Name: Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 배우세요 원발성 인간 유방 상피세포(HMECs)의 효율적인 분리 및 배양 방법을 소량 조직에서 적용하는 것입니다. 이 프로토콜은 육아종성 유방염 병리 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 중국 저장성 한의학과학기술프로그램(2017ZA055; 2018ZA036), 중국 구이저우성 주이(Zunyi)의 과학기술프로젝트(Zunyi City Kehe Support NS(2020) No. 18)에서 X. Xu. 저자들은 세포 배양 교육을 제공한 Youjia(Hangzhou) Biomedical Technology Company의 분자 생물학 실험실에 감사를 표합니다.

이 프로토콜에 사용된 신선한 정상 유방 조직은 저장성 중문대학교 제1부속병원 의료윤리위원회의 지침에 따라 저장중의과대학 제1부속병원에서 난치성 육아종성 소엽유선염의 병변 주위 수술에서 채취한 것입니다(의정서 번호. ChiMCTR2100005281, 날짜: 2017-07-17).
1. 조직의 획득
<ol><li>성인 여성에서 채취한 수술 표본에서 신선한 유방 조직을 3% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 멸균 튜브에 수집합니다. 참고: 유방 조직은 수술 후 채취 후 24시간 이내에 다음 세부 사항에 따라 처리해야 합니다.</li>
</ol>2. 조직의 전처리
<ol><li>두 쌍의 집게로 유방 조직에서 지방 조직을 제거하고 나머지 유방 조직의 무게가 ~1g이 되도록 합니다.</li>
	<li>유방 조직을 75% 에탄올 용액(5mL)에 5초 동안 헹구고 20mL의 세척 용액(표 1)으로 2 x 5분 동안 세척합니다.</li>
</ol>3. 조직의 소화
<ol><li>유방 조직을 더 작은 조각으로 자르고 두 개의 수술용 칼날을 사용하여 15분 동안 조직을 파쇄하여 조직 균질화를 얻습니다. 조직 조각을 50mL 원심분리기 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>유방 조직 조각이 들어있는 50mL 원심분리 튜브에 총 20mL의 분해 용액에 5.0mg/mL 디스파제 + 5.0mg/mL 콜라겐분해 효소 용액 5.0mL, 0.25% 트립신 3mL, PBS 7mL를 추가합니다. 튜브를 37 ° C의 수조에 넣고 1.5 시간 동안 배양하십시오. 20분마다 튜브를 흔듭니다.</li>
	<li>중화 용액 20mL를 주입하여 분해 과정을 중지합니다. 피펫팅으로 내용물을 ~15배 섞습니다.</li>
	<li>100μm 메쉬 필터를 통해 혼합물을 여과합니다. 156 × g 에서 5분 동안 원심분리기</li>
	<li>상층액을 제거하고 20mL의 중화 용액으로 펠릿의 배양을 반복합니다. 피펫팅으로 15배를 섞고 156× g 에서 5분 동안 원심분리기를 합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 제거하고 초기 배양 배지 10mL로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시에 담습니다.</li>
	<li>37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 원래 배양 배지를 3일마다 새로운 상피 세포 배지로 교체합니다. 셀을 확인하고 2일마다 배지를 새로 고칩니다.</li>
</ol>4. 세포 통과
<ol><li>세포가 80%-90% 밀도에 도달하면 인큐베이터에서 100mm 접시를 제거하고 사용한 배지를 버리고 접시를 2mL의 PBS로 2번 헹굽니다. PBS를 제거한 다음 각 100mm 접시에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다. 알림: 트립신 용액이 접시 바닥에 충분히 닿도록 접시를 휘젓습니다.</li>
	<li>분해 과정을 위해 100mm 접시를 37°C 인큐베이터에 ~7분 동안 넣습니다.</li>
	<li>40x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 세포를 검사하여 대부분의 세포가 접시 바닥에서 분리되었는지 확인합니다.</li>
	<li>8mL의 중화 용액을 추가하여 분해 과정을 중지하고 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 위아래로 10-15x 피펫팅하여 세포를 혼합합니다. 156× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 제거하고 10mL의 상피 세포 배지로 세포를 재현탁시키고 세포 수를 계산합니다.</li>
	<li>100mm 접시에 10mL의 상피 세포 배지에 1 × 106 세포를 추가합니다.</li>
	<li>상피 세포 배지를 새로 고치고 2일마다 세포를 관찰합니다.</li>
</ol>5. 세포 동결 보존
<ol><li>4.1-4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 제거하고 2mL의 세포 동결 보존 용액에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>세포가 들어있는 동결 보존 용액 1mL를 각 극저온 바이알에 옮깁니다.</li>
	<li>냉동 보존된 세포의 이름, 통로 번호 및 날짜를 기록하십시오.</li>
	<li>바이알을 -80 °C의 제어된 속도 냉동 용기에 밤새 넣습니다.</li>
	<li>-80 °C 냉동고에서 극저온 바이알을 제거하고 장기 보관을 위해 액체 질소로 빠르게 옮깁니다.</li>
</ol>

