Name: 단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 학습하세요 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용한 AAV 벡터 단일 단계 반자동 분리법. HEK 293T 세포에서 6일 만에 고순도 바이러스를 생산하여 전임상 유전자 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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rAAV의 TEM 분석과 관련하여 Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research(iCBR) 및 Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology(CIBB)의 Mónica Zuzarte 박사가 제공한 협력, 통찰력 및 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 코임브라 대학교(CNC-UC)의 신경과학 및 세포 생물학 센터와 코임브라 대학교(IIIUC)의 학제 간 연구 연구소의 Dominique Fernandes 박사에게 주요 신경 세포 배양 실험에 대한 귀중한 기술 지원과 통찰력에 대해 감사를 표합니다. 이 연구에 필수적인 pRV1, pH21 및 pFdelta6 플라스미드는 University of Aberdeen의 생명과학 및 의과대학 의과대학의 Christina McClure 박사에 의해 아낌없이 제공되었으며, 이에 대해 감사드립니다. 이 작업은 Centro 2020 지역 운영 프로그램을 통해 유럽 지역 개발 기금(ERDF)의 자금 지원을 받았습니다. COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화를 위한 운영 프로그램, FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia를 통한 포르투갈 국가 기금 프로젝트: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector(CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene(PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), 재설정 - IDT-COP(CENTRO-01-0247-FEDER-070162), SARS-CoV-2(CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD(CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0(CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT(CENTRO-01-0145-FEDER-181266); 미국 포르투갈 생물 의학 연구 기금 (APBRF) 및 Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT에 의해 IMI2 JU 그랜트 계약에 따라 EU 및 EFPIA의 지원을 받는 945473 없음; GeneT- 팀 구성 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon Europe 프로그램에서 지원101059981. M.M.L.은 2021.05776.BD 의 지원을 받았습니다. C.H.는 2021.06939.BD 의 지원을 받았습니다. A.C.S.는 2020.07721.BD 에 의해 지원되었습니다. D.D.L.은 2020.09668.BD 에 의해 지원되었으며, 그림 1 은 BioRender.com 를 사용하여 생성되었다.

