 이미지 분석은 새로운 방사선 요법 예측 바이오마커의 식별을 용이하게 합니다.우리는 저분획 방사선 요법에 대한 종양 반응과 관련하여 몇 가지 발견을 했으며, 최근에는 방사선 생물학적으로 유의미한 지표와 추상화된 AI 유래 조직 반응 지표의 시간적 동역학을 포함했습니다. 또한 MRI, 거시적 및 광간섭 단층촬영, 현미경, 혈관 조영술 파생 지표를 모두 연관시켜 보다 정확하게 수행되는 멀티모달 이미징에 대한 가능성을 입증했습니다. 종단 연구의 유효 기간을 연장함으로써, 우리는 장기 종양 치료 반응에 대한 예측 바이오마커를 더 잘 식별할 수 있습니다.또한, 거시적 임상적으로 이용 가능한 이미징 양식과 현미경적 전임상 이미징 방식 간의 동시 등록의 견고성을 개선함으로써, 우리는 벤치탑에서 병상으로 연구 결과의 번역 가능성을 향상시킬 수 있습니다. 정위 신체 방사선 치료 중에는 고선량의 방사선이 감소된 분획을 전달합니다. SVRT에서 세포 사멸 증가와 관련된 잠재적인 방사성 생물학적 표적 중 하나는 종양 미세혈관입니다.고해상도 광학 혈관 조영술과 MRI를 결합하여 환자별 SVRT 치료 계획과 결과 개선을 위한 기능적 MRI 미세혈관 이미징을 가능하게 하고자 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 이식된 두개골 창을 통해 마우스 모델에서 사전 주입된 암세포의 생체 내 이미징을 수행합니다. 이 고해상도 타임 랩스 이미징 기술을 통해 살아있는 쥐에서 암세포의 동적 거동을 연구할 수 있습니다.

마우스 모델의 두개창 기반 생체 내 이미징: 쥐 모델의 뇌에서 사전 주입된 암세포의 행동을 연구하기 위한 이미징 기술

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

이 프로토콜은 최대 4마리의 동물에 대해 다중 챔버 침대를 사용하여 유전자 조작 마우스 모델에서 췌장 선암종 종양을 검출하기 위해 최대 4대의 동물에 대해 병렬 자기공명영상(MRI)을 촬영합니다. 이 다동물 MRI 프로토콜은 종양을 빠르고 비용 효율적으로 탐지하고 측정하여 전임상 연구를 위한 동물 선발과 종양 성장의 종단 모니터링을 용이하게 합니다.

췌장암 마우스 모델에서 종양 측정을 위한 다동물 자기공명영상

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

낮은 분야 (L-밴드, 1.2 g h z) 전자 상자성 공명 녹는 nitroxyl 및 trityl 프로브를 사용 하 여 유방암의 마우스 모델에서 종양 microenvironment에 생리 적으로 중요 한 매개 변수 평가 대 한 시연입니다.

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

여기에서 우리는 동일한 살아있는 동물 내의 침습적 외과 적 개입 (예를 들어, 생검) 전후 뇌 종양 세포의 고해상도 시간 경과 다광자 이미징을위한 방법을 설명합니다. 이 방법은 종양 세포의 철새, 침략적 인 행동에 대한 이러한 침습적 인 외과 적 절차의 영향을 단일 세포 수준에서 연구 할 수 있습니다.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

배우세요 생체 내 현미경과 MRI를 결합한 등쪽 피부창 종양 마우스 모델을 통해 종양 미세혈관과 방사선 치료 반응을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 전임상 연구 결과의 임상 적용을 가속화합니다.

중개 암 연구에서 생체 내 현미경 및 자기 공명 영상의 결합을 위한 Dorsal Skinfold Window Chamber 종양 마우스 모델

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