Name: 체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 학습하세요 첸들러 루프와 RT-FluFF를 결합한 전단 흐름 조건에서의 체외 혈전용해 모니터링 방법을. 이 기술은 생리학적 관련성을 높여 새로운 혈전용해제 후보 물질을 선별하는 데 도움을 줍니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 지원을 받아 수상 번호 R01HL167877에 따라 수행되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 National Institutes of Health의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

아래에 언급된 모든 방법은 IRB(Institutional Review Board) 프로토콜 및 기관 인간 연구 윤리 위원회(Institutional Human Research Ethics Committee)를 따릅니다. 모든 건강한 자원봉사자는 헌혈 전에 서면 동의서를 제출했습니다. 참고로, 프로토콜 내에서 참조되는 모든 자료는 재료 목차에서 찾을 수 있습니다. 인간 WB 및 혈장이 이 프로토콜 전반에 걸쳐 논의되는 동안, 연구 동물 혈액 및 인자 고갈 혈액 제제의 사용을 구매하고 대체할 수 있습니다.
1. 전혈 채취
<ol><li>표준 정맥 절개술 기술을 사용하여 동의한 건강한 지원자로부터 정맥 전혈(WB)을 수집합니다. 주의: 이 프로토콜 전체에서 혈액 또는 기타 잠재적으로 감염될 수 있는 물질과의 접촉 위험을 줄이기 위해 보편적인 예방 조치를 따라야 합니다. 장갑, 실험실 가운 및 안면 보호대를 사용해야 합니다.</li>
	<li>~50mL의 WB를 3.2% 구연산나트륨 튜브에 직접 모으고 후속 사용을 위해 즉시 50mL 튜브에 고입니다. 알림: 구연산염 튜브에 혈액을 수집하기 전에 튜브를 버리는 것은 튜브가 제조업체에서 권장하는 양만큼 채워지도록 하는 것 외에도 필요합니다. 갓 수집된 WB는 숙주의 응고 역학을 가장 잘 요약합니다. WB는 실온(사용 전 ≤4시간 전)에서 단기간 보관할 수 있습니다. WB는 혈전탄성조영술(thromboelastography15)을 통해 검사할 때 응고 역학에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로 하룻밤 동안 보관되지 않는다.</li>
</ol>2. 응고 형성
<ol><li>구연산 전혈 3mL에 형광(플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC]) 표지 피브리노겐(FITC-Fg)을 최종 농도 60μg/mL(내인성 혈장 피브리노겐 농도가 3mg/mL라고 가정할 때 1:50 형광 표지 피브리노겐과 비변형 피브리노겐의 비율)로 첨가합니다. 참고: 이 비율은 응고 형태에 미치는 영향을 최소화하면서 1:10까지 높일 수 있습니다. 13,14 형광 태그가 지정된 피브리노겐은 피브리노겐을 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 반응시켜 구매하거나 생성할 수 있습니다. 피브리노겐 혼합은 실행이 시작되기 ≤5분 전에 수행해야 합니다.<ol><li>피브리노겐이 이전에 분주되어 동결된 경우 해동된 FITC-Fg를 검사하여 중합이 조기에 시작되어 사용할 수 없게 되지 않았는지 확인합니다(용액에 미립자 또는 섬유가 없는지 확인).</li>
	</ol></li>
	<li>37°C 수조에서 120mm 직경의 드럼으로 Chandler 루프 설정을 준비합니다(그림 1). 챈들러 루프 장치가 전체 응고 형성 과정에서 0-90rpm의 고정된 회전 속도로 회전할 수 있는지 확인하십시오. 참고 : 추가 챈들러 루프 설정 및 수정 사항은 Zeng et al.에서 찾을 수 있습니다.16.</li>
	<li>튜브(내경 5/32", 외경 7/32")를 자르고 드럼 주위에 단단히 맞지만 단단히 맞지 않는 루프를 형성합니다. 여기에 설명된 권장 튜빙 크기의 경우 튜빙 끝을 연결하여 폐쇄 루프를 형성하는 피팅으로 사용하기 위해 표준 200μL PCR 튜브를 절단합니다. 참고: 다양한 크기의 응고를 생성하기 위해 다양한 크기의 튜브 크기를 사용할 수 있습니다16.</li>
	<li>전혈에 1:17 칼슘 용액 200mM 염화칼슘 용액을 첨가하여 혈액 응고를 시작합니다. 3mL 주사기를 사용하여 혈액을 튜브에 넣고(튜브 부피의 ~50% 채우기). 즉시 루프를 끝을 연결하는 Chandler 루프 드럼에 놓고 회전을 시작합니다.<ol><li>WB 구성 요소의 침전으로 인한 문제를 방지하기 위해 적재하기 전에 부드러운 반전으로 적절한 혼합을 확인하십시오.</li>
		<li>일정하게 유지되지 않으면 혈전 크기에 영향을 줄 수 있으므로 매 실행마다 각 튜브에 동일한 양의 혈액을 추가해야 합니다.</li>
		<li>혈액 기둥 내의 기포도 혈액 응고에 영향을 줄 수 있으므로 드럼에 적재하기 전에 기포가 쉽게 빠져나갈 수 있도록 튜브를 "시소"와 같은 방식으로 부드럽게 움직여 기포를 제거하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수조에 부분적으로 잠긴 드럼을 40RPM의 회전 속도로 회전시켜 ~450s-1의 계산된 전단 속도를 얻습니다. 참고: 튜빙 크기 및 회전 속도(20 - 60 RPM)16를 기준으로 계산된 전단기에 대한 정보는 Zeng et al.을 참조하십시오. 일반적인 정맥 및 동맥 전단 속도는 각각 20-200 s-1 및 300-1,000 s-1이며, ~ 400-500 s-1 은 폐 동맥을 대표합니다.</li>
	<li>형광 태그가 부착된 피브리노겐의 광표백을 최소화하기 위해 저조도 조건에서 40-60분 동안 혈전이 형성되도록 합니다.</li>
	<li>원하는 응고 시간에 도달한 후에는 튜브에서 응고를 제거하고 즉시 사용하십시오. 구조를 손상시키지 않고 혈전을 부드럽게 제거하려면 튜브를 부드럽게 뒤집어 혈전이 튜브에서 작은 용기로 천천히 미끄러져 나올 수 있도록 합니다. 참고: 형성된 응고를 4°C에서 밤새 구연산 혈장 또는 PBS에 보관하면 흐름 루프에서 혈전 분해의 후속 분석에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
</ol>3. RT-FluFF 기기 설정
