Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft rejection(만성 폐 동종이식 거부 반응의 쥐 모델에서 콜라겐 침착의 반정량적 조직병리학적 평가를 위한 Picrosirius Red Staining)
2025년 3월 21일
Picrosirius Red staining은 공간적으로 분해된 방식으로 쥐 폐 섬유화 리모델링에서 콜라겐 침착을 객관적으로 평가하기 위한 반정량적 방법입니다. 총 콜라겐 침착을 평가하는 것 외에도 Picrosirius Red 염색을 통해 두께가 다른 콜라겐 섬유를 구별할 수 있습니다.
본 연구는 만성 폐 동종이식 거부반응에서 섬유증의 발생을 분석하는 데 중점을 두고 있습니다. 따라서 우리는 섬유성 조직 구획을 특성화하는 방법에 관심이 있습니다. 이식 관련 질병을 재현하기 위해 우리는 몇 년 전에 도입한 단일 폐 이식의 마우스 모델을 사용합니다.
이 모델에서는 동종 마우스 균주 사이의 폐 이식이 다양한 수준의 이식 섬유화를 초래하는 것으로 나타났습니다. 섬유성 조직 리모델링에 대한 조직학 데이터는 종종 정성적으로 제시됩니다. Picrosirius Red 염색을 사용하는 당사의 방법은 반정량 평가의 이점을 제공하며 두꺼운 콜라겐 섬유와 얇은 콜라겐 섬유를 구별합니다.
먼저 파라핀이 함유된 마우스 폐 샘플을 각각 2분씩 감소시키는 에탄올 농도로 수화합니다. Meyer의 헤말럼 용액에 슬라이드를 8분 동안 염색합니다. 흐르는 수돗물에 슬라이드를 10분 동안 세척한 다음 Picrosirius Red 용액에서 슬라이드를 1시간 동안 배양합니다.
슬라이드를 0.5% 아세트산 용액에 5-10회 담급니다. 슬라이드를 부드럽게 흔들어 용액을 제거합니다. 이제 에탄올 농도와 100% 자일롤을 각각 5분 동안 증가시키는 슬라이드를 탈수합니다.
삽입을 위해 샘플에 장착 매체 한 방울을 추가하고 커버 슬립으로 덮습니다. 흄 후드 아래에서 슬라이드를 건조시키십시오. 광학 현미경 아래에서 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 선명하고 선명한 이미지를 얻을 때까지 샘플의 초점을 맞춥니다.
배경이 완전히 어둡거나 검게 될 때까지 편광 필터의 정도를 조정합니다. 20배 배율로 샘플을 스캔하고 이미지를 TIFF 형식으로 내보냅니다. 이미지를 피지 소프트웨어로 전송합니다.
편집을 클릭하고 외부 지우기를 선택합니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭한 다음 Measure(측정)를 클릭하여 총 표면적을 측정합니다. 샘플당 총 콜라겐 함량을 측정하려면 Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust and Color Threshold(조정 및 색상 임계값)를 클릭합니다.
색조를 2에서 130 사이로, 밝기를 35에서 255 사이로 설정합니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭하고 Analyze Particles(파티클 분석) 창에서 크기를 1 빼기 무한대로 설정하고 Clear(지우기) 및 Summarize(요약) 상자를 선택합니다. 두꺼운 콜라겐 섬유를 분석하려면 색조를 빨간색으로 조정하고 얇은 콜라겐 섬유를 분석하려면 황록색으로 조정하고 총 콜라겐 수를 측정합니다.
마지막으로 Plugins(플러그인), Macros(매크로) 및 Record(기록)를 클릭하여 자동화된 처리를 위해 매크로를 구성합니다. Masson의 trichrome, Herovici's 및 Picrosirius Red 염색은 주요 조직적합성 복합체 불일치 모델에서 광범위한 기관지 및 혈관 주위 콜라겐 침착을 보여주었습니다. 경미한 불일치 모델은 주로 덜 강렬한 콜라겐 침착과 함께 밀집된 림프구 침윤을 보여주었습니다.
편광 필터로 Picrosirius Red 염색을 하면 두 모델 모두에서 침전된 섬유의 녹색 모양이 드러났습니다. 동위 이식 대조군은 콜라겐이 순진한 쥐의 폐와 유사하게 기관지 주위 및 혈관 주위 경계에 국한되어 있음을 보여주었습니다. 디지털 이미지 분석은 경미한 불일치 이식편, 우측 미접촉 폐 조직 또는 나이브 BALB/c 좌측 폐에 비해 주요 조직적합성 복합체 불일치 폐 이식편에서 총 콜라겐이 증가한 것으로 나타났습니다.
두꺼운 콜라겐 섬유에서는 차이가 나타나지 않았다. 얇은 콜라겐 섬유를 분석한 결과, 경미한 불일치 모델, 즉 미성숙한 우측 폐 조직 또는 미성숙한 BALB/c 좌측 폐에 비해 주요 미스매치 모델에서 존재감이 증가한 것으로 나타났습니다.