Single-Step Heparin Affinity Chromatography를 이용한 AAV 벡터 정제

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

빠르게 확장되고 있는 AAV vector toolkit은 다양한 투여 경로를 통해 광범위한 세포 유형에 대한 가장 유망한 유전자 전달 시스템 중 하나가 되었습니다. 이 연구에서 우리는 전임상 연구에서 그 가치를 입증할 수 있는 모자이크 rAAV 벡터의 생산, 정제 및 특성화를 위한 개선된 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이를 위해 rAAV1/2 및 rAAV2/9 모자이크 벡터의 생성이 여기에 설명되어 있지만, 표준 rAAV2 벡터를 정제하기 위해 절차를 적용할 수도 있습니다(데이터는 표시되지 않음).
Mosaic rAAV는 PEI를 transfection 시약으로 사용하는 최적화된 transfection 방법에 따라 생산되었습니다. 일시적인 transfection 방법은 유연성과 속도가 뛰어나 초기 단계의 전임상 연구에서 상당한 이점이 있기 때문에 선택되었습니다. 특정 전이유전자 및 혈청형이 검증되면, 감염 과정에 의해 제공되는 추가 유전자와 함께 특정 Rep/Cap 유전자의 subset을 발현하는 안정적인 transfected 세포주를 구축함으로써 생산 시스템을 미세 조정하여 더 나은 확장성과 비용 효율성을 달성할 수 있습니다24. 칼슘-인산염 transfection과 비교했을 때, PEI는 몇 가지 장점이 있습니다. 이 제품은 안정적이고 비용 효율적인 transfection 시약으로 더 넓은 pH 범위 내에서 효과적으로 작동합니다. 또한, 형질주입 후 세포 배지를 변경할 필요가 없어 비용 및 작업량 모두를 현저히 줄일 수 있다69.
CsCl 또는 요오드릭사놀 그래디언트에 의해 부과된 일부 제한을 우회하기 위해 생성된 rAAV를 친화성 크로마토그래피로 수확하고 정제했습니다. 이 전략은 초원심분리 및 그래디언트 없이 수행할 수 있는 간단하고 확장 가능한 접근법을 제공하여 깨끗하고 높은 바이러스 역가를 생성합니다. 실제로, FPLC 시스템을 사용하는 크로마토그래피 기술은 베드 높이가 더 높은 컬럼에 더 많은 수지 부피를 충전하여 자동화하고 확장할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 5mL HiTrap Heparin HP 컬럼을 통합하도록 쉽게 조정할 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한 헤파린 컬럼은 여러 번 재사용할 수 있으므로 이 방법의 비용 효율성에 기여합니다.
그런 다음 정제된 rAAV를 역가, 순도, 형태학적 특징 및 생물학적 활성의 측면에서 특성화했습니다. 흥미롭게도, Coomassie blue 염색에서 3 가지 전형적인 바이러스 캡시드 단백질 외에도 약 17 kDa의 띠가 F8-F16 분획에서 검출되었습니다. 그러나, 이 밴드는 rAAV의 농축 단계 후에 더 이상 존재하지 않는다. 더욱이, 분자량이 VP3 (<62 kDa)보다 낮은 일부 희미한 띠도 B1 및 A69 라벨링에서 검출될 수 있으며, 이는 이들이 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질(70)의 단편일 수 있음을 시사한다. 또 다른 가능성은 이들이 실제로 페리틴(ferritin) 또는 AAV 캡시드 단백질과 유사한 단백질 지문을 공유하고 AAV 생물학에 관여할 수 있는 폴리펩티드를 가진 다른 세포 단백질과 같은 다른 공동 정제 단백질일 수 있다는 것이다 26,71,72.
TEM 및 충격기 분석은 또한 다양한 생산 전반에 걸쳐 다양한 수준에서 빈 입자의 존재를 밝혀냈습니다. 유사하게, 다른 연구에서는 이전에 형질주입 또는 감염 방법에 의해 제조된 rAAV에 대한 가변적이고 높은 수준(>65%)의 빈 캡시드 생성을 보고하였다24,73. rAAV 생성의 메커니즘은 새로 합성된 VP 단백질에서 빈 캡시드를 빠르게 형성하는 것으로 시작하여 Rep단백질 74,75에 의해 매개되는 미리 형성된 캡시드로 게놈 패키징의 느린 속도 제한 단계가 뒤따릅니다. 따라서, 빈 캡시드는 rAAV 생산에서 생성되지만, 빈 캡시드와 전체 캡시드의 비율은 관심 전이유전자의 크기 및 서열 및 세포 배양 조건에 따라 달라질 수 있다58,73. 빈 캡시드는 관심 게놈이 없기 때문에 치료 효과를 제공할 수 없고 잠재적으로 선천성 또는 적응 면역 반응을 증가시킬 수 있기 때문에 몇 가지 우려를 불러일으킵니다. 그러나, 일부 보고는 또한 그들의 비율을 조정함으로써, 빈 AAV 캡시드가 AAV-특이적 중화항체에 대한 매우 효과적인 미끼 역할을 할 수 있고, 따라서 형질도입 효율을 증가시킬 수 있음을 보여주었다 60,76,77. 빈 캡시드의 존재가 결정적으로 해롭고 전체 벡터에 비해 빈 입자의 음이온 특성이 약간 덜한 경우, 잠재적인 해결책은 음이온 교환 크로마토그래피 기술(64)을 사용하여 두 번째 연마 정제 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있습니다.
이 연구는 또한 생성된 모자이크 rAAV가 rAAV1/2의 두개내 주입 시 체외 신경 세포 배양뿐만 아니라 CNS도 효율적으로 transduction할 수 있다는 설득력 있는 증거를 제공합니다. 전반적으로, 이러한 결과는 설명된 생산 및 정제 프로토콜이 고순도의 생물학적 활성 rAAV를 6일 이내에 바로 사용할 수 있게 하며, 전임상 연구에서 rAAV를 생성하기 위한 다재다능하고 비용 효율적인 방법임을 시사합니다.

