Name: Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 Picrosirius Red Staining) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: 배우세요 Picrosirius Red 염색법을 활용한 쥐 폐 동종이식 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 평가 방법을. 이 기술은 섬유화 조직의 두꺼운 섬유와 가는 섬유를 구분하여 이식 거부 반응 연구에 활용됩니다.

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모든 동물 프로토콜은 인도적 동물 연구를 위한 3R의 윤리 원칙을 준수하며 지역 수의학 윤리 위원회(Veterinäramt Kanton Zürich, 스위스, 연구 번호 45/2014)의 승인을 받았습니다. 마찬가지로, 독자는 실험실 동물에 대한 절차를 수행하기 전에 관련 기관의 허가를 받아야 합니다.
1. 샘플 수집
<ol>
	<li>개인의 필요와 윤리적 승인에 따라 동물 실험을 수행합니다. 한 명의 미세외과 의사가 추가적인 허혈 시간 연장 없이 모든 수술을 수행합니다. 참고: 대표적인 결과를 재현하려면 Charles River Laboratories에서 27-30g 무게의 특정 병원체가 없는 성인 수컷 C57BL/6J, C57BL/10J 및 BALB/c 마우스를 구하십시오. 동종 이식편의 경우, C57BL/6J 동물을 기증자와 수혜자로 사용합니다. 경미한 불일치 모델에서는 C57BL/10J 기증자 폐를 C57BL/6J 수혜자에게 이식합니다. 주요 불일치 모델에서는 BALB/c 기증자 폐를 C57BL/6J 투여자에게 이식하고 수술 후 사이클로스포린(10mg/kg/일)과 메틸프레드니솔론(1.6mg/kg/일)을 매일 피하 주사한다5. 관류를 위해 식염수를 사용하고 8주(56일) 후에 폐를 회수합니다.</li>
	<li>안락사의 경우 동물에게 20G 카테터를 삽관하고 2%-3% 이소플루란이 보충된 O2 로 인공호흡을 합니다. 발 꼬집기에 대한 반응이 없는 것으로 충분한 마취 깊이를 확인하십시오.</li>
	<li>수술용 가위로 복벽을 절개하고 흉골 길이를 잘라 심장을 노출시켜 정중 복강흉골 절개술을 시행합니다. 하대정맥(inferior vena cava)과 좌심방 부속기(left atrial appendage)를 해부학적 위치로 식별합니다.</li>
	<li>수술용 가위로 하대정맥과 좌심방 부속기를 빠르게 연속적으로 절단하고 주사기로 폐동맥 뿌리를 통해 0.9% NaCl 3-5mL를 관류하여 폐순환에서 모든 혈액을 제거합니다. 참고: 안락사는 각각의 윤리적 승인에 따라 수행되어야 합니다. 다른 방법도 동일하게 적용할 수 있습니다. 폐 순환에서 혈액을 철저히 제거하는 것이 좋으며, 이는 순환 정지 후 관류에 의해 수행될 수도 있습니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 관류된 폐를 제거합니다.</li>
	<li>보존을 위해 샘플을 4% 포르말린으로 배양하십시오. 포르말린 용액을 기관지와 폐 혈관 조직에 직접 주입합니다. 샘플을 포르말린에 담그고 최소 6시간 동안 배양합니다. 참고: 포르말린으로 폐를 팽창시키는 경우, 유사한 결과를 얻기 위해 표준화된 절차를 적용해야 합니다. 이러한 절차에 대한 예시 프로토콜은 다른 곳에 발표되어 있습니다10,11.</li>
	<li>실험적 필요에 따라 장기를 다듬습니다. 횡단으로 폐를 반으로 잘라 한 단면에 있는 기관지 나무의 모든 부분을 포착합니다.</li>
	<li>70% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올(각 1시간), 100% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 에탄올, 자일롤(각 2시간), 자일롤(1시간) 및 파라핀 3x와 같이 알코올 시퀀스의 탈수를 위해 샘플을 자동 조직 처리기로 옮깁니다.</li>
	<li>파라핀을 녹이고 Polyoxymethylen 임베딩 카세트에 올바른 방향으로 샘플을 삽입합니다. 절단면이 아래를 향하도록 샘플을 삽입하도록 주의하십시오. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5μm 절편을 연속적으로 절단합니다. 추가 처리 전에 슬라이드를 37°C에서 24시간 동안 건조시키십시오.</li>
</ol>
2. 파라핀 활주의 Deparaffinization 그리고 수화는
<ol>
	<li>샘플을 100% 자일롤에 2회 각각 5분 동안 배양하여 파라핀을 제거합니다. 주의 : 자일롤은 가연성이며 건강에 해롭습니다. 흄 후드 아래에서만 사용하십시오.</li>
	<li>샘플을 100% 에탄올, 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올로 각각 2분 동안 수화합니다. 그런 다음 증류수로 2분 동안 씻습니다.</li>
</ol>
3. Picrosirius Red로 염색하기
<ol>
