Name: 고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 연속 이광자 단층촬영을 이용한 살모넬라 감염 마우스 비장의 고분해능 3차원 전장기 영상화 방법입니다. 이 기술은 항생제 내성 감염 치료 전략 개발에 중요한 숙주-병원체 상호작용을 정밀 분석합니다.

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이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation) 310030_156818, 310030_182315 및 NCCR_ 180541 AntiResist(to DB)의 지원을 받았다.

Fluorescent Reporter 정량화를 통한 전체 장기 병원체 추적

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
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저자는 밝힐 것이 없습니다.

세균 병원체의 국소 조직 맥락은 국소 숙주 공격, 세균 적응, 숙주 병원체 상호 작용 및 항균 화학 요법의 국소적 결과, 전체 질병 결과에 대한 개별 기여도를 결정하는 데 중요합니다. 센티미터 크기의 장기에서 마이크로미터 크기의 박테리아를 이미징하는 것은 어려운 일이었습니다. 연속 이광자(STP) 단층 촬영은 전체 장기에서 개별 박테리아 세포를 검출할 수 있는 충분한 공간 해상도, 자동화된 절편 및 이미징, 충분한 처리량(하루에 ~1개의 장기)을 제공합니다11. 숙주 항원은 in vivo에서 염색할 수 있지만, 병원체 세포는 세포 내 병원체 세포를 종합적으로 검출할 수 있도록 적절한 형광 단백질을 발현해야 합니다. 결과 데이터 세트(장기당 0.5-1.5테라바이트)는 데이터 분석 및 저장을 위한 IT 인프라에 상당한 문제를 제기합니다.
이 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 형광 단백질 GFP 또는 YFP의 검출 가능하고 균일한 발현을 가진 병원체 균주가 필요합니다. 이상적으로는, 염색체 발현 카세트(25 )를 사용하여 플라스미드 복제수 변이로 인한 형광 이질성을 최소화합니다. 충분한 형광 강도가 필요하지만 병원체(23)의 체력 장애를 피하기 위해 과도한 수준의 형광 단백질은 피해야 한다. 적절한 발현 수준은 적절한 프로모터의 선택 및 리보솜 결합 부위(25 ) 또는 전체 5' 번역되지 않은 영역(UTR)(26)의 미세 조정에 의해 얻어질 수 있다. 둘째, 관류 고정에는 혈액 순환에서 가능한 한 많은 적혈구를 제거하기 위해 완충액으로 초기 세척이 포함되어야 합니다. 이는 비장과 간에 특히 중요합니다(이러한 기관에서 적혈구를 완전히 제거하는 것은 어렵지만). 나머지 적혈구는 스펙트럼의 가시광선 부분에서 빛을 흡수하여 이미징 품질을 저하시킨다27. 셋째, 동결보호제에 고정된 조직을 보관하는 것은 염증 조직에서 특히 높고 병원체 세포의 상대적으로 약한 형광을 가려줄 수 있는 조직 자가형광을 줄이는 데 중요하다11. 넷째, 조직을 주변 아가로스 블록과 효과적으로 가교하는 것은 조직이 아가로스 블록에서 튀어나오지 않고 부드러운 비브라톰 절단에 중요합니다. 다섯째, 형광 신호와 병원체 세포로서의 식별은 병원체 성분에 대한 항체(예: 그람 음성 세균에 대한 지질다당류)로 염색하고 단층검사에서 검색한 절편의 컨포칼 현미경과 같은 직교 접근법을 사용하여 독립적으로 검증해야 합니다11. 일부 감염된 조직에는 병원체 세포로 쉽게 오인될 수 있는 유사한 모양과 겹치는 형광 스펙트럼을 가진 자가형광 입자가 포함되어 있습니다. 여섯째, 미세콜로니 내 병원체 세포의 양을 공초점 현미경과 같은 직교 접근법과 비교하여 정확도를 평가해야 합니다. 이러한 계산을 기반으로 한 전체 박테리아 부하는 유세포 분석 및 도금과 같은 직교 접근법과 비교하여 검증해야 합니다.