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 현재 유전자 치료 연구에서 가장 유망한 전달 시스템 중 하나로 자리매김하고 있습니다. 1965년1년에 처음 확인된 AAV는 직경이 약 25nm인 이십면체 단백질 캡시드를 가진 작고 외피가 없는 바이러스로, 단일 가닥 DNA 게놈을 가지고 있습니다. AAV는 단순 헤르페스 바이러스 또는 더 빈번하게는 아데노 바이러스와 같은 도우미 바이러스와의 동시 감염에 대한 독특한 의존성으로 인해 Parvoviridae 계열과 Dependoparvovirus 속에 속합니다.
AAV의 4.7 킬로베이스 게놈은 특징적인 T자형 헤어핀 말단을 형성하는 2개의 ITR(Inverted Terminal Repeat)이 측면에 있는 2개의 ORF(Open Reading Frame)로 구성되어 있습니다4. ITR은 AAV 패키징, 복제 및 적분에 중요한 유일한 시스 작용 요소이므로 재조합 AAV(rAAV) 벡터에서 유지되는 유일한 AAV 염기서열입니다. 이 시스템에서는 벡터 생산에 필요한 유전자가 트랜스로 별도로 공급되어 관심 유전자가 바이러스 캡시드 5,6 내부에 패키징될 수 있습니다.
각 바이러스 유전자는 대체 스플라이싱(alternative splicing)과 스타트 코돈(start codon)을 통해 서로 다른 단백질을 코드화합니다. Rep ORF 내에서 4개의 비구조적 단백질(Rep40, Rep52, Rep68 및 Rep78)이 암호화되어 바이러스 DNA 7,8의 복제, 부위 특이적 통합 및 캡슐화에 중요한 역할을 합니다. Cap ORF는 N 말단에서 서로 다른 3개의 구조 단백질(VP1, VP2 및 VP3)이 조립되어 1:1:10 4,9의 비율로 60-mer 바이러스 캡시드를 형성하기 위한 템플릿 역할을 합니다. 또한, 비전통적 CUG 시작 코돈과 함께 Cap 유전자에 중첩된 선택적 ORF는 어셈블리 활성화 단백질(AAP)을 인코딩합니다. 이 핵 단백질은 새로 합성된 캡시드 단백질 VP1-3과 상호 작용하여 캡시드 조립체10,11을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
캡시드의 아미노산 서열의 차이는 자연적으로 발생하는 11개의 AAV 혈청형과 인간 및 비인간 영장류 조직에서 분리된 100개 이상의 변이체를 설명합니다 7,12,13. 구조적으로 가변적인 영역의 형태 변화는 서로 다른 균주에서 유래한 캡시드의 뚜렷한 항원 특성과 수용체 결합 특이성을 좌우합니다. 그 결과 서로 다른 포유류 장기에 걸쳐 뚜렷한 조직 영양성(tissue tropisms)과 형질도입 효율(transduction efficiency)이 발생한다14.
rAAV의 초기 생산 방법은 보조 목적으로 아데노바이러스 감염에 의존하였다 15,16,17,18,19. 효율적이고 일반적으로 대규모로 쉽게 생산할 수 있음에도 불구하고 이 감염으로 인해 몇 가지 문제가 발생합니다. 불활성화를 위한 정제 및 열 변성 단계 후에도 아데노바이러스 입자가 AAV 제제에 여전히 존재할 수 있으며, 이는 원치 않는 안전성 문제를 구성할 수 있습니다20. 더욱이, 변성된 아데노바이러스 단백질의 존재는 임상적 사용에 허용되지 않습니다. 다른 생산 전략은 Rep/Cap 및 전이유전자를 표적 세포(21) 또는 바큘로바이러스-곤충 세포 시스템(22)으로 가져오도록 조작된 재조합 헤르페스 단순 헤르페스 바이러스 균주를 이용한다. 이러한 시스템은 확장성 및 GMP 호환성 측면에서 이점을 제공하지만 여전히 유사한 문제에 직면해 있습니다.
rAAV 생산을 위한 삼중 형질주입 방법은 이러한 문제를 쉽게 극복하기 위해 일반적으로 채택되어 왔습니다. 간단히 말해서, rAAV 어셈블리는 다음을 암호화하는 3개의 플라스미드를 가진 세포의 일시적인 transfection에 의존합니다: 1) 야생형 AAV2 게놈(pITR)의 ITR 사이에 패킹된 전이유전자 발현 카세트; 2) 복제 및 virion 조립(pAAV-RC)에 필요한 Rep/Cap 서열; 3) 최소 아데노바이러스 단백질(E1A, E1B, E4 및 E2A)과 도우미 효과(pHelper)에 필요한 아데노바이러스 바이러스 관련 RNA6,20,23. 