인간 조직에서 유방 상피 세포를 분리하기 위한 프로토콜

<ol><li>Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-epidemiology%2C+classification%2C+pathogenesis+and+treatment+%28review+of+literature%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature).</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).</li>
<li>Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoepithelial+cells%3A+Their+origin+and+function+in+breast+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).</li>
<li>Faridi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+primary+epithelial+breast+cancer+cells+and+the+adjacent+normal+epithelial+cells+from+iranian+women%27s+breast+cancer+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors.</a> Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).</li>
<li>Tovar, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+rat+mammary+gland%3A+Isolation%2C+characterization%2C+and+culture+of+purified+mammary+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts.</a> Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).</li>
<li>Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bselective+secondary+tissue+attachment%26%2334%3B+method+for+isolation+and+purification+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">A &#34;selective secondary tissue attachment&#34; method for isolation and purification of mammary epithelial cells.</a> Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pig+mammary+epithelial+cell+culture+model+as+a+non-clinical+tool+for+studying+epithelial+barrier-a+contribution+from+the+imi-conception+project%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+goat+ear+fibroblasts+into+lactating+mammary+epithelial+cells+induced+by+small+molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+Rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+of+human+breast+epithelial+and+myoepithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> J Vis Exp. (138), e57784(2018).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+human+gingival+epithelial+cells+using+y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632.</a> J Vis Exp. (177), e62978(2021).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+mammary+epithelial+cells+isolated+and+propagated+by+conditional+reprogrammed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture.</a> Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).</li>
<li>Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologe%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the breast.</a> Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).</li>
<li>Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata-3+maintains+the+differentiation+of+the+luminal+cell+fate+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland.</a> Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).</li>
<li>Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+adipose+tissue+models+for+studying+mammary+gland+development+and+breast+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).</li>
<li>Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+isolation+of+normal+luminal+mammary+epithelial+cells+and+breast+cancer+cells+from+primary+and+metastatic+sites+using+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media.</a> Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).</li>
<li>Band, V., Sager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+traits+of+normal+and+tumor-derived+human+mammary+epithelial+cells+expressed+in+a+medium+that+supports+long-term+growth+of+both+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).</li>
<li>Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+cells+cultured+from+early-lactation+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Some properties of cells cultured from early-lactation human milk.</a> J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Ren, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cultures+of+mouse+small+intestinal+epithelial+cells+using+the+dissociating+enzyme+type+I+collagenase+and+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase.</a> Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).</li>
</ol>

저자들은 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.