널리 사용되는 STP 프로토콜의 중요한 수정 사항에는 감염 및 염증이 있는 간, 비장 및 Peyer's patch에서 특히 강한 녹색-노란색 자가형광의 간섭을 줄이기 위해 광전자 증배관 211 앞에 협대역 통과 필터 510/20nm를 배치하는 것이 포함됩니다. 뇌(STP의 다른 응용 분야를 지배함)에 비해 이러한 장기의 강력한 자가형광 및 증가된 광 산란은 또한 불균일한 조명에 대한 보다 효과적인 보정이 필요합니다. 또 다른 수정 사항으로, 이 프로토콜은 이러한 목적을 위해 CIDRE 접근법22 (그림 3)와 박테리아의 AI 기반 세분화를 사용합니다. 마지막으로, -20°C에서 동결보호제에 배양 단계를 포함하여 조직 자가형광을 감소시켜 상대적으로 형광이 약한 작은 병원체 세포의 검출을 용이하게 함으로써 조직 전처리를 변경했습니다11.
병원체 신호를 감지할 수 없거나 세분화로 인해 감도가 충분하지 않거나(너무 많은 병원체 세포가 누락됨) 정밀도가 충분하지 않는(너무 많은 배경 입자가 병원체 세포로 분할됨) 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 배경 조직 자가형광을 검출할 수 있지만 병원체 신호가 너무 적으면 병원체에 형광 단백질이 충분하지 않을 수 있습니다. 이는 동일한 감염된 조직의 조직 절편을 컨포칼 현미경으로 검사하거나 조직 균질체19,28의 유세포 분석을 사용하여 테스트할 수 있습니다. 근본적인 원인은 불충분한 발현 수준 또는 익스프레션 카세트의 불안정성일 수 있습니다. 완화 전략에는 발현을 유도하는 대체 프로모터, 병원체 종에 대한 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 코돈 적응, 복제 수가 더 높은 에피솜 구조체의 사용, 염색체 통합 또는 균형 치사 보완에 의한 발현 카세트의 안정화가 포함될 수 있습니다29. 형광 단백질의 선택도 중요하지만 GFP.mut2, mWasabi, YPet 및 TIMERbac으로 검출이 가능합니다. 분할이 정확하지 않은 경우, 이는 위에서 설명한 대로 해결할 수 있는 너무 약한 병원체 형광 또는 너무 높은 조직 자가형광 배경이 원인일 수 있습니다. 세척 용액을 광범위하게 관류하거나 아가로스 블록 및 단층 촬영에 삽입하기 직전에 저장 완충액에서 장기간 배양하면 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 마지막으로, 정확한 분류를 위해서는 신경망에 대한 충분한 훈련이 필요하지만, 과도한 훈련은 새로운 샘플에 대한 성능을 저하시키는 과적합으로 이어질 수 있습니다.
현재 다른 어떤 방법도 개별 박테리아를 검출하기 위해 3D로 충분한 공간 해상도로 전체 장기를 이미지화할 수 없습니다. 조직 투명화 및 광시트 현미경 검사의 향후 개선으로 유사한 해상도를 달성할 수 있습니다. 이를 통해 더 빠른 속도와 더 많은 형광 채널로 이미징할 수 있습니다.
STP의 중요한 제한 사항은 ~0.5 μm의 평면 내 픽셀 해상도와 5 - 10 μm의 수직 해상도로, 예를 들어 조밀하게 밀집된 미세콜로니 내에 밀접하게 위치한 박테리아를 해결하기에는 충분하지 않습니다. 그러나 선택한 조직 부분의 2차 고해상도 컨포칼 현미경 검사를 위해 단층 촬영 후 조직 절편을 회수할 수 있습니다. STP의 또 다른 한계는 3개의 형광 채널만 사용할 수 있다는 것인데, 이는 동시에 이미징할 수 있는 형광단의 수를 제한합니다. 다시 말하지만, 멀티플렉싱 방법을 사용하여 검색된 조직 절편의 2차 분석은 선택한 조직 부분에 대한 더 많은 마커의 위치와 강도를 밝힐 수 있습니다. 이 정보는 STP로 결정된 대로 주변 조직의 전체 3D 구조에 통합될 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 국소 및 전체 장기 수준에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 자세한 조사를 가능하게 합니다. 프로토콜은 다른 병원체(형광 균주로 얻을 수 있는 경우), 다른 장기 및 다른 숙주 종에 쉽게 적용할 수 있어야 합니다.