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개요
본 연구에서는 마우스 이식 모델을 사용하여 만성 폐 동종이식 거부반응에서의 섬유화 진행을 조사합니다. 주요 방법론으로는 Picrosirius Red 염색을 사용하여 콜라겐 침착을 반정량적으로 평가하며, 이를 통해 두꺼운 콜라겐 섬유와 얇은 콜라겐 섬유를 구분합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 만성 폐 이식편 거부반응
- 섬유성 조직 특성 분석
- 마우스 이식 모델
배경
- 섬유성 리모델링을 정성적으로 평가하는 것이 일반적이지만, 본 연구는 보다 정량적인 접근 방식을 제공합니다.
- 동종 생쥐 계통 간에 서로 다른 수준의 이식편 섬유화가 관찰됩니다.
- 이식편의 생존 능력과 조직 반응을 이해하기 위해서는 조직학적 분석이 필수적입니다.
사용된 방법
- 콜라겐 평가를 위한 Picrosirius Red 염색
- 폐 이식을 위한 마우스 모델
- 전용 소프트웨어를 이용한 디지털 이미지 분석
주요 결과
- 소주요 조직 적합성 복합체(minor MHC) 불일치 이식편에 비해 주요 조직 적합성 복합체(major MHC) 불일치 이식편에서 총 콜라겐이 증가하였습니다.
- 대조군에 비해 주요 불일치 모델에서 얇은 콜라겐 섬유가 더 많이 나타났습니다.
- 조건 간에 굵은 콜라겐 섬유의 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다.
결론
- 본 연구는 폐 이식편의 섬유화 변화를 평가하는 데 있어 Picrosirius Red 염색의 효과를 입증합니다.
- 이러한 연구 결과는 이식 생물학에서 이식편 거부 반응 및 섬유화를 이해하는 데 유용합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
섬유화의 정량적 평가는 만성 폐 동종이식 거부반응의 전임상 모델에서 매우 중요한 과제이며, 이는 중개 연구의 예측 신뢰도에 직접적인 영향을 미칩니다. Picrosirius Red 염색은 콜라겐 침착의 반정량적 평가를 가능하게 하여, 섬유성 질환 모델에서 기전적 리스크 감소와 타겟 검증을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 조직 재형성에 대한 재현 가능하고 공간적으로 분해된 데이터를 제공함으로써 포트폴리오 의사결정 능력을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 질환 관련 시스템에서 섬유화 경로의 조사와 콜라겐 리모델링의 정량화를 가능하게 합니다.
- 동종이식 조직 내에서 두꺼운 콜라겐 섬유와 얇은 콜라겐 섬유를 구분함으로써 생물학적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다.
- 항섬유화 전략을 위한 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 마우스 모델 내 후속 화합물 스크리닝을 위해 검증된 조직병리학적 엔드포인트를 준비합니다.
- 연구 간 재현성을 위해 반정량적 콜라겐 측정법을 표준화합니다.
- 정량적 분석 결과 도출을 위한 확장 가능한 디지털 이미지 분석 워크플로를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 폐 이식 연구에서 전임상 섬유화 정량 분석을 중개 바이오마커 개발과 일치시킵니다.
- 발견 단계의 기전 연구부터 항섬유화 중재법의 전임상 검증까지 연속성을 제공합니다.
- 조직 리모델링의 심각도를 정량화함으로써 위험 조정된 진행 결정 과정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
본 방법은 마우스 폐 동종이식 모델에서 견고한 섬유화 정량을 가능하게 함으로써, 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속 과정에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 만성 거부 반응에서의 섬유성 리모델링 및 경로 관여에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 어세이 개발 및 화합물 평가를 위해 재현 가능하고 정량적인 콜라겐 판독값을 제공합니다.
- 분석: 실험군 간의 통계적 비교를 위한 디지털 이미지 분석 결과물을 제공합니다.
- 중개 연구: 전임상 섬유화 종점과 잠재적인 임상 바이오마커 전략을 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 다양한 모델에 걸쳐 섬유화 평가를 위한 표준화되고 재사용 가능한 워크플로우를 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 섬유화 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 조직병리학적 분석의 표준화, 재현성 및 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 강력한 정량적 엔드포인트를 제공함으로써 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 항섬유화 후보 물질 및 모델의 위험 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 조직병리학 및 디지털 이미지 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 현미경, 편광 필터 및 이미지 처리 소프트웨어(예: Fiji)의 사용 권한이 필요합니다.
- 염색 및 분석 프로토콜의 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 조직 유형이나 동물 모델에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
- 잠재적인 제한 사항으로는 염색 강도 및 이미지 임계값 설정의 가변성이 포함됩니다.