<ol><li>그림 2와 같이 흐름 루프 장치가 연결되어 있고 모든 연결이 안전한지 확인하십시오. 요컨대, 흐름 루프 장치에는 펌프 > 댐퍼 > 입구 압력 센서 > 응고 > 출구 압력 센서 > 형광 측정기 > 가열 저장소 > 펌프가 포함됩니다. 펌프 용량, 실험 유속, 튜빙 직경 및 길이, 온도, 저장소 부피 및 응고 크기/형상의 선택을 각 연구에 고유한 실험 요구 사항에 맞게 조정합니다. 참고: 이 예에서는 챈들러 루프에 사용된 것과 동일한 직경의 튜브가 RT-FluFF에 사용되었습니다. 튜브는 같은 날에 여러 번 실행할 수 있지만 성능 저하 또는 누출 여부를 모니터링하고 필요에 따라 교체/헹굼해야 합니다. 실행 사이에 따뜻한 증류수로 헹구는 것이 좋습니다. 실험 설계에 따라 모든 실행 후에 튜브를 교체해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>모든 튜브가 고정되면 압력 모니터를 켭니다. 압력 모니터가 입구 및 출구 센서 모두에 대해 0mmHg를 읽는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 밸브를 열어 압력 센서가 대기압에 대해 열려 있는지 확인하고 센서를 영점으로 만듭니다.</li>
	<li>사용 중인 가열 블록 또는 수조를 켜고 실험이 진행되는 동안 온도를 모니터링합니다. 생리적 인체 온도를 모방하기 위해 온도를 37°C에 가깝게 유지하십시오.</li>
	<li>원하는 유량으로 펌프를 켜서 누출을 확인하고 압력 센서가 작동하는지 확인하십시오. 참고: 이 튜빙 크기에서 ~160mL/min의 유속은 ~500s-1의 전단 속도를 나타냅니다.</li>
	<li>응고 로딩을 용이하게 하기 위해 펌프를 끄십시오.</li>
</ol>4. 플로우 루프에 응고 로딩
<ol><li>이전에 만들어진 응고를 사용하는 경우 혈전을 플로우 루프 시스템에 로드하기 전에 응고를 실온으로 가져와야 합니다.</li>
	<li>혈전 질량 손실은 혈전용해 분석을 위한 중요한 종말점 측정입니다. 사전 측정에 의존하는 대신 응고 질량을 흐름 루프에 로드하기 직전에 측정하는 것이 가장 좋습니다.<ol><li>응고 질량 측정은 혈전 내부 및 응고 위의 액체 함량이 혈전의 질량에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 샘플 전체와 분석 일 전반에 걸쳐 일관성을 보장하기 위해 항상 동일한 방식으로 수행해야 합니다. 가장 좋은 방법은 측정 과정 전반에 걸쳐 혈전이 압박되지 않도록 주의하면서 더 이상 물티슈에 상당한 양의 액체를 방출하지 않을 때까지 실험실 물티슈의 응고를 부드럽게 닦아내는 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈장(자가 또는 유형 일치) 또는 유동 루프에 사용되는 기타 이동상 용액(예: PBS 또는 정의된 매체)에 응고를 칭량 접시와 같은 얕은 용기에 담그십시오. 이동상 용액은 전체 시스템 부피를 제어하기 위해 50mL 시스템 저장소에서 직접 가져와야 합니다. 혈전 로딩 단계에서는 혈전 용해제 또는 약물 검사제가 없어야 합니다. flow loop를 실행하기 위한 이동상의 총 부피는 ≥50mL로 권장되며 모든 샘플에서 일관되어야 합니다.</li>
	<li>플로우 루프 튜빙의 중앙 부분(입구와 출구 센서 사이)을 제거하고 튜브의 한쪽 끝에 10mL 주사기를 부착합니다.</li>
	<li>튜빙의 다른 쪽 끝을 사용하여 플라즈마(또는 이동상)에 놓고 소량의 용액을 취하여 튜빙을 프라이밍합니다. 그런 다음 튜브 입구를 혈전 근처에 놓고 혈전을 주의 깊게 검사하여 머리(일반적으로 혈전의 약간 두꺼운 끝)와 꼬리(머리 반대쪽 끝)를 식별합니다. 응고의 머리는 입구 압력 센서 쪽으로 위치해야 하며 출구에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. 튜브를 응고의 "꼬리" 끝에 놓고 주사기로 튜브에 흡입합니다. 알림: 응고 머리/꼬리 방향성을 시각적으로 결정할 수 없는 경우, 챈들러 루프의 회전 방향(응고 머리가 드럼 회전 반대 방향을 향함)을 아는 것을 기반으로 방향성을 가장 잘 할당할 수 있습니다.</li>
	<li>응고가 출구 압력 센서에 가장 가깝도록 튜브를 주 장치에 다시 부착합니다(혈전의 머리는 출구 센서에서 반대쪽을 향해야 함). 튜브와 응고 머리를 두 개의 30G 바늘로 "X"자 모양으로 구멍을 뚫어 혈전을 제자리에 고정합니다. 달리는 동안 이 바늘을 그대로 두십시오. 알림: d에 따라ampener 및 펌프 설정, 혈전이 조기에 파편화되지 않도록 하기 위해 추가 바늘이 필요할 수 있습니다. 필요한 경우, 혈전 조각이 시스템에서 순환하는 것을 방지하기 위해 혈전의 하류에 있는 튜브에 스크린을 추가할 수 있습니다. 혈전을 유지하기 위해 정해진 수의 바늘이 설정되면 조건에 따라 일관되게 유지하십시오.</li>
	<li>나머지 이동상 용액을 50mL 튜브에 저장소로 넣습니다.</li>
	<li>저장소를 수조에 넣고 입구와 출구 튜브를 넣습니다(출구는 형광계에서 나오고 입구는 펌프 헤드로 들어갑니다).</li>
	<li>사용 중인 형광측정기가 연결되어 있고 모니터링되고 있는지 확인하십시오. 실험 시작 시 초기 값이 이동상 전용 시스템 기준선과 비교하여 적절한지 확인합니다. 참고: 인라인 형광측정기를 사용할 수 없는 경우, 유량 루프 분석 기간 동안 정의된 간격으로 저장소의 연속 주기적 샘플링을 수행할 수 있습니다. 수집된 분획은 시중에서 판매되는 분광 광도계에서 실험 완료 직후 96웰 플레이트를 사용하여 판독할 수 있습니다.</li>
	<li>500μL의 100,000ng/mL tPA를 저장소 부피에 직접 추가하여 50mL에서 최종 1,000ng/mL tPA 농도를 달성합니다. 첨가되는 부피, 농도 및 특정 약물은 원하는 목표 순환 농도 및 시스템 저장소 부피에 따라 달라집니다.</li>
	<li>펌프를 시작하기 전에 다음 사항을 확인하십시오.<ol><li>모든 교차로는 안전합니다.</li>
		<li>압력 센서 위에 있는 두 개의 밸브는 적절한 닫힌 위치에 있습니다.</li>
		<li>저장소에 남아 있는 모든 플라즈마(또는 유체)가 교체되었습니다.</li>
		<li>혈전용해제를 저장소에 첨가하고 적절하게 혼합했습니다.</li>
		<li>입구 튜브는 저장소 바닥 근처에 있습니다(이렇게 하면 기포가 최소화됨).</li>
		<li>출구 튜브는 고정되어 있고 원하는 압력에 적합한 높이에 있습니다(모델링되는 용기 위치에 따라 다름).</li>
		<li>펌프 회전 방향이 정확합니다(흐름 순서: 펌프 > Dampener > 응고 > 형광측정기 > 저장소 > 펌프).</li>