플라스미드 transfection 방법은 전임상 연구에서 rAAV 생산을 위한 단순성과 유연성을 제공하지만, 이러한 절차는 대규모 생산에 적용할 때 확장성 및 재현성 측면에서 한계가 있습니다. 대안적인 접근법으로, 벡터 구조체와 함께 AAV Rep/Cap 유전자 또는 Rep/Cap을 안정적으로 발현하는 AAV 생산자 세포주(부착 성장 및 현탁 성장 모두)를 사용하여 rAAV 생산을 달성할 수 있습니다. 이러한 시스템에서 아데노바이러스 도우미 유전자는 플라스미드 transfection을 통해 도입됩니다. 이 전략은 세포 배양 공정의 확장성을 향상시키지만 기술적으로 복잡하고 시간이 많이 걸립니다 21,24,25.
두 경우 모두, 생산자 세포는 용해되고 하나 또는 여러 정제 단계를 거칩니다. 현재, rAAV를 정제하는 주요 방법에는 염화 세슘(CsCl) 또는 요오드옥산올 초고속 밀도 구배 원심분리의 사용이 포함되며, 그 후 크로마토그래피 기술에 의한 또는 그렇지 않은 방법이 있습니다26. 바이러스 침전을 위한 원래 정제 방법은 황산암모늄을 사용한 후 CsCl 그래디언트를 통해 2회 또는 3회의 초원심분리를 사용했습니다. 이 공정의 주요 장점은 모든 혈청형을 정제할 수 있는 가능성과 다양한 밀도에 따라 빈 캡시드에서 전체 입자를 물리적으로 분리할 수 있는 기능을 포함합니다. 그러나 이 방법은 정교하고 시간이 많이 걸리며 확장성이 제한되어 종종 수율이 낮고 시료 품질이 낮습니다 27,28,29,30. 더욱이, 생리학적 완충액에 대한 투석은 CsCl이 포유류에 가할 수 있는 독성 효과로 인해 생체 내 연구 전에 종종 필요합니다.
요오딕사놀은 또한 rAAV 벡터를 정제하기 위한 대체 이소삼투압 구배 매체로 사용되었으며, 안전성 및 벡터 효능 관점에서 CsCl에 비해 장점이 있습니다. 그러나 CsCl과 마찬가지로 요오딕사놀 방법은 세포 배양 용해물의 로딩 용량(따라서 rAAV 정제의 확장성)과 관련된 몇 가지 단점이 있으며 시간과 비용이 많이 드는 방법으로 남아 있습니다30,31.
이러한 제약을 극복하기 위해 연구자들은 크로마토그래피 기술에 관심을 돌렸습니다. 이와 관련하여 친화성, 소수성 또는 이온 교환 크로마토그래피 방법을 통합하는 여러 정제 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법은 자연 수용체를 포함한 특정 혈청형의 생화학적 특성, 또는 바이러스 입자(32)의 전하 특성에 의존한다. 예를 들어, AAV2, AAV3, AAV6 및 AAV13이 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 바람직하게 결합한다는 발견은 친화성 크로마토그래피 정제에서 밀접하게 관련된 헤파린을 사용할 수 있는 가능성을 열었습니다. 그러나, HSPG에 대한 결합 부위는 혈청형에 따라 다를 수 있으며, 이는 AAV 부착 및 표적 세포의 감염을 매개하는 다양한 방식으로 작용할 수있다 2,33,34,35,36. 반면에 AAV1, AAV5 및 AAV6은 N 결합 시알산(SA)에 결합하는 반면 AAV4는 O 결합 SA 2,14,34를 사용합니다. 동일한 이론적 근거에 따라, SA37에 고도로 농축된 포유류 단백질인 뮤신(mucin)의 사용을 기반으로 rAAV5 정제를 위한 단일 단계 친화성 크로마토그래피 프로토콜도 개발되었습니다. 헤파린 기반 기술과 마찬가지로 이 정제도 생성되는 특정 혈청형에 따라 달라집니다. 헤파린과 뮤신 외에도 A20 단클론 항체 및 카멜리드 단일 도메인 항체(AVB Sepharose 및 POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41과 같은 다른 리간드가 친화성 크로마토그래피를 위해 탐색되었습니다. 기존의 정제 방법을 개선하기 위한 다른 혁신적인 전략에는 특정 결합 에피토프를 제시하기 위해 rAAV 캡시드에 작은 변형을 도입하는 것이 포함됩니다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 태그 또는 비오틴화된 rAAV는 해당 에피토프(각각 니켈 니트릴로트리아세트산 및 아비딘 수지)를 표적으로 하는 리간드를 사용하여 정제할 수 있습니다.42,43,44.
