경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

우리는 폭발로 인한 충격파에 대한 노출로 인한 경미한 외상성 뇌 손상의 기저에 있는 복잡한 메커니즘을 이해하려고 합니다. 또한 이러한 증상을 완화하기 위한 방법도 연구하고 있습니다. 그것은 저강도 폭발로 인한 충격파로 인한 혈액 뇌 장벽 파괴의 초기 단계에 대한 포괄적 인 설명이었습니다.

구체적으로 말하자면, 노출 후 약 3시간 후에 갑자기 손상이 시작되며, 영향을 받은 병변은 발병 후 약 하루 동안 리모델링을 거칩니다. 이 방법을 사용하면 BBB의 분해를 보다 자세히 검사할 수 있으며, 폭발 시 사용할 수 있는 다양한 처리의 효과를 평가하기 위한 추가 지표를 제공할 수 있습니다. 먼저 동물을 폭발로 인한 충격파에 노출시키기 위한 충격 튜브를 준비합니다.

마취된 마우스를 쇼크 튜브의 출구 끝에서 5cm 떨어진 곳에 배치하여 몸체 축이 튜브의 축과 평행하지만 정렬되지 않도록 합니다. 그런 다음 최대 25킬로파스칼의 과압을 가진 단일 폭발 충격파를 동물의 머리에 전달합니다. Evans 블루 주사를 위해 식염수에 4% 중량 기준 Evans 블루 용액을 준비합니다.

용액을 소용돌이치고 사용할 때까지 어두운 곳에 보관하십시오. Evans 파란색 용액을 그램당 2.5마이크로리터의 용량으로 꼬리 정맥에 주입합니다. 마취된 마우스에 FITC-덱스트란 염료와 파라포름알데히드를 관류한 후 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 조심스럽게 뇌를 제거합니다.

하룻밤 동안 섭씨 4도에서 같은 고정액으로 뇌를 후접미사합니다. 다음 날에는 정착액을 PBS로 교체하십시오. 먼저 폭발 충격파 처리된 마우스에서 Evans blue와 FITC-dextran 염료를 주입한 고정된 뇌를 얻습니다.

각 웰에서 pH 7.4로 조정된 인산염 완충액에 200마이크로리터의 20%글리세롤이 함유된 24웰 플레이트를 준비합니다. 뇌 슬라이서를 사용하여 뇌를 각각 1mm 두께의 12개 조각으로 자릅니다. 각 슬라이스를 24웰 플레이트의 해당 웰로 옮기고 플레이트를 섭씨 4도에서 최소 2시간 동안 보관합니다.

그런 다음 용액을 50% 글리세롤 인산염 완충액으로 교체하고 다시 섭씨 4도에서 최소 2시간 동안 보관하십시오. 마지막으로 용액을 100% 글리세롤로 교체하십시오. 즉각적인 현미경 관찰을 위해 슬라이스를 실온에서 최소 2시간 동안 그대로 두십시오.

500마이크로리터의 글리세롤을 35mm 유리 바닥 접시 바닥에 추가합니다. 뇌 절편을 글리세롤 용액으로 옮기고 커버 유리로 표면을 덮습니다. 커버 유리의 가장자리에서 과도한 글리세롤을 제거합니다.

형광 현미경으로 슬라이스의 형광 강도를 측정합니다. 현미경 측정 후 슬라이스를 플레이트의 웰로 되돌립니다. 각 웰에 500마이크로리터의 인산염 완충액을 추가하고 24웰 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.

용액을 30% 글리세롤 인산염 완충액으로 교체하고 면역조직화학을 수행하기 전에 최소 2시간 동안 플레이트를 섭씨 4도에서 배양합니다.Evans 블루 라벨링은 폭발 충격파 노출 후 6시간 이내에 혈액-뇌 장벽 또는 BBB 파괴가 시작되어 최대 7일까지 지속됨을 보여주었습니다. 형광 핫스팟은 크기와 강도가 다양했으며, Evans 파란색 전용 핫스팟은 Evans 파란색 주입 중 BBB 파괴 및 FITC-덱스트란 주입 후 복구를 나타냅니다. 반응성 성상세포의 클러스터는 면역조직화학에 의해 확인된 BBB 분해 부위와 밀접한 관련이 있었습니다.

활성화된 미세아교세포와 아메보이드 미세아교세포는 폭발 충격파 노출 3일 후 반응성 성상세포와 함께 관찰되었습니다.