감염은 복잡한 해부학적 구조와 구획화된 생리학을 가진 조직에서 발생합니다. 감염된 조직에 공존하는 다양한 미세환경은 국소 병원체 하위 집합의 운명과 전체 질병 결과에 대한 기여도를 결정할 수 있습니다 1,2,3. 그러나 cm 크기의 조직에서 미생물 병원체에 대한 포괄적인 3D 매핑은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다4. 뇌 및 기타 장기의 이미징은실험 전략5을 지속적으로 개선하는 매우 활발한 연구 분야이지만, 많은 방법은 여전히 μm 크기의 박테리아 병원체를 자신 있게 식별하는 데 필요한 μm 미만의 해상도가 부족합니다. 이와 대조적으로, 연속 이광자(STP) 단층 촬영6은 μm 미만의 면내 해상도로 전체 조직의 자동화된 다중 색상, 변형 없는 이미징을 가능하게 하여 전체 체적 데이터 세트를 생성합니다. 이 방법은 진동체를 사용하여 조직의 반복적인 물리적 절편과 적외선으로 떠오르는 블록 면의 간헐적인 이광자 이미징을 결합합니다. STP 단층 촬영은 연결성 맵 7,8,9,10을 설정하기 위해 뇌의 얇은 축삭을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다.
STP 단층 촬영은 또한 단층 촬영을 사용하여 전체 감염 조직11,12에서 개별 미생물 병원체 세포(살모넬라, 톡소플라즈마)의 3D 매핑을 가능하게 합니다. 2차 조화 생성은 동맥 주위와 비장의 섬유주와 같은 섬유질 띠에서 콜라겐 덮개를 드러내어 해부학적 맥락을 제공합니다. In vivo 주입 형광 항체는 개별 병원체 세포와 호중구와 같은 침윤 면역 세포 간의 상호 작용을 밝히기 위해 숙주 세포를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 조직 처리, 이미징, 조명 보정을 통한 이미징 타일 스티칭, 3차원 이미지 적층 및 기계 학습 도구를 사용한 분할과 관련된 파이프라인에 대해 설명합니다. 이 파이프라인은 호스트 컨텍스트 내에서 개별 병원체, 세포 및 미세 콜로니의 3D 위치를 생성합니다. 미세콜로니 내의 개별 세포의 수를 세는 것은 해상도 한계 때문에 여전히 어렵지만, 이러한 숫자는 미세콜로니의 통합 밝기를 기반으로 추정할 수 있습니다. 파이프라인은 재조합 GFP 또는 YFP 발현 병원체를 사용할 수 있는 경우 다른 감염 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td><강>화학</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스 저용융</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>시그마-알드리치</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>순간 접착제 록타이트 435</td><td>헨켈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>시그마-알드리치</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>수소화붕소나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>71321-25G</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>머크</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>소듐 오디</td>에이트 <td>시그마-알드리치</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기</td><td>성 시그마-알드리치</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 일 염기성 이수화물</td><td>시그마 -알드리치</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>사붕산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>트리스 완충 식염수 (TBS)</td> <td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>진공 filtration 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI 레이저</td><td>스펙트럼 물리학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 금형</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 단층 촬영</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항체/염료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, 토끼</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, 클론 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, 클론 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-rabbit Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g 이상</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b 이상</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator(단층 촬영)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>시각화 소프트웨어 Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 이상</td><td></td></tr></tbody></table>

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(high-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