rAAV의 원하는 특성을 넓히기 위한 노력의 일환으로, 연구자들은 캡시드를 혼합하여 바이러스를 교차 드레싱했습니다. 이는 생산 중에 두 개의 별개의 AAV 혈청형에서 캡시드 유전자를 등몰 또는 다른 비율로 공급함으로써 달성되며, 서로 다른 혈청형 34,45,46,47,48,49,50의 캡시드 소단위체의 혼합물로 구성된 캡시드 구조를 생성합니다 . 이전 연구에서는 AAV2와 AAV1(1:1 비율) 및 AAV2와 AAV9(1:1 비율)의 캡시드 단백질을 함께 발현하면 각각 모자이크 rAAV1/2 및 rAAV2/9 벡터가 생성된다는 물리적 증거를 제공합니다(45,46,48). 모자이크 rAAV 생성의 주요 이점은 다양한 AAV 혈청형의 유리한 형질을 통합할 수 있는 능력으로, rAAV 생산 중에 유용한 다른 특성을 유지하면서 전이유전자 발현 및 영양성에서 시너지 효과를 개선합니다. 흥미롭게도, 어떤 모자이크 변이체들은 심지어 부모 바이러스 46,47,49 와서와는 다른 새로운 특성을 나타내기도 한다. AAV2의 헤파린 결합 능력을 이용함으로써, 모자이크 rAAV 벡터는 잠재적으로 AAV2를 유도 진화 및/또는 합리적 설계에 의해 생성된 다른 천연 또는 새로운 AAV 캡시드와 혼합하여 생성 및 정제할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이전 연구에서는 모자이크 벡터를 조립하려고 할 때 capsid subunit 호환성의 중요성을 강조했습니다. 예를 들어, Rabinowitz와 동료들은 AAV1, AAV2 및 AAV3의 transcapsidation이 모자이크 캡시드의 효율적인 공동 조립으로 이어졌지만, 이러한 혈청형과 AAV4의 교차 드레싱이 안정적인 virions 34,45,47의 생성을 방해한다는 것을 입증했습니다. 또한, AAV1, AAV2 및 AAV3는 AAV5와의 호환성이 낮았는데, 이는 이러한 캡시드를 서로 다른 비율로 혼합할 때 얻어지는 감소된 바이러스 역가를 감안할 때 그렇습니다. 흥미롭게도, 모자이크 rAAV2/5는 헤파린 결합 특성이 감소한 반면, 부모 AAV5와 같은 뮤신 결합 능력은 유지했습니다. 그러나 3:1 비율의 rAAV3/5는 헤파린과 뮤신에 대한 이중 결합을 보존했습니다. 전반적으로, 향상된 transduction, specific tropism 또는 낮은 immunogenicity를 가진 새로운 모자이크 rAAV의 생성은 캡시드 조립 및 수용체 상호 작용에 대한 우리의 이해에 큰 도움이 될 수 있으며, 특정 조합은 여전히 철저한 조사와 최적화가 필요합니다.
본 연구에서는 최적화된 헤파린 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 rAAV의 생산 및 정제를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. rAAV는 일시적인 transfection에 의해 생성되며 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용하여 정제됩니다. 선택된 정제 분획의 농축 후, 생성된 바이러스 스톡은 역가, 순도, 고유한 물리적 특성 및 in vitro 및 in vivo 생물학적 활성의 측면에서 특성화됩니다. 개념 증명(PoC)으로서, 모자이크 rAAV1/2 및 rAAV2/9 벡터 생성을 위한 이 프로토콜의 개선 사항과 적용 가능성을 입증합니다. 각 혈청형의 선택은 현저하게 다른 트로피즘을 기반으로 했으며, 이는 잠재적으로 모자이크 버전에도 고유한 특성을 부여할 수 있습니다. 중추신경계(CNS)에 대한 전반적인 중간 정도의 영양성을 가진 AAV 혈청형 1은 뉴런과 신경교세포를 transduction할 수 있는 능력을 가지고 있으며(정도는 덜하지만) in vivo 2,7,8에서 전방 및 역행 방향으로 축삭 수송을 겪습니다. 또한, AAV 혈청형 9는 혈액-뇌 장벽을 통과하고 신생아 및 성인 마우스 모두에서 CNS를 표적으로 하는 자연적인 능력 때문에 선택되었습니다51,52. 마지막으로, AAV 혈청형 2는 헤파린에 결합하는 능력을 고려하여 선택되었으며, 이는 친화성 크로마토그래피33을 가능하게 했습니다. 정제된 rAAV1/2 및 rAAV2/9 입자는 두 부모 AAV 혈청형의 특성을 결합하여 CNS 45,46,48,49의 transduction에 적합한 벡터를 구성합니다.