		<li>펌프 RPM이 매우 높게 설정된 경우(>150rpm) 더 느린 속도로 시작하여 급격한 압력 변화로 인해 응고가 파편화되거나 튜브 누출이 발생하지 않도록 합니다.</li>
		<li>시스템이 형광측정기의 데이터를 적절하게 기록하고 있는지 및/또는 실험 후 시점 판독을 위해 이동상의 주기적인 샘플링을 위한 공급품이 준비되어 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>펌프를 켜고 원하는 체적 유량인 160mL/분에 도달하도록 설정하거나 원하는 압력에 도달할 때까지 유량을 높입니다. 시스템은 유체와 기포로 채워집니다. 기포는 인위적으로 형광 측정 수치를 높이므로 기포가 제거될 때까지 주의하십시오. 그런 다음 조명을 끄고 데이터 수집을 시작하십시오.</li>
	<li>응고가 현저히 저하되거나 원하는 실험 시간(≥60분)이 경과할 때까지 펌프를 계속 작동시킵니다. 필요에 따라 저장소를 통해 실험 전반에 걸쳐 시스템에 시약을 추가하여 다양한 혈전 용해 변형을 테스트하는 고유한 실험 조건을 생성합니다. 알림: 실험 시간은 펌프 유량(전단 수준)과 혈전용해제의 농도에 따라 다릅니다.</li>
	<li>분석이 완료되면 체적 유량을 줄이고 펌프가 작동하는 동안 입구 튜브를 제거하여 시스템의 대부분의 유체를 저장소로 밀어 넣습니다(일부 이동상은 튜브에 남아 있음). 튜브의 출구 압력 센서 쪽에서 응고가 포함된 튜브 섹션을 분리하고 계량 보트로 내립니다.</li>
	<li>혈전을 제자리에 고정하고 있는 바늘을 제거하여 시스템 내부에 남아 있는 액체와 응고/응고 조각을 수집합니다. 필요에 따라 주사기를 사용하여 시스템을 청소합니다.</li>
	<li>손실된 질량 퍼센트 계산 또는 조직학과 같은 추가 분석을 위해 남아 있는 응고를 계량하고 처리합니다.</li>
</ol>5. 시스템 청소
<ol><li>샘플 사이에 높은 rpm(>150rpm)의 따뜻한 물로 전체 시스템을 헹굽니다. 물통에 물을 넣고 최소 2분 동안 시스템을 통과시키고 비우고 다시 실행하여 두 번의 완전한 시스템 헹굼을 수행합니다. 이러한 헹굼 후에도 형광측정기 판독값이 기준선으로 돌아오지 않으면 추가 주기 동안 헹굼 과정을 반복합니다. 여전히 기준선으로 돌아가지 않으면 다음 샘플을 분석하기 전에 튜브를 완전히 교체하십시오. 참고: 실험 중에는 샘플 간에 튜브를 재사용할 수 있습니다. 그러나 혈전을 제자리에 고정하는 데 사용되는 바늘로 구멍을 뚫기 때문에 입구와 출구 압력 센서 사이의 튜브 부분은 각 실행 후에 교체해야 합니다. 일부 실험 조건에서는 시료 교차 오염을 제거하기 위해 각 실행 또는 클러스터링 분석 후 전체 튜브 세트를 교체해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>그날의 실험을 위해 모든 샘플을 실행한 후 모든 튜브를 제거하고 폐기합니다. T-접합부를 뜨거운 물과 강모 브러시로 깨끗해질 때까지 문지른 다음 주사기 댐퍼를 건조시키고 뜨거운 물로 헹굽니다. 멸균에 도움이 되는 70% EtOH를 사용하십시오.</li>
</ol>

Chandler Loop와 RT-FluFF를 결합하여 Ex vivo 응고 용해 모니터링

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

응고 형성 및 라벨링 챈들러 루프(Chandler loop)는 생체 내 혈전16을 모방한 혈전을 재현성 있게 생성하는 쉽고 효과적인 수단을 제공하는 것으로 입증되었습니다. 튜빙 크기, 회전 속도, 드럼 직경 및 응고 시간과 같은 매개변수를 미세 조정하면 다양한 전단 조건에서 혈전을 빠르게 생성할 수 있으며, 동맥 및 정맥 소스를 모두 모방하는 다양한 혈전에서 높이 평가되는 구조적 특징을 포착할 수 있습니다. FITC-Fg와 같은 마커를 도입할 수 있는 추가적인 유연성은 RT-FluFF 시스템에서 입증된 바와 같이 이러한 혈전의 잠재적 사용을 확장합니다. 챈들러 루프(Chandler loop)의 기본 원리는 초보적이지만, 응고 형성 과정 전반에 걸쳐 혈액 및 혈액 제제를 동시에 처리하면서 일관된 응고 형성과 관련된 가파른 초기 학습 곡선이 남아 있습니다. 이는 WB의 응고가 응고 시작 전후의 순간에 처리에 매우 민감하다는 사실에서 비롯됩니다. 특히 중요한 것은 혈액 표면 상호 작용이 혈전 형성 진행에 영향을 미칠 수 있으므로 챈들러 루프의 혈전 형성 단계에서 사용되는 튜브를 선택하는 것입니다. 튜브는 생체 반응성이 낮은 의료 또는 외과 등급(비발열성 및 비용혈성)이어야 합니다. 우리의 결과에서 논의된 바와 같이, 형성된 응고의 변화는 실험 규모와 고유한 분석 수정을 기반으로 최적의 워크플로우를 개발하는 동시에 기법의 초기 학습 단계에서 예상됩니다. 재현성의 궁극적인 달성은 섬유소 용해를 겪을 때 혈전 구조가 혈전의 거동에 미치는 영향을 고려할 때 매우 중요합니다. 마지막으로, 건강한 지원자들 사이에서도 응고의 변동이 예상되며 실험 설계 중에 고려되어야 합니다.
RT-FluFF 분석 FITC-Fg를 마커로 사용한 섬유소 용해의 형광 측정/분광 광도계 정량화는 주로 종말점 응고 질량 평가에 의존해 온 기존 기술에 비해 많은 이점을 제공합니다. 생리학적 흐름 매개변수를 근사화하는 환경에서 실시간 또는 거의 실시간으로 섬유소 용해 역학을 모니터링할 수 있는 능력은 기존의 섬유소 용해 약물 스크리닝 분석에서 상당한 개선을 나타냅니다. 이 분석은 완전히 소형화된 미세유체 접근 방식을 취하기보다는 임상적으로 관련된 응고 크기, 유동장, 체적 유량 및 응고 질량 부담과 더 유사하도록 제시된 규모로 의도적으로 설계되었습니다. RT-FluFF 장치를 축소한다는 것은 더 작은 직경의 튜빙 및/또는 더 짧은 거리의 튜빙을 사용해야 함을 의미합니다. 결과적으로 시스템은 원하는 흐름 패턴과 생리학적 관련성에서 벗어나기 시작합니다. 챈들러 루프와 유사하게, RT-FluFF 시스템은 일정한 흐름에서 흐름 압력을 조절하고 어떤 흐름 매체가 사용되는지를 제어하여 전단 속도와 같은 매개 변수를 제어 할 수 있습니다. 또한 RT-Fluff 시스템은 박동 흐름과 고유한 혈전 분해 형상을 수용할 수 있으며, 회전식 폐쇄 분해 설정으로 인해 Chandler 루프에서는 불가능한 분해 공정 전반에 걸쳐 이동상의 주기적인 샘플링을 허용할 수 있습니다. 이러한 파라미터가 응고 용해에 미치는 영향은 Zeng et al.14의 일부로 심층적으로 조사되었습니다.