HMEC는 유방 조직의 해부학적 및 기능적 무결성을 보존하는 데 필수적이며 과학적 조사, 임상 구현 및 관련 영역에서 유용합니다15. 일차 상피 세포는 통로가 제한되고 수명이 짧은 특수 세포의 한 유형입니다. 그러나 HMEC의 성장은 기술적 제약으로 인해 방해를 받아왔으며, 이는 결과적으로 유방암 및 유방과 관련된 기타 염증성 질환에 대한 연구 발전을 저해해 왔다16.
따라서 신선한 유방 조직에서 HMEC를 얻을 수 있는 안정적이고 실현 가능하며 효율적인 방법을 개발하는 것이 시급합니다. Hammond et al.8 및 Band and and Sager17 은 유방 상피 세포를 성공적으로 추출하고 배양했습니다. 그러나 필요한 배양 배지의 구성은 지나치게 복잡했습니다. Taylor-Papidamitriou et al.의 이전 연구에서는 성장 인자와 혈청이 보충된 배지를 사용하여 모유의 공동 세포를 배양할 수 있음을 보여주었습니다18. 이 방법을 사용하면 모유에서 HMEC를 직접 추출할 수 있지만 비상피 세포의 존재는 HMEC의 성장에 영향을 미칠 수 있어 세포 수를 정확하게 측정하기 어렵게 만들 수 있습니다. Jin et al.은 기존 배양 방법에 비해 1차 HMEC의 수명 주기가 더 길고 세포 이질성을 유지할 수 있는 조건부 재프로그래밍 방법을 개발했지만, 특정 배양 조건에 크게 의존하여 다른 실험실 및 응용 분야에서 이 방법의 사용을 제한했습니다12.
Zubeldia-Plazaola 그룹의 연구에 따르면 콜라겐 분해 효소와 히알루로니다아제의 혼합물로 다진 조직 조각을 천천히 소화(밤새) 한 다음 두 번째 날에 기질/상피 분획을 분리하기 위해 세 번의 차등 원심분리를 포함하는 최적화된 분리 방법을 확립했습니다. 이 분리 방법과 배양에 Y-27632를 추가하면 많은 수의 생존 가능한 상피 세포가 생성되었습니다. 그러나 연구에 사용된 유방 조직의 양은 40-75g이었고 격리 절차는 거의 2일 동안 지속되었다9. 여기에서 우리는 이 프로토콜에서 1g의 조직만 사용했다고 보고하며, 이 방법은 0.25g의 조직에도 효과가 있다는 것을 테스트한 결과 발견했습니다. 콜라겐 분해 효소, 디스 파제 및 트립신의 효소 혼합물은 1.5 시간 안에 1g의 조직을 효율적으로 소화했으며 전체 절차는 ~ 3 시간이 걸렸습니다. 초기 배양 배지에 Y-27632를 첨가하면 상피 세포의 부착 및 증식을 촉진할 수 있을 뿐만 아니라 기질 세포의 성장을 억제할 수있다 19. 중요한 것은 이 연구에서 초기 배지의 구성 요소를 테스트하고 이전 간행물에서 사용된 G 배지를 대체하기 위해 DMEM의 5% FBS가 표피 세포 부착 및 성장을 촉진하기에 충분하다는 것을 발견했습니다10.
초기 배지에서 2일 동안 배양한 후, 세포를 무혈청 각질세포 배지에서 배양하였다. 접종 후 초기 배양(P0)을 위한 세포 성장 패턴은 콜로니 성장 패턴을 보여주는 그림 2와 같습니다. 이 분리 방법은 유방 조직의 근상피 세포를 포함하여 모든 유형의 상피 세포를 생성할 수 있으며, 향후 추가 특성화가 필요합니다. 그럼에도 불구하고 초기 배양 배지에 Y-27632를 추가하지 않고 Y-27632가 있는 상태에서 세포의 성장을 대조군과 비교함으로써 Y-27632를 사용한 방법이 세포 생산을 크게 향상시키고 세포 배양의 효율성을 향상시켰음을 확인할 수 있었습니다(그림 2A). 접종 후에 배양의 보통 ~9-10 일은, 표피 세포 passaging를 위해 적당한 조밀도를 달성할 수 있었습니다. 또한 Y-27632의 존재가 초기 배양 종료 시 동결된 P0 세포를 회수한 후 P1 HMEC 성장을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다(그림 3). 우리의 손에서 우리는 세포의 90% 이상이 냉동 저장에서 해동된 후에도 생존할 수 있다는 것을 발견했습니다. 세포는 약 72시간의 배증 시간을 가졌으며 HMEC는 7번째 통로까지 정상적인 성장을 유지할 수 있었습니다.