<table><tbody><tr><td>10% 포비돈-요오드</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>11889684</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>96-well Stunner plate</td><td>Unchained Labs</td><td>701-2025</td><td>rAAV 샘플의 연속 자외선 가시광선 흡수, 정적 광 산란 및 동적 광 산란 분석을 위한 96-well 정량화 플레이트</td></tr><tr><td>AAVpro 적정 키트(Real-Time PCR용) Ver.2</td><td>Takara</td><td>6233</td><td>RT-qPCR을 사용하여 AAV의 역가를 측정하기 위한 것입니다. 이 키트에는 DNase I, 용해 완충액, 희석 완충액, 양성 대조군, Taq II 혼합물, 프라이머 정방향, 프라이머 리버스, 물</td></tr><tr><td>아세트산 빙하</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0360/PB17</td><td></td></tr><tr><td>&Auml이 포함되어 있습니다. KTA pure 25</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>UNICORN 소프트웨어로 제어되는 FPLC 시스템, 버전 6.3&nbsp;</td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 결합 염소 안티-마우스</td><td>인비트로젠</td><td>31328</td><td></td></tr>, <tr><td>아미콘 울트라-0.5 원심 필터 유닛</td>, <td>머크 밀리포어</td><td>UFC5100</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 울트라-15 원심 필터 유닛</td>, <td>머크 밀리포어</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>벤조나제 뉴클레아제 머</td><td>크 밀리포어</td><td>E1014</td><td></td></tr>, <tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR 검출 시스템</td><td>Biorad</td><td>184-5096</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 터치 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G250</td><td>Fisher Chemical</td><td>C/P541/46</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td><td></td>BP17225</tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>ECF 기판 웨스턴 블로팅</td><td>Cytiva</td><td>RPN5785</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest SmaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0663</td><td></td></tr><tr><td>FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin</td><td>FEI</td><td>Biotwin</td><td>Transmission 전자 현미경</td></tr><tr><td>태아 혈청</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Formvar-carbon coated 200 mesh grid</td><td>&nbsp; TAAB Laboratories Equipment</td><td>F077/025</td><td></td></tr><tr><td>가스 배출 장치</td><td>RWD</td><td>R546W</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 생물 시약</td><td>10021083</td><td></td></tr><tr><td>염소 다클론 항닭 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 바늘 30G, 스몰 허브 RN 바늘, 25mm, PST3</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기(10 &micro; L)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL</td><td>Cytiva</td><td>17040701</td><td>Pre-packed heparin column</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17040601</td><td>Pre-packed heparin column</td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF Membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>브라운</td><td>469860</td><td></td></tr><tr><td>케타민&nbsp;</td><td>Dechra Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td>Nimatek</td></tr><tr><td>저잔류 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11906965</td><td></td></tr><tr><td>Lunatic & Stunner 클라이언트 소프트웨어</td><td>Unchained Labs</td><td>N/A</td><td>클라이언트 분석 소프트웨어 버전 8.0.1.235. rAAV 샘플의 연속 자외선 가시광선 흡수, 정적 광 산란 및 동적 광 산란 분석을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 케미컬</td><td>M/4000/FP21</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 AAV, VP1, VP2 항체(A69)</td><td>American Research Products</td><td>03-61057</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 AAV, VP1, VP2, VP3 항체(B1)</td><td>American Research Products</td><td>03-61058</td><td></td></tr><tr><td>Neuro2a</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>12738422</td><td></td></tr><tr><td>NZYColour Protein Marker II</td><td>NZYtech</td><td>MB09002</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CMV-scGFP</td><td>Addgene</td><td>32396</td><td>Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396</td></tr><tr><td>pAAV-CMV-ssGFP</td><td>Addgene</td><td>105530</td><td>Addgene 플라스미드 # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530</td></tr><tr><td>pAAV2/9n</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Addgene 플라스미드 # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>아크로스 유기물</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2438</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 비이온 계면활성제(100x)</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine MAX, MW 40,000</td><td>Polysciences Europe</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>R500 시리즈 소형 소형 동물 마취기 - Isoflurane</td><td>RWD</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>샘플 입구 밸브 V9-IS</td><td>Cytiva</td><td>29027746</td><td></td></tr><tr><td>샘플 펌프 P9-S</td><td>Cytiva</td><td>29027745</td><td></td></tr><tr><td>아지 화 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데 옥시 콜레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨(SDS)</td><td>Fisher 생물시약</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PVDF 주사기 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>15191499</td><td></td></tr><tr><td>Stunner Platform</td><td>Unchained Labs</td><td>700-2002</td><td>rAAV 샘플의 연속 자외선-가시광선 흡수, 정적 광 산란 및 동적 광 산란 분석을 위한 장비</td></tr><tr><td>Superloop 150 mL</td><td>Cytiva</td><td>18-1023-85</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 50 mL</td><td>Cytiva</td><td>18-1113-82</td><td></td></tr><tr><td>SURE 2 supercompetent cells</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>HPA200152</td><td></td></tr><tr><td>처리 된 배양 접시</td><td>Corning</td><td>734-1711</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>W21404</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Dechra Pharmaceuticals</td><td>N/A</td><td>Sedaxylan</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss 현미경 검사와 접합 GmbH</td><td>N/A</td><td>EC Plan-Neofluar 10x/0.30 대물렌즈 및 Plan-Apochromat 40x/0.95 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>Zeiss Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>N/A</td><td>슬라이드 스캐너 Plan-Apochromat 20x/0.8 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>N/A</td><td>가 장착된 도립 형광 현미경 해당 사항Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC 대물렌즈&마이크로가 장착된 도립 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>;슬라이드 8웰 Ibidi</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>8웰 챔버 슬라이드</td></tr></tbody></table>