종합하면, 챈들러 루프 형성 응고와 RT-FluFF 분석 튜브는 혈전 형성 및 응고 소화 단계 모두에서 직경이 같거나 다양하여 서로 다른 수준의 폐색을 달성할 수 있으며, 혈전 색전증을 모방하기 위해 거의 완전한 혈관 폐색을 모델링합니다. 본 명세서에 기술된 모든 분석법은 챈들러 루프와 RT-FluFF 시스템 모두에서 동일한 튜브 직경을 사용했습니다. RT-FluFF 시스템에서 튜빙 직경이 증가함에 따라 시스템을 채우는 데 필요한 추가 부피를 수용하기 위해 이동상 저장소 부피를 늘려야 할 수 있습니다. 저장소 부피를 늘리면 시스템에 추가해야 하는 혈전용해제/약물의 양도 증가할 수 있으며 혈장 또는 이동상 요구 사항도 증가할 수 있습니다. 자가 혈장을 사용하는 것이 이상적이지만, 전체 실험을 완료하는 데 필요한 모든 분석 및 복제에서 챈들러 루프 응고 형성 및 RT-FluFF 이동상 부피를 수용하기 위해 개별 기증자로부터 매우 많은 양의 혈액을 채취해야 합니다. 이러한 이유로, 헌혈 센터에서 획득하거나 상업 공급업체에서 구매한 유형 일치 풀 혈장이 일반적으로 사용되었습니다. 전체 RT-FluFF assay 튜빙은 어느 정도 단축될 수 있지만, 모든 구성 요소가 분해 실험을 실행하기 위해 루프에 남아 있을 수 있는 충분한 공간을 확보하는 데 한계가 있습니다. 특히 중요한 것은 응고 자체의 상류에서 사용되는 튜빙의 긴 부분이 튜빙 직경과 유속을 기준으로 계산된 최소 길이를 초과해야 하는 경우로, 유동이 부유 응고에 도달하는 시간까지 층류가 달성됩니다. 튜빙 크기 선택에 관계없이 챈들러 루프 응고 형성 단계에 자세히 설명된 동일한 튜빙 고려 사항을 RT-FluFF 시스템 튜빙에도 적용해야 합니다. 챈들러 루프 형성 응고가 "X" 패턴으로 삽입된 두 개의 바늘을 통해 제자리에 고정되는 압력 센서 사이의 튜브는 바늘 천자 부위에서 누출이 발생하는 것을 방지하기 위해 모든 분석 후에 교체해야 한다는 점을 반복하는 것이 중요합니다. 유동 하에서 분해하는 동안 혈전을 제자리에 고정하기 위해 바늘을 사용하면 혈전 뭉침을 제한하고 흐름 방향에 대한 응고 방향 기능을 제공하여 분석 간 일관성을 개선합니다. tPA를 사용한 단일 대표적인 응고 분해 시험이 본 문서에 설명되어 있지만, Chandler loop 및 RT-FluFF 분석은 새로운 섬유소 용해제를 테스트하기 위해 다양한 응고 구조, 리포터 분자, 전단 속도 및 분해 조건을 수용할 수 있는 높은 수준의 사용자 정의 기능을 제공합니다.
제한 섬유소 용해제를 스크리닝하는 데 사용되는 현재 플랫폼 또는 방법과 마찬가지로 RT-FluFF 분석에도 인정해야 하는 특정 약점이 있습니다. 첫째, 챈들러 루프에서 형성된 혈전은 체내 혈전에서 일반적으로 존재하는 모티프를 나타내지만, 박동 흐름 및 내피와의 상호 작용이 존재하는 생체 내 응고와는 다른 환경에서 여전히 형성됩니다17 또한 혈전 구조에 미치는 영향을 최소화하기 위해 FITC-Fg 농도가 최적화되었음에도 불구하고 변형된 피브리노겐의 첨가는 여전히 생리학적 조건에서 벗어난 것을 나타냅니다. 플라즈마의 이동상 매체 선택은 혈장의 단백질 및 지질 함량과 관련된 소량의 배경 신호가 존재하기 때문에 형광측정기 사용에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 공여체마다 다를 수 있습니다. RT-FluFF 설정의 잠재적으로 중요한 제한 사항은 형광 판독에 대한 RBC의 부정적인 영향으로, FITC를 형광 혈전 소화 마커로 사용할 때 WB를 이동상으로 사용하는 것을 제한합니다. 이를 완화하기 위한 실현 가능한 방법은 분광광도계에서 이산 시점을 판독하기 전에 적혈구를 펠릿화하기 위해 원심분리 단계를 도입하거나 적혈구18의 존재에 의해 영향을 덜 받는 다른 응고 분해 리포터 태그를 활용하는 것입니다. 중요한 변수가 제어되도록 하기 위해 분석 설계를 기반으로 신중한 고려를 수행해야 합니다. 예를 들어, 혈장이 이동상으로 선택되는 경우, 공여체 간 응고 및 섬유소 용해 변동성을 최소화하기 위해 혈장을 여러 공여체에 걸쳐 풀링하는 것이 가장 좋습니다. 마지막으로, 임의의 형광 표지 단백질과 마찬가지로, 소멸 문제는 FITC 태그가 피브리노겐19의 표면에서 서로 상대적으로 근접하여 존재하기 때문에 자연적으로 발생합니다.