이 연구에서 세포는 높은 수준의 유방 상피 세포 마커 CK7 및 GATA3를 발현했으며, 중요한 것은 초기 배양 후기 단계의 세포의 거의 100%가 CK7 및 GATA3에 대해 양성이었다는 것입니다(그림 4). 마지막으로, 이 연구는 P0 및 P3 세포에서 CK7 및 GATA3의 발현 수준을 비교하여 둘 다에서 높은 발현 수준을 나타냈으며, 이는 통로가 세포의 표현형을 변경하지 않았음을 시사합니다(그림 5A, B). 또한, Y-27632의 존재에 관계없이 CK7 및 GATA3는 일관되게 높게 발현되었으며, 이는 Y-27632의 첨가가 세포 표현형에 영향을 미치지 않았음을 의미합니다(그림 5C,D).
우리의 접근법을 통한 세포 증식 향상의 주요 원인은 Y-27632의 포함이며, 이는 인간 상피 세포19,20의 증식 및 전문화에 유리한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. Chapman et al.은 Y-27632를 사용하면 상피 세포의 증식 능력이 크게 향상되고 세포 위기의 징후 없이 세포의 성공적인 불멸화로 이어진다는 것을 발견했습니다21. 우리의 연구에서, Y-27632는 이러한 상피 세포의 부착 및 증식을 향상시킴으로써 수율을 크게 증가시켰다19.
이 방법의 주요 특징 중 하나는 디스파제와 콜라겐분해효소를 결합하여 결합 조직에서 상피 조직을 분리하는 동시에 트립신을 사용하여 상피 조직에서 상피 세포를 해리하는 것입니다22. Dispase는 상피 세포의 생존력을 유지하면서 손상되지 않은 표피를 진피에서 분리하고 배양 중인 상피 세포의 손상되지 않은 층을 기본 표면에서 분리하는 빠르고 효율적이면서도 부드러운 효소임이 입증되었습니다23. 유형 I collagenase는 상피 세포의 고립을 촉진하고 세포의 생명력 그리고 완전성을 지킨다24. 이 방법의 또 다른 주요 특징은 Y-27632와 함께 초기 배지를 사용하여 새로 분리된 HMEC를 배양하는 것입니다. 3일째 되는 날 세포가 접시에 부착된 후 배양 배지를 Keratinocyte Serum-Free Medium으로 변경합니다. 이 접근 방식은 실험 단계를 눈에 띄게 단순화하고 실험 비용을 줄입니다. 그 결과, 이 방법으로 적은 양의 유방 조직만을 사용하여 매우 만족스러운 세포 수를 얻을 수 있었으며, 이는 많은 양의 초기 조직이 필요하지 않다는 것을 나타냅니다. 그러나 이 접근법의 한 가지 단점은 트립신의 존재가 상피 세포의 무결성을 적절하게 보호하지 못한다는 것입니다. 이 방법의 또 다른 잠재적으로 제한적인 측면은 초기 배양 동안 근상피 세포의 소량(<1%) 오염 가능성이다9.
당사의 분석법은 성인 유방 조직에서 유래한 일차 HMEC를 분리하고 배양하기 위한 간소화되고 효율적인 접근법을 제공합니다. 이 기술은 단순성, 시간 절약형 특성 및 기본적인 세포 기능을 유지하는 능력이 특징입니다. 결과적으로, 이 기술은 분명한 장점이 있으며 상당한 양의 상피 세포를 생성하는 데 매우 유망합니다. 또한, 이 방법은 광범위한 기증자로부터 HMEC를 분리하고 배양할 수 있어 실험실 연구와 임상 응용 분야 모두에 적합하므로 매우 다양하고 광범위하게 적용할 수 있습니다.