	<li>염색은 Meyer의 hemalum 용액에서 8분 동안 미끄러집니다. 흐르는 수돗물에 10분 동안 슬라이드를 세척합니다.</li>
	<li>Picrosirius Red 용액에서 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다. Picrosirius Red 용액의 경우 미리 혼합된 염색 용액을 사용하거나 포화 피크르산에 희석된 Direct Red 80 또는 Sirius Red F 3B(CI 35780) 0.1%를 사용합니다. 주의: 피크르산은 가연성이며 폭발성이 높으므로 조심스럽게 다루어야 합니다. 참고: 재료 표에 나열된 바와 같이 Picrosirius Red 염색 키트에 대한 다양한 공급업체가 있습니다. 가격과 염색 방법의 차이를 인식하고 항상 공급업체의 지침을 준수하십시오. Sirius Red F 3B(CI 35780)에 대한 특정 색상 지수가 있는 염색 키트만 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>슬라이드를 5x-10x를 아세트산 용액(0.5%)에 담급니다. 슬라이드를 부드럽게 흔들어 용액을 물리적으로 제거합니다.</li>
	<li>슬라이드를 95% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 자일롤로 각각 5분 동안 탈수합니다.</li>
	<li>각 샘플에 장착 매체 한 방울을 추가하여 삽입하고 커버슬립으로 덮습니다. 흄 후드 아래에서 슬라이드를 말리십시오.</li>
</ol>
4. 디지털화 및 이미지 처리
<ol>
	<li>사진이 선명하고 선명해질 때까지 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 광학 현미경으로 샘플의 초점을 맞춥니다. 편광 필터를 추가하고 배경이 완전히 어둡거나 검게 될 때까지 편광 정도를 조정합니다. 배경이 가능한 한 어두우면 올바른 편광이 달성됩니다. 참고: 편광 필터 없이 기존의 투과광을 사용하여 Picrosirius Red 염색을 시각화하는 것도 가능합니다. 이를 위해 시리우스 레드와 패스트 그린을 사용하는 것이 좋은데, 이는 시리우스 레드를 단독으로 사용하는 것보다 더 민감한 것으로 나타났기 때문이다12,13. 그러나 두꺼운 콜라겐 섬유와 얇은 콜라겐 섬유를 구별하기 위해 편광 현미경이 필요합니다.</li>
	<li>20배 배율로 모든 샘플을 완전히 스캔하고 .tiff로 내보냅니다. 피지 소프트웨어로 전송14. 슬라이드를 미리 적절하게 청소하고 노출 시간 및 광원 강도에 대한 표준화된 설정을 사용하십시오.</li>
	<li>샘플을 수동으로 둘러싸고 소프트웨어에서 Edit &gt; Clear Outside를 사용하여 잘라냅니다. Analyze &gt; Measure(분석 측정)를 클릭하여 전체 표면적을 측정합니다. 참고: 측정할 구획을 선택하는 것은 신뢰할 수 있고 비교 가능한 결과를 만드는 데 중요한 단계입니다. 전체 샘플을 디지털화하고 선택함으로써 양호한 단면을 표시하고 이질적인 조직을 전체적으로 고려합니다. 그러나 흉막 또는 개별 기관지와 같은 샘플 내의 특정 영역에 국한하는 것도 가능합니다. 항상 표준화된 방식으로 비교할 구획을 선택해야 합니다. 샘플이 환기에서 큰 변동성을 보이는 경우, 분석된 격실(15)에서 공역 영역을 제외하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>Image &gt; Adjust &gt;Color Threshold를 클릭하여 색상 임계값을 사용하여 샘플당 총 콜라겐 함량을 측정하고 Analyze &gt; Analyze Particles를 클릭하여 설정을 조정합니다. 크기 = 1 - 무한대, 지우기, 요약을 설정합니다. 밝기 = 35 - 255. 색조 = 2 - 130 참고: 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 색상 임계값을 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>두껍고 얇은 콜라겐 섬유에 대해 색조를 빨간색 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> 의 두꺼운 콜라겐 섬유(Hue 2-30) 및 황록색 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> 의 얇은 콜라겐 섬유(Hue 31-130)로 조정하여 반복합니다. 결과는 스테인드 픽셀의 영역이됩니다.</li>
	<li>Plugins &gt; Macros &gt; Record를 클릭하여 자동화된 처리를 위해 매크로를 구성하고 모든 샘플에 대해 반복합니다.</li>
	<li>단면의 표면적에 맞게 표준화된 최종 값을 받으려면 모든 매개변수에 대한 염색된 픽셀의 면적을 각 샘플에 대해 각각 4.3 및 4.5단계에서 측정한 총 표면적으로 나눕니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Picrosirius Red Staining을 사용한 쥐 폐 섬유증의 콜라겐 평가