단일 단계 및 반자동 heparin affinity chromatography protocol을 통한 adeno-associated viral vectors 분리

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

아데노 관련 바이러스(AAV)는 in vivo 유전자 전달을 위한 점점 더 가치 있는 벡터가 되었으며 현재 인간 임상 시험을 진행 중입니다. 그러나 AAV를 정제하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 염화세슘 또는 요오드릭산올 밀도 구배 초원심분리를 사용합니다. 이러한 방법의 장점에도 불구하고 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 확장성이 제한되며 종종 순도가 낮은 벡터를 생성하게 됩니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 연구자들은 크로마토그래피 기술에 관심을 기울이고 있습니다. 여기에서는 AAV 정제를 위한 보편적인 캡처 단계 역할을 하는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 프로토콜을 제시합니다.
이 방법은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 AAV 혈청형 2(AAV2)의 내적 친화도에 의존합니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 원하는 AAV 캡시드 단백질을 AAV2의 단백질과 인코딩하는 플라스미드의 동시 transfection을 수반하며, 이를 통해 두 부모 혈청형의 특성을 결합한 모자이크 AAV 벡터를 생성합니다. 간단히 말해서, 생산자 세포의 용해 후 AAV 입자를 포함하는 혼합물은 표준 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용하여 최적화된 단일 단계 헤파린 친화성 크로마토그래피 프로토콜에 따라 직접 정제됩니다. 정제된 AAV 입자는 이후에 농축되고 순도 및 생물학적 활성 측면에서 포괄적인 특성 분석이 거쳐집니다. 이 프로토콜은 초원심분리 및 그래디언트 없이 수행할 수 있는 간단하고 확장 가능한 접근법을 제공하여 깨끗하고 높은 바이러스 역가를 생성합니다.