결론 및 향후 방향 혈전용해술과 같은 역동적인 과정을 연구하려면 생리적 조건을 복제할 수 있고 여러 파라미터를 동시에 제어할 수 있는 동등하게 역동적인 환경이 필요합니다. 고충실도 RT-FluFF 시스템은 이러한 간극을 메우고 향후 새로운 혈전용해제를 동물 모델로 변환하기 전에 개발하고 스크리닝하는 데 중요한 도구 역할을 할 것입니다. RT-FluFF는 매우 다재다능한 플랫폼으로, 여기에서 논의되지 않았지만 제약 약물 설계, 작용 모드 또는 다양한 응고 질환 상태의 복제의 고유한 요구 사항에 따라 프로토콜에 확실히 통합될 수 있는 여러 기능을 갖추고 있습니다. RT-FluFF 시스템 내에서 우리가 이해할 수 있었던 이점은 다음과 같습니다: (a) 다양한 튜빙 형상 및 구성, (b) 루멘 폐색 정도에 따른 실시간 압력 모니터링, (c) 사용자 개입이 필요 없는 실시간 형광 측정, (d) 분석 기간 및 시료 빈도 유연성, (e) 생체 내 조건을 모방하기 위한 저장소 사용, (f) 생체 내 유사 전단 흐름 패턴, (g) 박동 흐름을 포함하는 옵션, (h) 뚜렷한 질병 대표 혈전 유사체의 챈들러 루프 형성에서 상당한 유연성, (i) 혈전 형성 또는 혈전 소화에 대한 약물 영향을 테스트할 수 있는 능력, (j) 투명 튜브를 통해 벌크 응고 소화를 추적하기 위한 직접 혈전 기질 이미징은 추가로 분해 후 소화를 허용합니다. 종단 비디오 분석.

근본적으로 혈전색전증 병인에서 비롯된 질병은 현대 사회에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 혈전색전증의 발병기전으로는 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증 등이 있으나 이에 국한되지 않는다1. 병원성 혈전증을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법의 개발을 중심으로 여러 분야에 걸쳐 엄청난 양의 지속적인 연구가 진행되고 있습니다. 혈전증의 동맥 및 정맥 증상의 변화와 다양한 해부학적 위치로 인해 다양한 치료 접근법이 개발되었습니다. 그러나 급성 치료는 일반적으로 플라스미노겐 활성제를 통한 약물적 혈전용해술에 의존하며, 특정 임상 상황에서 기계적 혈전절제술을 시행할 수 있다2.
새로운 약리학적 치료 전략의 개발은 근본적으로 전임상 시험을 위한 체내 동물 모델과 체외 소화 모델 모두에 의존합니다 3,4. 생체 내 모델은 의약품의 제거뿐만 아니라 약물과의 세포 상호 작용을 포함하여 치료 효능에 대한 다양한 생리학적 매개변수의 복잡한 상호 작용을 포착할 수 있는 능력의 이점을 자연스럽게 누릴 수 있습니다. 그러나 이와 동일한 복잡성으로 인해 이러한 모델은 종종 상당한 비용이 들고 인간의 생리학과 크게 다른 동물에서 근본적인 약력역학/동역학을 분리하려고 할 때 추가적인 문제가 발생합니다. 체외 모델의 개발은 약물 개발 및 스크리닝을 수행할 수 있는 증류 테스트 환경을 촉진하는 데 도움이 되었지만 연구 중인 질병 상태를 재현하는 데 필요한 충실도가 부족한 경우가 많습니다.
새로운 혈전용해제를 테스트하기 위해 일반적으로 발견되는 시험관 내 프로토콜은 잔류 혈전 질량이 1차 종점 역할을 하는 정적 조건에서 형성되고 용해된 혈전의 활용에 의존합니다 5,6. 불행히도, 이러한 기술은 시험 약물의 약력학을 크게 변화시킬 수 있는 난류 및 트랜스 혈전 압력 강하와 같은 혈전 용해의 기계적 측면을 설명하지 못합니다. 또한, 정적 조건에서 형성된 혈전은 생리적 혈전과 다른 미세구조를 포함하고 있습니다. 혈전 형성 중 전단의 존재는 혈소판 활성화 및 피브린 교차결합과 같은 결과적인 응고 특성에 영향을 미치는 것으로 재현 가능한 것으로 나타났습니다. 전단 흐름 하에서 생성되는 응고는 정적으로 형성된 응고 7,8에는 없는 팁에서 꼬리까지 복잡한 이질성을 나타냅니다. 이러한 생리적 응고 구조로부터의 이탈은 혈전 내 약물 침투 및 후속 용해 효율을 포함하는 중요한 약물 개발 특성 분석에 영향을 미칠 수 있다9.
정적 응고/응고-용해 모델의 사용과 관련된 이러한 제한 사항 중 일부를 해결하기 위해, 전단이 있는 상태에서 응고 형성 및 응고 용해 모두에 대해 챈들러 루프(Chandler loop)를 채택하면서10이 부활했다. 이러한 시스템은 유동 역학을 더 잘 표현하고 상대적으로 정적인 분석에 비해 생리학적으로 더 관련성이 높은 구조를 가진 응고를 생성할 수 있지만, 단순화된 유동 조건은 여전히 생리학적 조건과의 편차를 나타냅니다. 마지막으로, microfluidic 접근은 또한 화상 진찰의 그들의 용이함 및 획일한 교류 본 때문에 착수되었습니다; 그러나, 이는 임상적으로 가장 관련성이 높은 혈전색전증 질환에서 주로 영향을 받는 더 큰 혈관 내에서 예상되는 생리적 조건으로부터 상당한 제거로 남아 있다11,12.
위의 논의를 염두에 두고 우리는 전임상 혈전용해제 약물 스크리닝을 위한 충실도가 높은 체외 혈전용해 모델을 개발했습니다. 이 모델은 새로운 혈전용해 요법 스크리닝 영역에서 위에서 자세히 설명한 현재의 일부 위험을 해결하는 것을 목표로 하며 다양한 농도의 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)에서 재현성 및 민감도에 대해 검증되었습니다. 본 명세서에 기술된 시스템은 연동 펌프, 압력 댐퍼, 가열 저장소, 2개의 압력 센서, 인라인 형광측정기, 및 형광 표지된 챈들러 루프 전단 성형 응고 아날로그를 활용하여 생리학적 전단 흐름을 제공하여 섬유소 용해증의 실시간 추적을 용이하게 한다13. 종합하면, 전체 시스템을 RT-FluFF Assay(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)14 라고 하며, 이 원고에서는 이 고충실도 체 외 혈전용해 모델에서 어세이를 성공적으로 설정하고 실행하는 복잡성에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>30 그램&nbsp; 일회용 피하 주사 바늘</td><td>Exel International&nbsp;</td><td>26439</td><td>기타 소모품</td></tr><tr><td>6 mm HSS 선반 바 스톡 도구 150 mm Long</td><td>uxcell</td><td>B07SXGSQ82</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>96-Well Clear Flat Bottom UV-투명 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3635</td><td>기타 소모품, 비처리 아크릴 공중합체, 비멸균</td></tr><tr><td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60mL 주사기</td><td>Air-Tite</td><td>MLB3</td><td>RT-FluFF 장치, 댐너</td></tr><tr><td>Arium Mini Plus 초순수 시스템</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>DI 수원</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5670</td><td>다른 소모품</td></tr><tr><td>일회용 BP 트랜스 듀서</td><td>AD 기기</td><td>MLT0670</td><td>RT-FluFF 장치</td></tr><tr><td>Dräger Siemans, HemoMed Pod</td><td>Dräger</td><td>5588822</td><td>RT-FluFF 장치</td></tr><tr><td>Dräger Siemans, 환자 모니터</td><td>Dräger</td><td>SC 7000</td><td>RT-FluFF 장치</td></tr><tr><td>드럼 (실린더, 직경 120mm, 너비 85mm)</td><td></td><td></td><td>챈들러 