유방암은 전 세계적으로 여성에게 진단되는 주요 유형의 암이며 암으로 인한 주요 사망 원인입니다1. 유방암의 발병 기전은 유전학, 환경, 생활 방식과 같은 여러 요인이 관련되어 복잡합니다. 활성 우유 생산 세포인 HMEC는 유방 조직의 가장 중요한 구성 요소 중 하나이며 유방암 발암에 관여하는 원래 세포일 가능성이 높습니다. 따라서 HMEC은 유방암 연구에서 연구자들로부터 가장 많은 주목을 받고 있다2. 또한, 일차 세포는 유전적 안정성, 정상적인 형태 및 불멸화된 세포주로는 달성할 수 없는 보다 완전한 기본 세포 기능 세트를 유지함으로써 복잡한 세포 과정에 대한 생물학적으로 관련된 특성을 제공할 수 있는 능력을 가지고 있습니다3. 따라서 일차 HMEC의 격리 및 배양은 유방암 및 유방 염증성 질환과 같은 대부분의 유방 관련 질환 연구에 필수적인 단계입니다.
현재 쥐, 소, 돼지 및 염소로부터 유방 상피 세포의 분리, 배양 및 식별을 위한 안정적이고 재현 가능한 시스템이 확립되었습니다 4,5,6,7. 그러나 1차 HMEC의 분리 및 배양은 복잡한 미세환경과 세포의 낮은 수율로 인해 까다롭습니다. 수십 년 동안 과학자들은 HMEC를 분리하고 배양할 수 있는 가장 효과적인 방법을 찾고 있었지만 HMEC를 위한 배양 시스템이 거의 20년 전에 확립되었습니다. 예를 들어, Hammond et al.은 HMEC가 효율적으로 성장하는 무혈청 배양 배지를 개발했습니다8. 최근 Zubeldia-Plazaola 등은 HMEC를 얻기 위해 순차 여과 또는 차등 원심분리 단계와 결합된 빠른/느린 효소 분해 절차를 사용하여 4가지 다른 분리 방법을 테스트했습니다9. 그들은 차등 원심분리와 함께 느린 소화 방법이 신선한 유방 조직에서 HMEC를 분리하는 가장 효율적인 방법이라는 것을 발견했습니다. 그러나 이 분리 방법은 큰 조직 조각(40-75g)이 필요하고 더 많은 양의 소화 효소를 사용합니다. 그들의 절차는 복잡하고(서로 다른 세포 분획을 얻기 위해 최소 세 가지 다른 원심분리) 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 연구 및 임상 응용을 위해 소량의 유방 조직에서 HMEC의 집단을 효율적으로 얻기 위해서는 여전히 간단하고 빠른 방법이 필요하다9.
우리의 이전 연구는 Rho-associated kinase (ROCK) 억제제 Y-27632를 초기 배양 배지에 첨가하면 인간 피부 표피 세포(10)를 분리하는 과정을 단순화할 수 있음을 보여주었으며, 이는 치은 상피 세포(11)의 분리에도 성공적으로 사용되었습니다. 또한, Zubeldia-Plazaola 연구팀과 Jin 연구팀이 실시한 선행 연구에 따르면 Y-27632는 유방 조직 9,12에서 유래한 일차 상피세포의 빠르고 무제한적인 체외 성장을 자극할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 Y-27632를 사용하면 HMEC의 분리 및 배양이 단순화되는지 여부를 테스트하는 것을 목표로 했으며, 유방 조직의 작은 조각(1g)에서 HMEC를 분리하는 간단하고 쉽게 수행할 수 있는 방법을 성공적으로 확립했습니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Basalmedia</td><td>K431010</td><td>HMECs&nbsp; 해리용</td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>NEST</td><td>081722CK01</td><td>세포 소화용</td></tr><tr><td>100 &micro; m 메쉬 필터</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>HMEC 여과용</td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 접시</td><td>코닝</td><td>430167</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Solarbio</td><td>P1110-100ml</td><td>HMEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용</td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>코닝</td><td>430829</td><td>세포 원심분리용</td></tr><tr><td>세포 스트레이너</td><td>Solarbio</td><td>431752</td><td>세포 여과</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5404HN133048</td><td>세포 원심분리기</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>42820906</td><td>세포 인큐베이션용</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 타입 I</td><td>Merck</td><td>SKU:SCR103</td><td>HMEC 격리용</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>CAS : 42613-33-2</td><td>HMEC 분리</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>8122622</td><td>중화 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>2556132P</td><td>중화 매체</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이신</td> 구성 <td>요소 Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Tecono</td><td>20201033</td><td>세척액</td></tr><tr><td>토끼 안티 CK7</td><td>abcam</td><td>ab68459</td><td>HMEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용</td></tr><tr><td>토끼 안티 GATA3</td><td>abcam</td><td>ab199428</td><td>HMEC의 분화 마커를 확인하기 위한 면역형광 염색용</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Solarbio</td><td>IY0040</td><td>ROCK 억제제</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