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

이 연구에서 우리는 전임상 연구에서 그 가치를 입증할 수 있는 모자이크 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산, 정제 및 특성화를 위한 개선된 프로토콜을 개발하고자 합니다. 안정적인 생산자 세포주를 확립하기 위한 노력에도 불구하고 포유류 세포에서 일시적인 transfection은 여전히 AAV 생산의 주요 워크플로우입니다. 그런 다음 AAV는 초고속 밀도 구배 원심분리 또는 바이러스 입자의 생화학적 특성에 의존하는 크로마토그래피 기술로 정제됩니다.AAV를 정제하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 염화 세슘 또는 요오드릭산올 밀도 구배 초원심분리를 사용합니다. 장점에도 불구하고 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 시간이 많이 걸리고 확장성이 제한되며 순도가 낮은 일부 벡터에 결과를 제공하는 경우가 많습니다.이제 이러한 제약을 극복하기 위해 여러 연구자들이 크로마토그래피 기술에 관심을 기울이고 있습니다. AAV2의 헤파린 결합 능력을 기반으로 모자이크 rAAV를 생성하기 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 순도가 높고 생물학적으로 활성이 높은 rAAV를 6일 만에 바로 사용할 수 있게 하며, 전임상 연구를 위한 rAAV를 생성하기 위한 반자동, 확장 가능하고 비용 효율적인 전략으로 나타납니다.모자이크 rAAV의 생성에 이 방법의 적용 가능성을 입증한 후, 이제 생산 시스템을 미세 조정하여 생산자 세포주를 구축함으로써 더 나은 확장성과 비용 효율성을 달성할 수 있습니다. 또한 두 번째 연마 정제 단계를 포함하여 빈 입자를 제거하는 것을 목표로 합니다.

isolation-adeno-associated-viral-vectors-through-single-step-semi

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAVs) 벡터를 위해 점점 중요 해지고...

재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

여기, 우리가 생산 하는 효율적이 고 재현 가능한 전략, titer, 및 품질 관리 일괄 adeno 관련 바이러스 벡터의 설명 합니다. 그것은 높은 titer로 벡터 준비를 하면 (13 벡터 게놈/10ml x ≥1)와 고 순도, 생체 외에서 또는 vivo에서 사용에 대 한 준비.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 &gt;1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.

대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산

아데노 관련 바이러스는 현탁 세포 배양에서 생성되며 이중 요오드화놀 밀도 구배 원심분리로 정제됩니다. 총 바이러스 수율을 높이고, 바이러스 침전의 위험을 줄이고, 최종 바이러스 산물을 더욱 농축하기 위한 단계가 포함되어 있습니다. 예상되는 최종 역가는10,12 바이러스 입자/mL에 도달하며 전임상 in vivo 사용에 적합합니다.

In Vivo 응용 분야를 위한 Iodixanol Density Gradient Centrifugation에 의한 아데노 관련 바이러스의 현탁 배양 생산 및 정제

여기에서 현탁액 HEK293 셀 기반 AAV 생산 프로토콜이 제시되어 상용 공급업체에서 연구 목적으로 사용할 수 있는 구성 요소를 사용하여 벡터 생산에 필요한 시간과 노동력을 줄일 수 있습니다.

HEK293 부유 세포를 사용한 고수율 Adeno 관련 벡터 배치 생산

유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

우리는 전이성 질환의 조기 지표로 흑색증 세포 순환 감지하는 레이저 유도 초음파를 사용하여 플로우 cytometer을 개발했습니다.

Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

학습하세요 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용한 AAV 벡터 단일 단계 반자동 분리법. HEK 293T 세포에서 6일 만에 고순도 바이러스를 생산하여 전임상 유전자 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

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