루프,</td></tr> <tr><td>페이스 쉴드</td><td>뜸</td><td>SHIELDS10</td><td>챈들러 루프,&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 플라즈마에서 추출한 피브리노겐, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>F13191</td><td>기타 소모품,</td></tr><tr><td>피팅, 폴리카보네이트, 4방향 스톱콕, 수컷 루어 록, 비멸균</td><td>Masterflex</td><td>30600-04</td><td>RT-FluFF 기구</td></tr><tr><td>플루오레세인(FITC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>119245000</td><td>기타 소모품</td></tr><tr><td>범용 수조</td><td>Thermo Scientific</td><td>2839</td><td>챈들러 루프,&nbsp;</td></tr><tr><td>핫플레이트 4 &times; 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>1152016H</td><td>RT-FluFF 장치</td></tr><tr><td>인간 소스 플라즈마 신선-냉동</td><td>Zen-Bio</td><td>SER-SPL</td><td>기타 소모품, CPDA-1 항응고제</td></tr><tr><td>인간 전혈&nbsp;</td><td>젠바이오</td><td>SER-WB-SDS&nbsp;</td><td>기타 소모품, CPDA-1 항응고제</td></tr><tr><td>고성능 정밀 튜빙용 L/S Easy-Load II 펌프 헤드, PPS 하우징, SS Rotor</td><td>Masterflex</td><td>77200-62</td><td>RT-FluFF 장치, 펌프 헤드</td></tr><tr><td>L/S 가변 속도 디지털 드라이브 펌프, 원격 I/O, 6 to 600 rpm; 90에서 260 VAC</td><td>Masterflex</td><td>7528-10</td><td>RT-FluFF 장치, 펌프</td></tr><tr><td>모터 속도 컨트롤러</td><td>CoCocina</td><td>ZK-MG</td><td>Chandler 루프 등;</td></tr><tr><td>Nalgene 튜빙 T-타입 커넥터</td><td>Thermo Scientific</td><td>6151-0312</td><td>RT-FluFF 장치</td></tr><tr><td>연동 펌프 튜빙&nbsp;</td><td>마스터플렉스</td><td>06424-15&nbsp;</td><td>다른 소모품</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>Millipore Sigma</td><td>P3813</td><td>기타 소모품, 분말, pH 7.4, 1 L 용액 준비용</td></tr><tr><td>스위칭 전원 공급 장치</td><td>SoulBay</td><td>UC03U</td><td>Chandler loop,&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific National Target All-Plastic 일회용 주사기 10mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>S751010</td><td>기타 소모품</td></tr><tr><td>조직 플라스미노겐 활성제, 인간</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0831</td><td>기타 소모품</td></tr><tr><td>튜빙 ID 1/4", OD 3/8"</td><td>, Fisher Scientific</td><td>AGL00017</td><td>기타 소모품, 1.5cm 섹션으로 절단, 튜빙을 T형 커넥터</td></tr><tr><td>에 연결하는 데 사용튜빙 ID 5/32", OD 7/32"</td><td>타이곤</td><td>ND-100-65, ADF 00009&nbsp;</td><td>다른 소모품</td></tr><tr><td>V3 365 nm 미니 - 블랙 라이트 UV 플래시라이트</td><td>uvBeast</td><td>uvB-V3-365-MINI</td><td>챈들러 루프, 완료된 응고를 확인하는 데 사용</td></tr><tr><td>ZGA37RG ZYTD520 DC 모터, 12 V, 100 rpm</td><td>판</td><td>ZGA37RG</td><td>챈들러 루프,&nbsp;</td></tr></tbody></table>

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 chandler loop-formed 전혈의 fibrinolysis 추적

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

혈전색전증 및 관련 합병증은 전 세계적으로 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, in vitro 및 in vivo 모두에서 혈전용해제 약물 효과를 테스트하기 위해 다양한 분석법이 개발되었습니다. 인간 생리학으로의 번역성이 부족한 경우가 많을 뿐만 아니라 동물 모델과 관련된 복잡성과 비용으로 인해 약물 개발을 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 체외 혈전 모델에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 유량, 압력 및 전단 속도는 순환계의 중요한 특성이며, 흐름에 따라 형성된 응고는 정적으로 형성된 혈전과 다른 형태 및 소화 특성을 나타냅니다. 이러한 요인은 기존의 체외 혈전 분해 분석에서는 나타나지 않는 경우가 많으며, 이는 약물 번역 성공률에 영향을 미치는 약리학적 영향을 미칠 수 있습니다.
RT-FluFF(Real-T ime Flu Fluorometric Flowing Fibrinolysis) 분석은 전단 흐름 하에서 형성된 형광 태그 응고를 사용하는 고충실도 혈전 용해 검사 플랫폼으로 개발되었으며, 이 혈전은 섬유소 용해제의 유무에 관계없이 순환 플라즈마를 사용하여 분해됩니다. 혈전 형성 및 혈전 소화 단계의 유속을 수정하면 시스템이 매우 다양한 실험 설정에서 동맥, 폐 및 정맥 상태를 모방할 수 있습니다. 측정은 인라인 형광측정기를 사용하거나 이산 시점을 사용하여 연속적으로 수행할 수 있으며, 기존의 종말점 응고 질량 측정도 수행할 수 있습니다. RT-FluFF assay는 체외 검사 시스템의 제어 및 재현성을 유지하면서 생체 내 생리학적 조건을 보다 정확하게 나타내는 유동 조건에서 혈전 분해를 실시간으로 추적할 수 있는 유연한 시스템입니다.

챈들러 루프 응고 형성 혈전을 형성할 때, 우리는 일반적으로 혈전 이상치(총 형태 및 질량 기반)가 존재하는 경우에도 삼중 혈전용해 분석을 실행할 수 있는 능력을 보장하기 위해 4중을 목표로 했습니다. 최적의 로딩 조건을 가정할 때, 혈전은 그림 3과 같이 길이(~3.3cm), 무게(~100mg) 및 외관이 모두 균일해야 합니다. FITC-Fg를 사용할 때, 우리는 또한 응고 내 불규칙한 과형광 표지 영역과 대조적으로 형광의 비교적 균일한 분산을 보장하기 위해 UV 광선 아래에서 응고를 검사하는 것을 목표로 했습니다. 전혈 내 FITC-Fg 농도를 변화시킨다고 해서 우리가 조사한 농도 내에서 응고 중량이나 모양이 변경되어서는 안 됩니다. 그러나 마이크로 응고 구조는 가장 높은 FITC-Fg 농도(1:5 FITC-Fg to unmodified Fg)에서 영향을 받았습니다. Zeng et al.이 수행한 이전 연구는 선택한 전단 수준에 따라 챈들러 루프에서 예상되는 광범위한 응고 표현형을 포착합니다16.