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<li>vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+biomarkers+of+fibrosis+in+chronic+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev+%28Orlando%29%22%5BJournal%5D)">The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction.</a> Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Honeywell, Charlotte, USA</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>4633000956 (일련 번호)</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip 1.5</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>KCY5.1</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 37%</td><td>Fisher Scientific, Leicestershire, UK</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Meyer's hemalum solution</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Solution</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>13422</td><td>사용할 수 있는 대안: ab150681, abcam, Cambridge, UK; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US</td></tr><tr><td>편광 필터</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>00000-1121-813</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome, HistoCore AUTOCUT</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>149AUTO00C1, 14051956472</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt mounting medium</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Plast Paraffin</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6642.5</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo 임베딩 카세트, POM</td><td>Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>K113.1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 접착 현미경 슬라이드</td><td>epredia, 영국 포츠머스</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji 소프트웨어 버전 2.14.0/1.54f</td><td>오픈 소스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어 ZEN 3.4.91</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

picrosirius red staining for semiquantitative histopathologic evaluation of collagen deposition in murine models of chronic lung allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 picrosirius red staining)

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft Rejection

위에서 설명한 프로토콜은 쥐 폐 조직의 콜라겐 침착에 대한 객관적인 반정량적 평가를 가능하게 합니다. 섬유성 리모델링은 폐 이식 후 만성 거부 반응의 병태생리학적 특징입니다. 따라서 Picrosirius Red 염색은 좌측 쥐 정소성 폐 이식을 사용하여 만성 폐 동종이식 거부 반응 모델에 적용되었습니다. 경미한 면역억제 하에서 BALB/c 기증자에서 C57BL/6 수혜자에게 MHC 불일치가 심하게 이루어지는 폐 이식의 주요 폐 이식은 인간의 만성 폐 동종이식 기능 장애에 필적하는 섬유화 변화를 초래한다5. 대조적으로, C57BL/10 기증자에서 C57BL/6 수혜자로의 경미한 MHC 불일치 이식은 주로 림프구성 세기관지염6을 유발합니다. 그림 1 은 실험 설정을 자세히 보여줍니다.
그림 2...