유선은 유방의 기본 구조이며 생식에 필수적인 역할을 합니다. 유방암 및 기타 유방 관련 염증성 질환의 기원 세포인 인간 유방 상피 세포(HMECs)는 상당한 주목을 받고 있습니다. 그러나 연구 목적으로 1차 HMEC를 체외에서 분리하고 배양하는 것은 고도로 분화되고 각질화된 특성과 짧은 수명으로 인해 어려운 일이었습니다. 따라서 HMEC를 분리하고 배양하는 간단하고 효율적인 방법을 개발하는 것은 유방 생물학 및 유방 관련 질환 연구에 큰 과학적 가치가 있습니다. 이 연구에서는 Rho-associated kinase(ROCK) 억제제 Y-27632가 함유된 5% 소 태아 혈청-DMEM에서 초기 배양과 결합된 효소 혼합물로 소화하여 소량의 유방 조직에서 일차 HMEC를 성공적으로 분리한 후 무혈청 각질세포 배지에서 배양 팽창했습니다. 이 접근법은 상피 세포의 성장을 선택적으로 촉진하여 최적화된 세포 수율을 제공합니다. 이 방법의 단순성과 편리성으로 인해 실험실 및 임상 연구 모두에 적합하며, 이러한 중요한 연구 영역에 대한 귀중한 통찰력을 제공해야 합니다.