때때로 비정상적인 응고가 발생할 수 있습니다. 가장 흔한 응고 문제는 (i) 조기 응고와 (ii) 응고 장애의 두 가지 범주 중 하나에 속합니다. 조기 응고에서는 전체 혈액 부피가 챈들러 루프 튜브 내에서 응고됩니다. 이것은 드럼 회전이 켜지면 혈액이 "흐르지" 않고 오히려 튜브 벽에 달라붙어 일제히 회전하기 때문에 분명해집니다. 이러한 상황에서는 이러한 혈전을 사용할 수 없으므로 폐기해야 합니다. 이를 방지하려면 염화칼슘을 첨가하여 응고가 활성화되면 루프가 즉시 닫히고 응고가 계속될 수 있도록 회전 드럼에 놓아야 합니다. 두 번째 상황 또는 응고 장애는 샘플이 적절하게 혼합되지 않았거나 회전이 시작되기 전에 혈액이 응고되기 시작했지만 상황 (i)만큼 중요하지 않은 경우에 발생합니다. 위와 같은 문제가 있는 혈전은 취급할 때 끈적거리고 얇아 보이는 경향이 있으며 종종 혈전 질량이 상당히 증가합니다. 표현형적으로, 그들은 매우 낮은 정맥 가위에서 볼 수 있는 혈전을 근사화할 것인데, 이는 본질적으로 정체 상태에서의 응고를 나타내기 때문입니다. 때때로 불규칙한 혈전이 발생하고 이를 극복해야 합니다.
RT-FluFF 형광측정기 교정 RT-FluFF 시스템의 중요한 특징은 경과된 혈전 분해 기간 동안 혈전용해를 추적하는 데 사용되는 형광계 또는 분광 광도계입니다. 실험을 실행하기 전에 형광측정기 또는 분광 광도계의 적절한 기능을 확인하는 것이 중요합니다. 우리의 목적을 위해 RT-FluFF 장치용으로 특별히 형광측정기를 설계했기 때문에 정적 용액에 알려진 양의 FITC-Fg 희석액이 있는 경우 분광광도계와 잘 연관되도록 해야 했습니다(그림 4A). 형광측정기의 선형 범위를 자신 있게 결정할 수 있게 되자, 다음으로 형광측정기가 흐름이 있을 때 어떻게 작동하는지 확인하는 것을 목표로 했습니다. 형광계의 판독 재현성을 더 잘 이해하고 유동 시스템 내에서 형광이 얼마나 빠르게 평형을 이루는지 확인하기 위해 형광의 단계적 증가를 모니터링하기 위해 플루오레세인을 유동 용액에 점진적으로 주입하여 기능을 검증했습니다(그림 4B). 후속 실험은 섬유소 용해 실험에서 예상되는 연속 형광 방출을 더 잘 모방하기 위해 플루오레세인과 FITC-Fg를 연속적인 방식으로 용액에 꾸준히 주입하여 수행했습니다(그림 4C). FITC-Fg와 FITC 사이에 나타난 기울기의 차이는 많은 FITC 분자가 단일 단백질(이 경우 피브리노겐)에 접합될 때와 같이 FITC가 그 자체에 근접하여 접합될 때 발생하는 담금질의 효과에서 발생하는 것으로 생각됩니다. 당연히 단계적 증가와 기울기는 사용된 FITC/FITC-Fg의 농도뿐만 아니라 피브리노겐당 FITC 분자의 수에 따라 달라집니다. 더 나아가 수많은 응고 배치의 데이터를 비교하려는 경우 RT-FluFF를 사용하여 실험을 수행할 때 FITC와 피브리노겐 접합 정도를 제어하는 것이 중요합니다. 광범위한 실험을 통해 피브리노겐당 ~14개의 FITC 접합이 용액에서 안정적으로 유지되고(제한된 조기 응집) 결과 응고 미세 구조에 미치는 영향을 최소화하면서 응고 소화를 추적하는 우수한 형광 신호를 제공한다는 것을 발견했습니다. 순수하고 응고되지 않은 FITC-Fg가 RT-FluFF 장치를 통과할 때마다 FITC-Fg가 고전단에 노출되면 응집이 촉진될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 현상은 튜빙 연결부의 접합부와 펌프 헤드 튜빙 내에서 가장 자주 관찰되며 시간이 지남에 따라 사용 가능한 용액 내 형광에 영향을 미칠 수 있습니다.
분광 광도계에서 형광을 판독하기 위해 이산 시점의 흐름 루프에서 샘플을 수집할 때 형광계 교정과 관련된 이러한 고려 사항 중 많은 부분이 필요하지 않습니다. 그러나 FITC-Fg 라벨링, 챈들러 루프 형성 응고의 FITC-Fg 양 및 응고의 크기가 모두 시스템에서 최적화되었는지 확인하기 위해 사용되는 특정 분광 광도계의 동적 범위를 탐색해야 합니다. 시스템에서 분리한 직후 샘플을 판독하거나 실험 완료 후 다중 판독을 위해 96웰 플레이트에 배치하는 것이 좋습니다. 필요한 경우, 분석 전에 추가적인 효소 활성을 제거하기 위해 채취 직후 샘플을 산성화할 수 있습니다.
RT-FluFF 응고 용해 챈들러 루프(Chandler loop)의 동맥 가위 아래에 형성된 혈전을 이용하는 RT-FluFF 시스템을 검증하기 위해 tPA(Alteplase)를 섬유소 용해제로 사용하여 인간 혈장을 장치의 이동상으로 사용했습니다. 조사된 tPA의 농도는 0에서 1,000ng/mL 사이였습니다. 인간의 폐 흐름 조건을 모방하기 위해 혈장 저장소의 온도를 37°C로 유지하고 물리적으로 응고 수준보다 8cm 높게 올려 혈전이 없을 때 ~500s-1 전단 흐름을 생성하도록 펌프 속도를 조정한 상태에서 12mmHg의 평균 유동 압력을 제공했습니다. 거의 일정한 전단 속도를 달성하기 위해 연동 펌프의 피크 압력과 최저 압력 사이의 변동을 최소화하기 위해 박동 흐름 감쇠기가 시스템에 추가되었습니다(그림 4D). 압력 댐퍼가 없는 경우, 연동 펌프의 출력 압력은 펌프 헤드가 회전할 때 시스템을 통해 작은 액체 패킷을 배출하여 흐름을 생성하는 방식의 특성으로 인해 크게 변동합니다. 혈전 용해는 60분 동안 관찰되었습니다. 예상대로 tPA의 농도가 증가함에 따라 tPA가 적거나 전혀 없는 조건에 비해 응고 용해 속도(RFU/분)가 증가하고 질량 손실이 증가했습니다. 1,000ng/mL의 tPA 농도에서 60분의 분해 기간 동안 ~85% 응고 용해가 이루어졌습니다. 용해가 진행되는 혈전의 전체 이미지를 살펴보면 용해가 주로 혈전의 꼬리 영역에서 발생하여 응고 구조의 더 조밀한 머리에 영향을 미치기 전에 응고 구조의 물리적 저하와 표면 형광의 손실에서 볼 수 있음을 알 수 있습니다. 예상되는 응고 스트레칭은 또한 전단 속도에 의존하는 방식으로 시간이 지남에 따라 기계적 무결성의 손실을 기반으로 발생합니다.