대부분의 감염은 복잡한 해부학적 구조와 국소적으로 다양한 숙주 생리학을 가진 3차원 숙주 조직 내에서 발생합니다. 이러한 다양한 환경 내에서 병원체 세포의 위치는 스트레스 수준, 반응, 운명 및 질병 및 치료 실패의 전반적인 진행에 대한 기여도에 큰 영향을 미칩니다. 그러나 cm 크기의 숙주 기관 내에서 μm 크기의 병원체 세포를 찾는 기술적 어려움으로 인해 이 연구 분야는 상대적으로 탐구되지 않았습니다. 여기에서는 이 문제를 해결하는 방법을 제시합니다. 우리는 연속 이광자 단층 촬영과 AI 강화 이미지 분석을 사용하여 감염된 마우스의 전체 비장, 간엽 및 전체 림프절에서 개별 살모넬라 세포를 찾습니다. 형광 리포터와 in vivo 항체 투여를 사용하여 단일 살모넬라 세포의 복제 속도, 특정 면역 세포와의 국소 상호 작용 및 항생제에 대한 박테리아 반응을 결정할 수 있습니다. 이러한 방법론은 3차원 조직 맥락 내에서 감염, 예방 및 치료에 대한 포괄적인 검사를 위한 길을 열어줍니다.