그림 1 은 절차의 개략도를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 효소, 즉 dispase, collagenase 및 trypsin의 조합이 사용됩니다. 이 조합은 그 아래의 섬유아세포층에서 상피 시트를 분리하고 이어서 트립신을 사용하여 유방 상피 세포를 현탁액으로 해리시키는 목적으로 사용됩니다. 또한, 상피 세포의 성장은 초기 배양 배지에 Y-27632를 첨가함으로써 효과적으로 촉진되었습니다. 결과적으로 이 방법은 많은 수의 HMEC를 생성하여 평균 10일 만에 패리시징 요구 사항을 충족합니다.
분리 후 세포 성장에서 Y-27632의 중요한 역할을 테스트하기 위해 갓 분리한 세포를 두 그룹으로 나눴습니다: 한 그룹은 10mM Y-27632를 포함하는 초기 배지로 도말되었습니다(그림 2A). 다른 그룹은 Y-27632를 대조군으로 추가하지 않고 초기 매체로 도말하였다(그림 2B). 2일간의 배양 후, 두 그룹의 세포를 표피 세포 배지로 전환했습니다(그림 1). 그림 2에서 셋째 날과 비교하여 Y-27632를 사용한 방법이 9일째에 HMEC의 수를 눈에 띄게 증가시켰음을 관찰할 수 있습니다. HMEC는 세포들 사이에 뚜렷한 경계와 강한 연결을 가진 섬을 닮은 응집력 있는 그룹을 형성했습니다. 이 세포는 주변 환경으로 바깥쪽으로 확장되었습니다. Y-27632로 도금된 세포(그림 2A)는 대조군의 세포(그림 2B)보다 훨씬 빠르게 성장했습니다. Y-27632가 HMEC 성장을 향상시킨다는 것을 확인하기 위해, 동결된 P0 세포를 10mM Y-27632를 첨가하거나 첨가하지 않고 해동 및 도말하고, 그림 3과 같이 다른 날에 통로 1(P1) 세포를 수집하였다. 세포는 cell count kit-8(CCK-8)을 사용하여 생존율과 증식을 분석했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, Y-27632 함유 배지로 처리된 세포의 성장률은 Y-27632가 없는 대조군의 세포보다 유의하게 높았다. 이러한 데이터를 종합하면 초기 배지에 Y-27632를 추가하면 분리 후 부착된 세포의 성장이 크게 향상됨을 알 수 있습니다.
이 방법으로 얻은 세포가 HMEC인지 확인하기 위해 두 가지 유방 상피 세포 마커인 CK7 및 GATA3에 대해 P0 HMEC의 면역형광 분석을 수행했습니다. 진단학적으로 중요한 사이토케라틴(cytokeratin)인 CK7은 정상 유방 상피의 선 분화(glandular differentiation)와 그 증식성 상피 과정(proliferative epithelial process)의 표지자이다13. 또한, Kouros-Mehr 등은 GATA3가 유방 상피 세포 내에서 전사 인자로 기능하고 완전히 발달된 유선에서 내강 상피 분화를 유지하는 데 관여한다고 보고했습니다14. 그림 3에서 볼 수 있듯이 배양 및 증식한 세포는 CK7(그림 4A)과 GATA3(그림 4B)를 모두 강하게 발현합니다. CK7 및 GATA3 양성 세포의 정량 분석은 세포의 98% 이상이 CK7과 GATA3를 모두 발현하는 것으로 나타났으며(그림 4C), 이는 섬유아세포와 같은 다른 유형의 세포에 대한 오염이 제한적임을 나타냅니다. 초기 배양(P0, 그림 2)에서 제한된 수의 섬유아세포 유사 세포(길쭉한 형태)를 가끔 관찰했지만, 이러한 세포가 통로 세포(P3, 그림 4D)에서 나타나는 경우는 거의 없습니다.
HMEC의 상피 특성이 여러 통과 후에도 유지될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 Y-27632가 있거나 없는 배양된 세포에서 유방 상피 세포 마커 CK7 및 GATA3의 qRT-PCR 분석을 수행했습니다(그림 5). CK7 및 GATA3의 발현 수준은 Y-27632가 있든 없든 P0 및 P3 세포 모두에서 유의하게 다르지 않았으며, 이는 이들의 표현형 및 분화 특성이 배양 확장 중에 시간이 지남에 따라 변하지 않았음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig01.jpg"> 그림 1: HMEC를 격리하고 배양하기 위한 프로토콜의 순서도. 처음에는 여성의 유방 조직 조각을 수술용 칼날로 잘라내고 효소의 조합으로 소화했습니다. 이어서, 수득된 세포 펠릿을 10mM Y-27632를 함유하는 초기 배양 배지에서 배양하였다. 2일 후, 초기 배양 배지를 상피 세포 배지로 교체했습니다. 유방 상피 세포는 표피 세포 배지에서 배양하여 ~8일 후에 만족스러운 커버리지를 달성했으며, 이제 passaging에 적합합니다. 필요한 경우, 일부 세포는 세포 동결 보존을 실시할 수 있습니다. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig02.jpg"> 그림 2: 최초 접종 후 얻은 HMEC의 이미지. 접종 후 2일 이내에 (A) 1차 HMEC는 Y-27632를 함유한 초기 배지에서 배양하였고 (B) 1차 HMEC는 Y-27632가 함유되지 않은 초기 배지에서 배양하였다. 48시간의 배양 기간 후, 혈청이 없는 각질세포 배양 배지를 두 그룹 모두에서 교체했습니다. 세포의 성장 상태를 이틀에 한 번씩 기록하기 위해 사진을 촬영했습니다. 대표적인 이미지 시리즈인 두 시리즈는 접종 후 3일째, 5일째, 9일째에 도립 현미경(100×)을 사용하여 촬영했습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig03.jpg"> 그림 3: Y-27632를 사용한 Passage 1 HMEC(P1)의 성장 향상. 동결된 P0 세포를 해동하고 Y-27632를 사용하거나 사용하지 않고 배양했습니다. 세포(P1)는 1일, 3일, 5일, 7일, 9일에 수집하고 CCK-8 키트를 사용하여 450nm에서 흡광도를 분석했습니다. 1일째에 Y-27632를 포함하는 초기 배지에서 부착 가능한 생존 세포의 수는 Y-27632가 없는 세포보다 훨씬 높았습니다. 또한, Y-27632로 처리된 세포의 성장 곡선은 더 가파른 증가를 보였다. **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. 약어: HMECs = human mammary epithelial cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig04.jpg"> 그림 4: HMEC 마커(P0)의 발현. HMEC에서 CK7 및 GATA3의 발현은 면역형광 염색으로 분석되었습니다. HMEC는 (A) CK7(적색) 및 (B) GATA3(적색)에 대해 염색되었습니다. DAPI(파란색)를 사용하여 핵을 염색했습니다. 이미지는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경(400×)을 사용하여 촬영했습니다. 척도 막대 = 20 μm. (C) 염색에서 양성 세포의 비율; (D) HMEC의 대표 이미지(P3). 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66638/66638fig05.jpg"> 그림 5: P0 및 P3에서 HMEC의 CK7 및 GATA3 발현. qRT-PCR을 사용하여 7일째에 P0 및 P3의 HMEC에서 (A) CK7의 발현, (B) P0 및 P3의 HMEC에서 GATA3, 7일째에 Y27632 유무에 관계없이 배양된 P1 HMEC의 (C) CK7, 7일째에 Y-27632 유무에 관계없이 배양된 P1 HMEC에서 (D) GATA3의 발현을 검출합니다. NSP &gt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66638/66638fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMEC)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야 모두를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...