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 Picrosirius Red Staining)

Fibrosis is the pathophysiologic hallmark of chronic rejection after lung transplantation and the foremost hurdle to long-term recipient survival. Several ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 섬유화 조직 절편에서 과도한 콜라겐 침착을 감지하기 위해 섬유화 조직의 피크로시리우스 레드 염색을 설명합니다. 염색 기법은 결합 조직 질환에서 콜라겐 발현을 평가하는 데 도움이 됩니다.

Picrosirius Red Polarization Staining: 명시야 현미경을 사용하여 심장 조직 절편에서 섬유증을 감지하는 기술

여기에서는 거부 반응의 면역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 수술 모델은 짧은 수술 시간과 간결한 기술을 보여주었습니다. 기증자-수용자 균주 조합에 따라 이식된 신장은 간질성 섬유증 및 세뇨관 위축으로 정의되는 급성 세포 거부 반응 또는 만성 동종이식 손상이 발생할 수 있습니다.

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

연쇄상구균 폐렴은 심장에 별개의 비화농성 현미경 병변을 형성합니다. 요약된 것은 심장 미세 병변 형성의 쥐 모델에 대한 프로토콜입니다. 현미경을 사용한 미세 병변 시각화, 초기 미세 병변과 후기 미세 병변 구별, 회복기 동물의 심장에서 심장 리모델링을 감지하는 방법에 대한 지침이 제공됩니다.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

이 연구의 목적은 화상 상처 치유의 뮤린 모델을 개발하는 것이었습니다. 예열된 황동 템플릿을 사용하여 마우스의 등불 피부에 열 화상이 유도되었다. 연소된 조직은 유전적으로 유사한 기증자 마우스의 꼬리에서 수확한 피부 이식으로 파괴되고 겹쳐졌습니다.

동종 유전자 이식편으로 재구성된 화상 상처의 뮤린 모델

이 프로토콜은 비강 점적을 통해 실리카 현탁액에 반복적으로 노출되어 규폐증의 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 높은 반복성과 경제성으로 인간 규폐증의 병리학적 과정을 효율적이고 편리하며 유연하게 모방할 수 있습니다.

결정질 실리카 분진을 반복적으로 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델

우리는 담도 폐쇄증(BA)에 대한 바이러스 유발 간 섬유증 기계론적 연구에 적합한 동물 모델과 향후 BA 치료를 위한 플랫폼을 제공하는 만성 간 섬유증의 마우스 모델을 확립했습니다.

담도 폐쇄증 연구를 위한 만성 간 섬유증의 마우스 모델

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

대사 기능 장애, 간 유전자 발현 변화 및 진행성 섬유증 3기로 진행되는 섬유증을 포함하여 인간 MASLD와 유사한 간 조직병리학적 변화를 동반한 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 마우스 모델. 이 모델은 MASLD 병태생리학 연구 및 새로운 치료법의 전임상 연구에 사용할 수 있습니다.

섬유증을 동반한 대사성 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 마우스 모델

이 프로토콜은 블레오마이신의 반복적인 구인두 투여를 통해 마우스에서 폐섬유증을 유발하는 방법을 설명하며, 이는 특발성 폐섬유증과 매우 유사한 병리학적 특징을 산출합니다.

특발성 폐섬유증의 정제된 쥐 모델

수술을하기 전에, 새로운 외과 수술의 기본 기술과 개념의 교육이 있어야합니다. 이 문서는 설치류에 대한 강조와 함께 기본적인 수술 고려 사항을 제시합니다.

뉴 외과 의사에 대한 쥐 외과의 원칙

배우세요 Picrosirius Red 염색법을 활용한 쥐 폐 동종이식 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 평가 방법을. 이 기술은 섬유화 조직의 두꺼운 섬유와 가는 섬유를 구분하여 이식 거부 반응 연구에 활용됩니다.

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 Picrosirius Red Staining) (동영상) | JoVE Journal

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