설명된 절차를 통해 비장, 간, 장간막 림프절 및 Peyer's patches11과 같은 전체 마우스 장기에서 개별 살모넬라 세포를 검출할 수 있습니다(그림 5 및 그림 6). 또한 쥐 뇌에서 Toxoplasma gondii 기생충을 검출합니다12. 간, Peyer's patches 및 비장을 포함한 일부 감염된 조직은 녹색-노란색 범위에서 상당한 자가형광을 방출합니다. 자가형광은 조직 구조를 보존하는 데 필요한 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와의 고정에 의해 더욱 향상됩니다. 이 자가형광 배경에 대한 GFP, mWasabi 및 TIMERbac의 녹색 성분으로부터의 녹색 형광 검출은 광전자 증배관 2(녹색 방출을 수집함) 앞에 협대역통과 필터 510/20nm(대부분의 GFP 방출을 투과하지만 자가형광 스펙트럼의 많은 부분을 차단함)를 배치하고 고정 조직을 동결보호제11에 3일 이상 보관하여 조직 자가형광을 감소시킴으로써 개선됩니다. 그러나, 박테리아는 아직도 GFP 다른 형광 단백질의 세포 당 적어도 수천 개의 사본을 표현해야 합니다. 반면에, 독성 약화로 이어질 수 있는 피트니스 비용을 최소화하기 위해 과도한 형광 단백질 농도는 피해야 한다23.
조직 내 형광 박테리아의 정확한 분할은 이미징 후 검색된 조직 절편의 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 확인할 수 있습니다. 특히, 지질다당류와 같은 박테리아 표면 성분에 대한 항체로 염색된 물체는 STP 단층 촬영으로 얻은 형광 이미지와 정렬할 수 있습니다(그림 5). 일부 염색된 살모넬라 세포에는 형광 단백질이 없어 컨포칼 현미경과 STP 단층 촬영 모두에서 형광을 검출할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 세포는 단일 분류 세포의 유세포 분류 및 성장 배양에 의해 입증된 바와 같이 숙주 면역 체계에 의해 사멸된 살모넬라균이며, 한천 플레이트의 집락 형성 단위 수와 유세포 분석법에 의해 측정된 형광 살모넬라 세포 수 사이의 밀접한 상관 관계가 입증되었습니다24. 또한, 플라스미드 손실은 비형광 생존 세포를 초래할 수 있으며, 이는 플라스미드의 selection marker에 해당하는 적절한 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 배지에 도금하여 테스트해야 합니다. pSC101 유래 플라스미드의 경우, in vivo 플라스미드 손실은 드뭅니다19. 11에서 사용된 sifB::gfp와 같은 대부분의 염색체 통합 발현 카세트의 경우, 생체 내에서 발현 손실을 감지할 수 없습니다. 분할이 면역조직화학 데이터와 일치하지 않는 경우 분할 파이프라인을 수정해야 합니다.
STP 단층 촬영의 해상도는 조밀하게 밀집된 미세콜로니 내의 개별 박테리아 세포를 해결하기에 충분하지 않습니다. 그러나 미세콜로니의 총 형광 강도는 살모넬라 세포의 수를 추정할 수 있습니다. 이를 위해서는 Salmonella sifB::gfp11과 같은 매우 균일한 형광 수준을 가진 형광 균주가 필요합니다. 모든 미세콜로니와 단일 세포에 대해 추정된 살모넬라 세포 수를 결합하면 조직 균질화합물의 도금 또는 유세포 분석과 같은 대체 방법과 일치하는 총 박테리아 조직 부하가 생성됩니다11. 도금과 유세포 분석은 STP 단층 촬영을 위해 관류 고정이 필요하기 때문에 동일한 조직에서 직접 수행할 수 없습니다. 대신, 고정되지 않은 추가 동물로 수행해야 합니다. 다양한 접근법에 의해 결정된 박테리아 부하의 중앙값이 3배 이상 다른 경우, 형광 박테리아의 생존력이 손상되거나(낮은 콜로니 형성 단위의 경우) 일부 박테리아가 형광 리포터 구조를 잃었을 수 있습니다(높은 콜로니 형성 단위의 경우). 이러한 불일치의 원인을 식별하기 위해 대조 실험이 필요합니다.
STP 단층 촬영은 감염된 조직의 3D 구조 내에서 박테리아 세포의 국소화를 제공합니다. 콜라겐의 두 번째 고조파 신호는 동맥 및 섬유주와 같은 해부학적 랜드마크를 제공합니다. 또한, 숙주 세포는 관류 전에 표면 마커에 항체를 주입하여 생체 내에서 염색할 수 있습니다(그림 5 및 그림 6). 이 염색은 조직 구획 및 염증 병소를 포함한 특정 미세환경에 대한 추가 랜드마크를 제공합니다(세포 내 마커 및 비장 백색 펄프 또는 뇌와 같은 확산 장벽이 있는 일부 구획은 쉽게 접근할 수 없어 생체 내 염색에 적합합니다). 이 접근법은 항균 화학요법 동안 살모넬라 균의 장기 생존을 가능하게 하는 조직 구획으로서의 비장 백색 펄프를 밝혀냈다11.
마지막으로, 중등도 또는 느린 속도로 복제되는 살모넬라균은 복제 속도11,15에 대한 단일 세포 리포터인 타이머bac를 발현하는 균주를 사용하여 조직의 3D 구조 내에서 식별하고 국소화할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> 그림 1: 연속 이광자(STP) 단층 촬영을 사용한 전체 장기 이미징 절차. (A-B) 장기는 심내 관류 후 적출하고 4°C에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 밤새 보관합니다. (C-E) 장기를 산화된 아가로스에 매립하고 가교 결합한 다음 STP 단층 촬영을 사용하여 조직을 스캔하고 절단합니다. 절편은 후속 면역조직화학을 위해 수집됩니다. (에프제이 ) 박테리아 수를 정량화하고, 형광 박테리아를 확인하고, 박테리아 위치를 3D로 재구성하기 위한 컴퓨터 분석 파이프라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> 그림 2: 연속 이광자(STP) 단층 촬영 설정. (A) (B) 2광자 이미징과 (C) 자동 직렬 조직 절편을 통합한 단층계. (D) 후속 조사를 위해 수집된 조직 절편. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> 그림 3: 타일 스티칭 및 조명 보정. 타일은 스티칭되고 불균일한 조명은 CIDRE(Regularized Energy Minimization)를 사용하여 수정된 강도 분포를 사용하여 수정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> 그림 4: SVM(Support Vector Machine) 및 CNN(Convolutional Neural Network)을 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 살모넬라 균의 세분화. (A) SVM으로 분할된 GFP 물체의 대표 이미지(왼쪽)와 SVM으로 분할된 영역이 있는 해당 이미지(오른쪽)(스케일 바: 10μm). (B) 세분화된 지역에 대한 클러스터된 RGB(Red-Green-Blue) 값 분포. (C) SVM에 의해 박테리아로 잘못 식별된 비 GFP 물체의 대표 이미지(왼쪽). CNN은 이를 배경으로 정확하게 기각합니다(오른쪽, 눈금자: 10μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> 그림 5: 단층 촬영에 의한 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 살모넬라 균 검출 및 면역조직화학에 의한 확인. 살모넬라 지질다당류(Salmonella lipopolysaccharide)에 대한 항체로 염색한 후 단층 촬영(왼쪽) 또는 컨포칼 현미경으로 획득한 동일한 단면의 이미지(오른쪽). 호중구(빨간색)는 관류 전에 PE 표지된 항-Ly-6G 항체의 생체 내 주입으로 염색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> 그림 6: 감염된 쥐 비장에서 살모넬라균 의 3D 재구성 및 국소화. (A) 5mm 두께의 비장 절편을 3차원(3D) 재구성하고 항-CD169 항체(빨간색)로 관류 전에 생체 내에서 염색합니다. 파란색 신호는 2차 고조파에 의해 감지된 콜라겐을 나타냅니다. (B) (A)에 표시된 3D 스택의 광학 평면 1개. 살모넬라 세포 또는 미세 식민지의 위치는 별표로 표시됩니다. (C) 감염된 간에서 살모넬라균 위치(별)의 3D 재구성. 동맥은 콜라겐 덮개(파란색)를 기준으로 볼 수 있습니다. 눈금 막대: 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