우리의 연구는 난치성 육아종성 유방염의 치료 방법을 밝히는 데 중점을 둡니다. 중국 전통 의학 방법론과 서양 의학 방법론을 동시에 결합한 통합적 접근 방식을 활용하면 질병을 유발하는 복잡한 병원성 메커니즘과 그 합병증을 밝혀내고 이러한 문제를 완화하고 환자 예후를 개선하기 위해 노력하는 데 중점을 둘 것입니다. 당사의 연구는 소량의 유방 조직에서 주요 인간 유방 상피 세포(HMECs)를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 더 쉽고 시간을 절약하며 경제적인 프로토콜이라고 보고합니다.이 프로토콜은 실험실 및 임상 응용 분야를 위한 1차 HMEC를 신속하게 생산하는 데 적합합니다. 이 연구를 바탕으로 육아종성 유방염 유방 상피 세포 모델을 개발하여 병인에 대한 이해와 검증된 치료 전략을 심화하는 것을 목표로 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

호르몬 작용을 연구하기에 적합한 인간 유방 상피의 3D 배양 모델을 설명합니다.

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이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.

침또는 단층으로 시험관 내 성장을 위한 인간 타액 선에서 타액 상피 세포의 격리

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

배우세요 원발성 인간 유방 상피세포(HMECs)의 효율적인 분리 및 배양 방법을 소량 조직에서 적용하는 것입니다. 이 프로토콜은 육아종성 유방염 병리 연구와 치료 전략 개발에 활용됩니다.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

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