혈전 용해 속도의 상당한 차이를 인식할 수 있지만, 전체적으로 그리고 형광 방출을 기반으로 하지만, 형광 방출과 존재하는 섬유소 용해제의 양 사이에는 완벽하게 선형 상관관계가 없습니다. 이는 그림 5에서 가장 잘 볼 수 있습니다. WB 기반 혈전의 섬유소 용해는 자연적으로 FITC-Fg 단편뿐만 아니라 혈전 형성 중에 피브린 네트워크 내에 갇혀 있는 적혈구(RBC)의 방출로 이어집니다. 이러한 적혈구가 RT-FluFF 장치 내에서 순환으로 방출되면 결과적으로 순환 플라즈마가 눈에 띄게 붉게 물들기 시작합니다. 순환 플라즈마의 이러한 비색 변화는 형광계 센서가 판독하는 순환 FITC-Fg의 형광 방출에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 섬유소 용해 농도가 상한에 도달하면 FITC-Fg가 용액으로 방출되는 정도가 형광 방출에 대한 RBC 효과를 압도합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig01.jpg"> 그림 1: 챈들러 루프 설정의 개략도. 챈들러 루프 드럼에 적재된 혈액이 채워진 튜브는 조명이 어두워진 상태에서 응고 형성 과정 전반에 걸쳐 37°C 수조에 담급니다. 드럼은 DC 모터, 구동축 및 제어 보드를 통해 일정한 회전 속도로 회전합니다. 이 그림은 Zeng et al14에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig02.jpg"> 그림 2: RT-FluFF 시스템의 개략도. 시스템의 중요한 구성 요소는 이미지에서 식별됩니다. 단일 대용량 댐퍼는 연동 펌프 사용과 관련된 흐름의 맥동을 최소화하기 위해 이미지에 그려져 있습니다. 인라인 형광측정기가 없는 경우, 주기적 샘플링을 위한 두 가지 추가 옵션은 다음과 같습니다: 1) 저장소에서 직접 샘플링; 또는 2) 이동상을 추출하기 위해 인라인 샘플링 포트를 통합합니다. 이 그림은 Zeng et al14에서 수정되었습니다. 약어: RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig03.jpg"> 그림 3: Gross Chandler loop FITC-Fg 태그가 지정된 WB 응고 특성(주변광 및 자외선 하에서의 질량 및 물리적 외관 포함). (A) 다양한 응고 조건에서 일관된 응고 형성은 Chandler loop clot formation 프로토콜의 미세 조정을 통해 달성할 수 있습니다. 응고 질량과 모양은 튜브 직경, 회전 속도 및 응고 형성 시간의 길이에 따라 크게 달라진다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그림에 표시된 응고는 37°C에서 1시간 동안 506s-1의 전단 속도로 형성되었습니다. 스케일 바 = 20 mm. (B) FITC-Fg의 각 비율을 사용하여 챈들러 루프에 형성된 응고 질량. 데이터는 세 개의 데이터 점보다 크거나 같은 표준 편차± 평균을 나타냅니다. 이 그림은 Zeng et al14에서 수정되었습니다. 약어: FITC-Fg = 플루오레세인 이소티오시아네이트 태그 피브리노겐; WB = 전혈. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig04.jpg"> 그림 4: 형광측정기 특성화. (A) 알려진 FITC-Fg 희석량의 맥락에서 분광광도계와 RT-FluFF 인라인 형광측정기 비교. (B) 플루오레세인을 RT-FluFF 시스템에 단계적으로 도입하여 유동 인간 플라즈마에서 형광측정기 재현성 및 형광 평형 시간을 결정합니다. (C) RT-FluFF 플랫폼에서 플루오레세인과 FITC-Fg를 비교하는 연속 주입. 기울기의 차이는 FITC-Fg 그룹의 형광 소광에서 비롯된 것으로 보입니다. (D) 동일한 체적 유량 조건에서 다양한 크기의 댐퍼의 사용과 관련된 출구 압력 센서(응고 후) 파형. 이 그림은 Zeng et al14에서 수정되었습니다. 약어: FITC-Fg = 플루오레세인 이소티오시아네이트 태그 피브리노겐; RT-FluFF = 실시간 형광 측정 유동 섬유소 용해 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66524/66524fig05.jpg"> 그림 5: RT-FluFF 플랫폼에서의 혈전용해. (A) 형광의 대표적인 기울기는 순환 tPA가 있는 상태에서 60분의 응고 분해 과정에서 상승합니다. 플라스미노겐의 tPA 활성화와 혈전 소화가 즉각적으로 일어나지 않기 때문에 초기 혈전용해 지연 시간에 유의하십시오. (B) 다양한 tPa 농도 및 RT-FluFF 시스템, 일정한 전단 하에서의 챈들러 루프 응고 소화 및 정적(전단 없음) 응고 분해를 포함하는 다양한 혈전 용해 방식에서 손실된 응고 질량 비율. 데이터는 3개 데이터 포인트보다 크거나 같은 3개 데이터 포인트에 대한 평균 ± 표준 편차를 나타내며, 이중 별표는 0.01&lt; p-값을 나타내고 3중 별표는 0.001&lt; 나타냅니다. (C) tPA 200ng/mL에서 혈전용해의 총 특성. 이 그림은 Zeng et al.14에서 수정되었습니다. 약어: RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay; tPA = 조직 플라스미노겐 활성제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66524/66524fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

혈전증은 수많은 의학적 상태와 관련이 있으며 현재 치료법은 심각한 출혈의 위험이 있습니다. 순환계 흐름은 혈전 구조에 큰 영향을 미칩니다. 체외 모델에 플로우를 통합하면 생리학적 관련성이 향상되어 생체 내 테스트를 위한 더 나은 후보 물질의 선택이 향상될 수 있습니다.섬유소 용해제 연구를 위한 분석은 주로 정적 응고 또는 미세유체 시스템을 사용하여 용해 시간, 응고 구조 또는 점탄성과 같은 특성을 평가합니다. 정적 응고 용해 분석은 일반적으로 섬유소 용해 효율을 평가하기 위한 종점으로 분광광도계 측정 또는 응고 질량 측정에 의존합니다. 현재의 혈전용해 검사는 정적으로 형성된 혈전을 사용하는데, 이는 유동 조건에서 형성된 혈전과 구조적으로 다릅니다.미세유체 시스템은 유동 역학을 고려하지만 더 작은 규모는 고유한 혈류역학 및 응고 구조를 생성합니다. 현재 개발된 RT-FluFF 분석법은 생리학적 흐름 조건에서 실시간으로 섬유소 용해를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 이는 이제 새로운 혈전용해제를 스크리닝할 때 더 나은 번역을 위해 생체 내 연구 모델에 더 가까운 조건을 모방하기 위해 여러 매개변수를 제어할 수 있는 플랫폼을 갖게 되었음을 의미합니다.

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