박테리아 감염은 인간의 건강에 큰 위협이 됩니다. 항생제 내성이 증가하고 있으며 여러 주요 병원체에 대한 백신은 여전히 부족합니다. 통제 전략을 위한 새로운 방법을 식별하려면 병원체가 숙주 면역 체계와 감염된 조직의 생체 내 항생제에 어떻게 반응하는지에 대해 더 많이 알아야 합니다.살아남은 박테리아는 항균제가 감염을 근절하지 못할 경우 재발을 유발할 수 있습니다. 연속 단층 촬영을 사용하여 살모넬라균을 유발하는 장티푸스가 치료 중 비장의 특정 부분에서 지속될 수 있음을 보여줍니다. 이 부위는 염증이 약하여 효과적인 제거를 위한 항생제와 염증 사이의 중요한 시너지 효과를 방해합니다.박테리아는 마이크로미터 크기의 물체입니다. 이러한 작은 물체를 조직 맥락에서 국소화하는 것은 어렵습니다. 연속 이광자 단층 촬영은 센티미터 크기의 장기에서 단일 박테리아 하나를 검출하고 복제 속도를 결정할 수 있습니다.또한 호중구와 같은 면역 세포를 검출하고 박테리아와의 공간적 관계를 결정할 수 있습니다. 우리는 정균 항생제의 활성을 연구합니다. 이러한 항생제는 감염을 치료할 수 있지만 실제로 병원체를 죽이지 않고 박테리아 성장만 억제할 수 있습니다.또한 특정 독성 인자가 결핍된 박테리아 돌연변이의 확산과 면역 결함이 감염 및 치료에 미치는 영향을 결정합니다.

high-resolution-three-dimensional-whole-organ-tomography-microbial

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

Lensfree 광학 tomography은 &lt;1 μm의의 공간적 해상도를 제공하는 입체 현미경 기법이다 × &lt;1 μm의 × 15~1백밀리미터의 큰 이미지 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기에서 &lt;3...

멀티 앵글 조명 및 픽셀 슈퍼 해상도를 채용 Lensfree 온칩 단층 현미경

황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.

결합<em&gt; 생체</em&gt; 광학 및 μCT 이미징 마우스의 정형 외과 임플란트 감염에 감염, 염증 및 뼈 해부학을 모니터링

우리는 프로토콜을 개발 하 고 밀리미터 규모 표본의 포함 수 있도록 사용자 지정 장치를 설계. 우리는 아크릴 수 지와 폴 마이크로-코네티컷에 의해 경직 된 동원 정지 및 조직 구조와 세포 형태학의 심문에 대 한 표본의 장기 저장을 달성 하기 위해 튜브에 포함에 중점을 두고 샘플 준비 절차를...

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

배우세요 연속 이광자 단층촬영을 이용한 살모넬라 감염 마우스 비장의 고분해능 3차원 전장기 영상화 방법입니다. 이 기술은 항생제 내성 감염 치료 전략 개발에 중요한 숙주-병원체 상호작용을 정밀 분석합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

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